MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE PROKARYOT - cvičení
podzim 2016
Konjugace, Transdukce
Ivana Mašlaňová
iva.maslanova@gmail.com
Konjugace
Postup konjugace
Transdukce
Bakteriofágem zprostředkovaný HGT.
Generalizovaná transdukce – defektní
fágová částice sbaluje náhodnou část
bakteriálního chromozomu.
Specializovaná transdukce – SaPI
Lyzogenní konverze – bakteriofág se
integruje do chromozomu hostitelského
kmene a poskytuje hostiteli nějakou „novou
vlastnost“ – gen virulence apod.
Úloha transdukcec
Indukce fága
transdukce
donorový kmen
Jevons B
recipientní kmen
RN4220
recipientní kmen
RN4220
a) selekce na MPA s kadmiem
koncentrace Cd: 2,5×10-4 M
b) selekce na MPA s tetracyclinem
koncentrace tetracyclinu: 5ug/ml
ϕJB
Materiál:
 Připravený fágový lyzát JB (cca 500ml), recipientní kmen RN4220.
 MPA, soft agar, roztoky tetracyklinu, kadmia, citrátu sodného a roztok CaCl2.
 Sterilní odměrný válec, kónické zkumavky (50ml), petriho misky, sada pipet, špičky, epinky,
vodní třepací lázeň
Donorový kmen Jevons B – v genomu dva různé plazmidy, tetracyclinový plazmid (pT181; 4,4
kb) a β-laktamázový plazmid s rezistencí ke kadmiu (28 kb)
Bakteriofág фJB – fág sérologické skupiny B, morfotyp B1, dlouhý, nekontraktilní bičík
Recipientní kmen – S. aureus RN4220, restrikčně-deficientní laboratorní kmen, citlivý k ATB,
bezplazmidový
Postup transdukce
1ml recipientní
kmen RN4220
1ml
transdukující
fág фJB
Inkubace 37°C/ 25 min.
+ CaCl2 do transdukční směsi
(1/10 celkového objemu)
+ 0,03M citrát sodný (1:1 k
celkového objemu)
Centrifugace 3000 rpm/10min./4°C.
Pelet resuspendovat v 0,017M citrátu sodném
a) misky s Cd
b) misky s tet
Úloha PFGE – štěpení bločků
Příprava a složení restrikční směsi
SmaI – aktivita při laboratorní teplotě
Složení restrikční směsi/ 1-2 bločky
Voda …………………………………68 μl
Restrikční pufr…………………..8 μl
Restriktáza SmaI (8U)………..0,8 μl
Celkový objem………….. ……..76,8 μl