3. Úloha: Transdukce plazmidů do restrikčně-deficientního kmene S. aureus RN4220
Cílem úlohy bude přenos plazmidů kódujících geny rezistence do bezplazmidového recipientního kmene S. aureus RN4220 prostřednictvím bakteriofága cjxlB (Obr. 1). Tento způsob přenosu DNA z donorového do recipientního kmene se označuje jako transdukce (Obr. 2).
V úloze se pracuje s bakteriofágem cjxlB, který byl indukován z donorového kmene S. aureus Jevons B. Tento donorový kmen obsahuje dva plazmidy (pT181, pHOUMR-like). Plazmid pT181 kóduje gen pro rezistenci k tetracyklínu, plazmid pHOUMR-like gen pro rezistenci ke kadmiu a k p-laktamovým antibiotikům. Úkolem bude připravit kmen RN4220 obsahující plazmid pT181 a dále kmen RN4220 s plazmidem pHOUMR-like.
Obr. 1: Bakteriofág cbJevons B (elektronová mikroskopie)
Obr. 2: Schéma transdukce
Indukce fága
donorový kmen Jevons B
transdukce
recipientní kmen
RN4220 a) selekce na MPA s kadmiem
recipientní kmen RN4220
b) selekce na MPA s tetracvclinem
Materiál:
• Připravený fágový lyzát JB (cca 500ml), recipientní kmen RN4220.
• MPA, soft agar, roztoky tetracyklínu, kadmia, citrátu sodného a roztok CaCI2.
• Sterilní odměrný válec, kónické zkumavky (50ml), petriho misky, sada pipet, špičky, epinky, vodní třepací lázeň
1. Postup transdukce plazmidů:
1. Zaočkovaní recipientního kmene (20 u.1 zamražené kultury do 20 ml MPB) a inkubace 37 °C / 18 hod.
2. Stanovení titru recipientního kmene (pro výpočet frekvence transdukce).
3. Přidání roztoku CaCI2 ke kultuře recipientního kmene do výsledné koncentrace 2 mM.
4. Smíchání 1 ml kultury recipienta s 1 ml transdukujícího fágového lyzátu tak, že hodnota multiplicity infekce (poměr počtu fágových částic k počtu buněk) bude max. 1.
5. Inkubace transdukční směsi při 37 °C / 25 min. za stálého třepání.
6. Přidání roztoku citrátu sodného k transdukční směsi do výsledné koncentrace 15 mM, centrifugace 3000 rpm / 10 min. / 4-8 °C a resuspendace peletu v roztoku 17mM citrátu sodného (objem pro resuspendaci závisí na počtu misek, na které se bude transdukční směs vysévat a na množství směsi vyseté na jednu misku (ideálně 100-300 u.1)).
7. Vysetí transdukční směsi na misky s MPA obohaceným o citrát sodný (20 mM) a tetracyklín (5 u.g/ml) nebo kadmium (2,5.10"4M).
8. Inkubace misek při 37 °C/ 24-48 hod.
Úkol: Zjištění počtu kolonií transduktant na miskách a výpočet frekvence transdukce jako podíl počtu transduktant (CFU/ml - colony-forming units/1 ml) k počtu fágových částic v transdukujícím lyzátu (PFU/ml - plaque-forming units/1 ml).
Frekvence transdukce:
Parametry charakterizující transdukci plazmidů (Rosypal, 1981) Y= m pot = Ybca = aca-lp A = Y/p = ac cí-1
Y - teoretický počet transduktant na lml transdukční směsi
p - počet virionů (PFU) transdukujícího fága v lml transdukční směsi
A - frekvence transdukce = Y/p
m - koeficient počtu přenesených plazmidů na lml transdukční směsi p = 1. Teoreticky reprezentuje počet transduktant v transdukční směsi obsahující jeden virion, a - koeficient, jehož hodnota je vyjádřena vztahem: a = (log Y - log m)/log p
Yb - teoretický počet přenesených plazmidů na lml transdukční směsi, pokud platí p = b; b - počet buněk (CFU) recipientního kmene v lml transdukční směsi; c = p/b - vstupní poměr a - konstanta vyjadřující frekvenci transdukce, pokud platí c = 1
Stanovení titru bakterií nebo bakteriofágů
Stanovení titru bakterií nebo fágových částic vychází z ověřeného předpokladu, že z 1 životaschopné buňky/fágové částice vyrůstá 1 kolonie/l pláka. Bakteriální kulturu nebo fágový lyzát je třeba ředit, aby se kolonie/plaky po nárůstu nepřekrývali a šlo je spočítat. Titry se provádí na 3 miskách od každého ředění, aby se odhalila případná chyba v provedení, výsledné počty se zprůměrují. Výsledek se uvádí v CFU/ml (colony forming units) pro bakterie a v PFU/ml (plaque forming units) pro fágy.
2. Postup stanovení titru recipientního kmene (CFU/ml):
1. naředit kulturu 10"3az"6 dle očekávaného výsledku
• ředit desítkovou řadou: do 900 u.1 bujónu 100 u.1 kultury, promíchat, vyměnit špičku a novou špičkou přenést 100 u.1 kultury do dalších 900 u.1 bujónu atd.
• ředění do plastových epinek a plastovými špičkami nebo do sterilních wassermannek a skleněnými pipetami
2. do zkumavky s vytemperovaným 0,7% LBA na 50 °C přidat 100 u.118hod bakt. kultury v ředění
3. od jednoho ředění provést výsev na 3 misky
4. kultivace 18 hod / 37 °C, misky otočit dnem vzhůru
3. Postup stanovení titru fágového lyzátu (PFU/ml):
1. naředit fágový lyzát 10"3az"7 dle očekávaného výsledku
• ředit desítkovou řadou: do 900 u.1 bujónu 100 u.1 lyzátu, promíchat, vyměnit špičku a novou špičkou přenést 100 u.1 lyzátu do dalších 900 u.1 bujónu atd.
• ředění do plastových epinek a plastovými špičkami nebo do sterilních wassermannek a skleněnými pipetami
2. do zkumavky s vytemperovaným 0,7% LBA na 50 °C přidat 250 u.1 0,02 M CaCI2, 100 u.1 18hod bakt. kultury, 100 u.1 lyzátu v ředění
3. od jednoho ředění provést výsev na 3 misky
4.   kultivace 18 hod / 37 °C, misky otočit dnem vzhůru