Úloha: Izolace plazmidové DNA z transduktant a elektroforéza plazmidů
v agarózovém gelu
Plazmidy jsou autonomní kovalentně uzavřené kružnicové replikony tvořené dsDNA, které se stabilně
dědí v extrachromozomálním stavu a jsou pro buňku, na rozdíl od chromozomální DNA,
postradatelné. Nesou geny, které nejčastěji kódují rezistenci k antibiotikům. Počet kopií v buňce je
nepřímo úměrný velikosti plazmidu. K přípravě vektorů jsou používány plazmidové DNA o nižší
molekulové hmotnosti, neboť poskytují více kopií a snadnější manipulaci. V současnosti jsou
plazmidové vektory využívány ke klonování v E. coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida aj.
Pro izolaci plazmidové DNA z buněk se používá řada různých metod. Všechny musí obsahovat čtyři
základní kroky:
(a) Růst bakteriální kultury. Plazmidy se nejčastěji izolují z bakteriální kultury (rostoucí v médiu
obsahující příslušné antibiotikum), která byla inokulována jednou kolonií odpíchnutou z agarové
plotny. Většina plazmidových vektorů používaných v současné době (např. pUC řada) se replikuje
jako vícekopiové vektory a je u nich možné dosáhnout vysokého výtěžku při izolaci z kultury, která
rostla ve standardním LB médiu do logaritmické fáze růstu. Avšak vektory dřívější generace (např.
pBR322), které se nereplikují tak snadno, vyžadují selektivní amplifikaci několikahodinovou inkubací
částečně rostoucí kultury v médiu s chloramfenikolem, který inhibuje syntézu proteinů a tak
zabraňuje replikaci bakteriálního chromozómu, avšak replikace relaxovaných plazmidů pokračuje a
počet jejich kopií se zvyšuje.
(b) Izolace bakterií a jejich lyze. Bakterie jsou získány centrifugací a lyzovány jednou z mnoha metod
zahrnujících působení detergentů, organických rozpouštědel, alkalického pH nebo tepla. Volba jedné
z těchto metod závisí na velikosti plazmidu, bakteriálním kmeni a metodě, která bude následně
použita pro purifikaci plazmidové DNA. Velké plazmidy (> 15 kb), které jsou citlivé na poškození, by
měly být izolovány metodou minimalizující působení fyzikálních sil (lyze dodecylsulfátem sodným).
Pro malé plazmidy je možné použít více metod.
(c) Oddělení plazmidové DNA od ostatních vysoko a nízkomolekulárních komponent. Po přidání EDTA
a v některých případech lyzačních enzymů jsou buňky vystaveny působení detergentu a lyzovány
varem nebo alkalicky. To způsobí denaturaci chromozomální DNA, která je obvykle již ve formě
lineárních fragmentů a během renaturace se spojí se zbytky lyzovaných buněk a rychle klesá při
centrifugaci na dno zkumavky. Naproti tomu vlákna plazmidové DNA, tvořená kovalentně uzavřenými
molekulami se při denaturaci nerozcházejí, protože jsou v důsledku nadšrubovicové struktury
vzájemně propletená a mohou na rozdíl od lineárních fragmentů rychle renaturovat. Lyze varem není
doporučována při izolaci z kmenů produkujících endonukleázu A. Endonukleáza A není varem
kompletně inaktivována a plazmidová DNA může být degradována během následných inkubací za
přítomnosti Mg2+
. Tomuto problému lze předejít zařazením extrakce s fenol-chloroformem.
(d) Purifikace plazmidové DNA a stanovení koncentrace a čistoty. Proteiny odstraňujeme extrakcí
směsí fenol-chloroform. Precipitaci DNA provádíme 96 % ethanolem po přidání jednomocných iontů.
Odstranění RNA provádíme působením pankreatickou RNázou. Vysoce čisté kovalentně uzavřené
kružnicové DNA je možné získat po centrifugaci v gradientu CsCl-ethidium bromid. Z dalčích metod je
možné použít pro purifikaci plazmidové DNA precipitaci polyetylén glykolem, chromatografii a
komerční metody využívající adsorpci na silikagelovou kolonku.
Obecně během izolačních postupů je třeba dodržovat následující zásady:
Správně volit iontovou sílu extrakčního a purifikačního roztoku a udržovat ji v průběhu celého
experimentu.
Udržovat optimální hodnotu pH prostředí (většinou neutrální, tj. pH 7,0 až 7,5). Výrazně vyšší nebo
nižší hodnoty pH způsobují denaturaci DNA.
Zabránit působení nukleáz, tj. enzymů, které degradují nukleové kyseliny:
To lze docílit:
(a) prováděním izolace při nízkých teplotách
(b) přidáním inhibitorů nukleáz (např. EDTA, citronan sodný aj.)
(c) zabráněním exogenní kontaminace mikroflórou, tzn. pracovat se sterilním materiálem
I. Izolace plazmidové DNA
Kit je určen pro izolaci plazmidové DNA metodou založenou na alkalické lyzi u E. coli a s níže
uvedenou modifikaci u druhu S. aureus.
Postup:
1. den
1. Naočkovat stafylokokovou bakteriální kulturu s příslušným plazmidem, inkubovat 18h/37 °C
ve 20 ml MPB.
2. den
Pracujeme v laminárním boxu, sterilně
2. Centrifugovat cca 7 ml bakteriální kultury při 4500 rpm/15 min.
3. Odstranit supernatant, promýt v 5 ml PBS, resuspendovat pelet.
4. Centrifugovat při 4500 rpm/15 min., odstranit veškerý supernatant.
5. Připravit lyzační směs: 235 μl suspenzní pufr (součást kitu: Roche roztok č. 1, Macherey-Nagel
roztok A1), 15 μl lyzostafinu.
6. Pelet důkladně resuspendovat v předem připravené lyzační směsi (250 μl), přepipetovat do
Eppendorfovy mikrozkumavky a inkubovat při 37 °C do lyze buněk (projasnění, zvýšení
viskozity) cca 30 min. – 2 h.
Pracujeme na stole podle návodu výrobce kitu
7. Přidat 250 μl lyzačního pufru (Roche roztok č. 2, Macherey-Nagel roztok A2), promíchat
pomalým převracením zkumavky, inkubovat 5 min/pokojová teplota.
8. Přidat 250 μl (roztok č. 3, Roche) nebo 300 μl (roztok A3, Macherey-Nagel) vazebného pufru.
U kitu Roche inkubovat na ledu 5 min a roztok č. 3 předem vychladit. Zkumavku opatrně
promíchat, abychom dosáhli co nejvyšší výtěžek plazmidové DNA bez chromozomální DNA.
9. Centrifugovat 10 min při max. otáčkách.
Materiál:
• 18-ti hodinové bakteriální kultury (donorový kmen Jevons B, transduktanty)
• Komerční kity pro izolaci plazmidové DNA (pro PCR, klonování, sekvenování, in vitro transkripce) :
- High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche) nebo NucleoSpin Plasmid (Macherey-Nagel)
• Plastové špičky, pipety, mikrozkumavky, PBS, lyzostafin, kónické 15 ml zkumavky.
• SERVA agaróza, elektroforetická vana a příslušenství, velikostní marker.
10. Supernatant přenést na filtr kolonky umístěné do sběrné zkumavky. Navázání DNA na filtr
centrifugací max. rpm/1 min.
11. Promývat DNA podle doporučení výrobce kitu.
Roche: 500 μl roztok č. 4, centrifugovat při max. rpm/1 min; 700 μl roztok č. 5, centrifugovat
při max. rpm/1 min (dvakrát po sobě, odstranění veškerého roztoku)
Macherey-Nagel: 450 μl pufru AQ, centrifugovat při max. rpm/3 min (odstranění veškerého
roztoku).
12. Eluovat DNA. Opatrně odstranit sběrnou zkumavku a umístit kolonku do sterilní
mikrozkumavky pro uchování DNA.
Roche: napipetovat na střed filtru 50-100 μl elučního pufru, centrifugovat při max. rpm/1
min, pro vyšší výtěžek eluční pufr zahřát na 60 °C a nechat stát 10 min. při lab. teplotě.
Macherey-Nagel: napipetovat na střed foltru 50 μl elučního pufru AE, inkubovat 1 min. při
laboratorní teplotě, centrifugovat při max. rpm/1 min.
13. Stanovit čistotu a koncentraci DNA.
14. DNA uchovávat v mikrozkumavkách při -20 °C.
II. Elektroforéza (ELFO) v agarózovém gelu
Fragmenty nukleových kyselin lze dle jejich velikosti rozdělit elektroforézou (Obr. 1). Elektroforéza
využívá rozdílné pohyblivosti jednotlivých fragmentů danou právě jejich rozdílnou velikostí. Nukleová
kyselina nese díky záporně nabitým fosfátům záporný náboj, a proto se v elektrickém poli pohybuje
od záporného pólu (katody) ke kladnému (anodě).
ELFO je jedna ze separačních technik využívaná při izolaci a analýze nukleových kyselin. Principem
ELFO separace je pohyb nabitých molekul v elektrickém poli. Hlavním nositelem náboje nukleových
kyselin jsou negativně nabité fosfátové skupiny, a proto se nukleové kyseliny v elektrickém poli
pohybují k opačně nabité elektrodě - anodě. Rychlost pohybu molekul DNA v gelu (elektroforetická
pohyblivost) je nepřímo úměrná logaritmu jejich velikosti. Konvenční elektroforézou v agarózovém
gelu lze separovat molekuly nukleových kyselin o velikosti od 100 bp do cca 50 kb. Gely o nižší
hustotě (0,7-1,2 % agaróza) jsou používány k separaci velkých fragmentů (tisíce bází), gely o vyšší
hustotě (1,5-3 % agaróza) jsou používány k separaci malých fragmentů (stovky až desítky bazí).
Standardně se používá napětí 5 - 8 V/cm.
Molekuly nukleových kyselin v gelu je nutné vizualizovat barvením. Nejčastěji je používán
etidiumbromid, který se vmezeřuje mezi sousední páry bází v DNA (resp. RNA) a vytváří s nimi
komplex, který po osvětlení UV světlem červeně fluoreskuje.
Obr. 1: Schématické znázornění rozdělení DNA pomocí metody ELFO
Postup:
1. Navážit potřebné množství (podle požadované hustoty gelu) agarózy SERVA do nádoby o
vhodném objemu
• použité sklo musí být čisté, nesmí obsahovat zbytky mycího prostředku
2. Přidat potřebné množství 1xTAE pufru
• nejlépe použít pufr ze stejné várky ředění jako bude v ELFO vaně, aby byl zajištěn
shodný obsah iontů a tím stejnoměrné vedení elektrického napětí během ELFO
• 1xTAE se připravuje ředěním ze zásobního 50x koncentrovaného roztoku TAE.
• Potřebný objem přidávaného 1xTAE pufru zjistíme následujícím výpočtem:
V = šířka gelu x délka gelu x výška gelu (vždy 0,5 cm)
3.Agarózu rozpuštěnou v 1xTAE pufru rozvařujeme opatrně v mikrovlnné troubě (1 – 3 min.
podle výkonu zvoleného spotřebiče)
• agarózový gel opatrně promícháme (pozor na utajený var)
• nechat vytemperovat na 55 °C
• nalít do připravené formy, která je vyvážená pomocí vodováhy do roviny
4. 1xTAE pufr v ELFO vanách je nutno vyměňovat po cca 4 cyklech běžné délky (1-2 h) nebo
po každém dlouhém cyklu (3 h a více)
5. Nanášení vzorků:
- k vzorku, který chceme nanášet na připravený gel přidáme malé množství nanášecícho
pufru, na gel nanášíme cca 10µl vzorku s nanášecím pufrem, nezapomínáme na pozitivní a
negativní kontroly a velikostní standard.
- optimální velikost elektrického napětí při elektroforéze se udává jako 5-8 V/cm
6. Gel barvíme cca 30 min v lázni s ethidiumbromidem o konc. 1 µg/ml (zás. roztok 10 mg/ml)
tj. 60 µl EtBr do 600 ml 1xTAE.
7. Nabarvený gel opláchnout v destilované vodě. Focení gelu.
9. Veškerou práci s EtBr je nutno provádět v NITRILOVÝCH RUKAVICÍCH!!! Pokud dojde ke
kontaminaci EtBr, je nutné tuto plochu ošetřit dekontaminačním roztokem.
Obr. 2: Výsledky izolace plazmidové DNA z transduktant
A: selekce transduktant na tetracykllinu B: selekce transduktant na kadmiu
M – velikostní standard (DNA Marker III); JB – donorový kmen Jevons B; 1-5 – transduktanty selektované na
tetracyklinu (plazmid 4,4 kbp), 6-10 – transduktanty selektované na kadmiu (plazmid 28 kbp)