Úloha: Izolace bakteriální RNA
Stejně jako u izolace bakteriální DNA, také bakteriální RNA se purifikuje a izoluje několika možnými způsoby. Mohou se používat speciální komerčně dostupné kity s kolonkami, kde jejich matrix na sebe naváže RNA z roztoku a RNA je postupně purifikována na kolonce. Dále se používá metoda založená na izolaci pomocí fenol-chloroformem nebo řada komerčně dostupných produktů např. velmi rozšířená izolace TRIzolem nebo RNazolem.
Při práci s RNA je nutné dodržovat několik zásad, protože RNA je velice náchylná na působení RNáz z prostředí. Striktně pracujeme v rukavicích, používáme sterilní špičky s filtrem, pipety určené pro práci s RNA, speciálně ošetřenou vodu (tzv. DEPC vody, které neobsahují RNázy) a ideálně pracujeme v části laboratoře, která je vymezena pouze pro práci s RNA.
Převážná část bakteriální RNA je tvořena dvěma typy ribozomální RNA (16S rRNA a 23S rRNA) a mRNA. Správně izolovaná totální bakteriální RNA tvoří na elektroforetickém gelu dva celistvé kroužky (horní 23S a dolní 16S rRNA) (viz obr.).
Izolace celkové RNA TRIzolem
Níže uvedený postup popisuje izolaci celkové bakteriální RNA pomocí komerčně dostupného TRIzolu. Kit je možné používat pro gram-pozitivní a gram-negativní bakterie.
Obr. (a) celková bakteriální 16S a 23S rRNA, (b) purifikované podjednotky bakteriální RNA
, ' , (b) podjednotky RNA celková -
RNA 23S 16S
Bakteriální buňky jsou v prvním kroku ošetřeny Max Bacterial Enhancement Reagent a inkubovány při vysoké teplotě. V dalším kroku je přidán k roztoku TRIzol, který rozruší bakteriální komponenty a zároveň udržuje integritu RNA. Po přidání chloroformu a následné centrifugaci dojde k oddělení vodné fáze s obsahem RNA a organické fáze, která obsahuje buněčné zbytky. RNA je z vodné fáze precipitována izopropanolem. Následnou centrifugaci získaný pelet RNA je rozpuštěn v DEPC vodě.
Seznam materiálu:
• Bakteriální kultura E. coli
• Komerční kit pro izolaci celkové bakteriální RNA:
_TRIzol® Max™ Bacterial RNA Isolation Kit; Kat, č.: 16096-040 (Ambion®)12_
1 Originální protokol viz stránky distributora kitu:
http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/trizolmax_man.pdf
2 Kit je optimalizovaný pro E. coli, kdy z 1,5 ml bakteriálních buněk získáme více než 20 u.g RNA. Je nutné optimalizovat množství bakteriálních buněk podle použitého vstupního materiálu.
• Roztoky, chemikálie, média: 20 ml MPB, DEPC voda, chloroform
• Plasty: špičky s filtrem, pipety pro práci s RNA
• Ostatní vybavení: laminární box pro práci s RNA, stolní centrifuga, mikrozkumavky
Postup3:
1.   Naočkovat bakteriální kulturu, inkubovat 18h/37 °C ve vhodném kultivačním médiu.
Pracujeme v laminárním boxu, sterilně a v prostorách určených pro práci s RNA
2. Přenést 1,5 ml bakteriální kultury (108 buněk) do sterilní mikrozkumavky.
3. Centrifugovat 6000 g/5 min/4 °C.
4. Během centrifugace předehřát na 95 °C 200 u.1 Max Bacterial Enhancement Reagent.
5. Získaný pelet resuspendovat v 200 u.1 Max Bacterial Enhancement Reagent.
6. Inkubovat 95 °C/4 min.
7. Přidat 1 ml TRIzolu, dobře promíchat. Inkubovat 5 min/laboratorní teplota.
8. Přidat 2 ml vychlazeného chloroformu a promíchat převracením zkumavky.
9. Inkubovat 2-3 min/laboratorní teplota.
10. Centrifugace 12 000 g/15 min/4 °C.
Pozn. Dojde k oddělení vodné bezbarvé fáze obsahující RNA a organické načervenalé fáze obsahující fenol a buněčné zbytky.
11. Přenést vodnou fázi obsahující RNA (cca 400 u.1) do čisté mikrozkumavky.
12. Přidat 500 ml na ledu vychlazeného izopropanolu a pomalu promíchat převracením zkumavky.
13. Inkubace 10 min/laboratorní teplota.
14. Centrifugace 15 000 g/10 min/4 °C. Opatrně odsát supernatant, RNA se jeví jako poloprůhledný gel na spodu zkumavky.
15. Resuspendovat pelet v 1 ml 75 % etanolu a dobře zvortexovat.
16. Centrifugovat 7 500 g/5 min/4 °C. Opatrně odstranit supernatant.
17. Pelet RNA sušit na vzduchu, nepoužívat sušení ve vakuové odparce.
18. Vysušenou RNA rozpustit v 50 ul DEPC vody a zahřát na 60 "C/10 min, pokud je třeba zvýšit rozpustnost RNA.
3Před vlastním experimentem je nutné vychladit rotor centrifugy a vychladit chemikálie.