Úloha: Izolace RNA fenol-chloroformem
• 3 ml bakteriální kultury centrifugovat 10 000 xg/3 min.
• pelet resuspendovat v 800 u.1 lyzačního roztoku (na 1 litr deionizované vody: octan sodný 2,7 g, SDS 5 g, EDTA 0,34 g, pH 5,5)
• přidat skleněné kuličky (0,8 g, 425 - 600 um v průměru)
• vortexovat 2 - 3 min. při 2 000 ot.
• centrifugace 10000xg/3 min.
• supernatant (500 u.1) přemístěn do čerstvých 1,5 ml mikrozkumavek
• supernatant smíchat s 500 u.1 nasyceného fenolu (pH 5,5) a inkubovat 5 min. / 68°C za pravidelného míchání
• centrifugace 10 000 x g / 3 min.
• vodnou fázi (450 u.1) přemístit do čerstvých 1,5 u.1 mikrozkumavek a smíchat s chloroformem (450 u.1)
• centrifugace 10 000 x g / 3 min.
• vodnou fázi (400 u.1) přemístit do čerstvých 1,5 u.1 mikrozkumavek a smíchat se 100 % etanolem (800 u.1) a 3 M octanem sodným (1/10 objemu)
• centrifugace 10 000 x g 10 min.
• pelet promýt 70 % ledovým etanolem a sušit ve vakuu
• suchou RNA resuspendovat v 5,5 u.1 dH20
• každý vzorek smíchat s 19,5 u.1 RNA denaturační směsi (50 u.110 x MOPS [10 x 3-N-morpholino propanesulfonic acid: 0,2 M MOPS, 50 mM octan sodný a 10 mM EDTA], 250 u.1 formamid, 90 u.1 formaldehyd; pH 7)
• veškeré skleněné pomůcky ošetřit diethyl pyrokarbonátem (DEPC) k inaktivaci RNázové aktivity
• izolovanou RNA analyzovat na 1,5 % agarozo/formaldehydovém gelu (140 V 20 - 40 min.)
• nanášecí (loading) pufr: 1 x MOPS pufr