Úloha: Purifikace fágových částic v gradientu CsCl
Ultracentrifugace je separační metoda používaná v molekulární biologii k identifikaci, izolaci,
purifikaci a charakterizaci biomakromolekul, buněčných organel, virů apod. Na rozdíl od klasické
nízkoobrátkové centrifugace se ultracentrifugací rozumí odstřeďování při vysokých otáčkách, tj., při
20 000 - 100 000 ot/min. Vysokému počtu otáček je přizpůsobena konstrukce ultracentrifugy; nutné
je intenzívní chlazení a snížení atm. tlaku v rotorovém prostoru. Rotory jsou vyrobeny z ušlechtilých
materiálů, centrifugační zkumavky jsou vyrobeny z hmot odolávajících vysokému přetížení a vzorek
ve zkumavce je hermeticky uzavřen. Nutné je přesné vyvážení protilehlých centrifugačních zkumavek
(přesnost hmotností se pohybuje řádově v jednotkách mg.)
Z hlediska účelu lze centrifugaci rozdělit na:
a) preparativní, kdy cílem je izolace nebo purifikace biomakromolekul.
b) analytická, kdy cílem je identifikace případně charakterizace dané částice (např. stanovení její
velikosti (mol. hmotnosti), sedimentačního koeficientu, vznášivé hustoty apod.).
V obou případech je možné podmínky centrifugace zvolit tak, aby dělení částic probíhalo buď v
závislosti na jejich velikosti, nebo v závislosti na jejich hustotě.
Pokud mají být navzájem odděleny částice lišící se navzájem svou velikostí (molekulární hmotností),
probíhá centrifugace většinou v tzv. sacharózových gradientech, tj. v roztocích sacharózy, jejichž
koncentrace u dna centrifugační zkumavky je vyšší než u hladiny.
Nejčastěji se používají lineární gradienty 5 - 20% sacharózy. Vzrůstající hustota roztoku a tím i jeho
viskozita eliminují odstředivé zrychlení působící na částice, jehož hodnota se směrem od osy otáčení
zvyšuje. Gradient tak zajišťuje konstatní rychlost sedimentace částic, podmiňuje jejich stabilitu a
snižuje difúzi usazených částic do okolí. K přípravě gradientů lze použít rovněž dalších látek, např.
D2O, ficoll aj.
Sacharózových gradientů se velmi často používá pro stanovení molekulárních hmotností DNA a
proteinů. V případě, že mají být vzájemně odděleny částice na základě své odlišné specifické hustoty,
používá se gradientů chloridu cesného (Obr. 1). Roztoky CsCl se vyznačují vysokou hustotou a při
centrifugaci samovolně vytvářejí koncentrační a tím i hustotní gradient. Gradient je určen počáteční
koncentrací CsCl a rychlostí otáčení. K ustálení gradientu dojde během několika hodin.
Biomakromolekuly, které se na počátku centrifugace promíchají s roztokem CsCl, se při centrifugaci
usadí ve vrstvě roztoku (gradientu), odpovídající jejich vznášivé hustotě (její hustota je poněkud
odlišná od specifické hustoty).
Detekce biomakromolekul po centrifugaci.
V případě preparativní ultracentrifugace lze částice detekovat vizuálně, jako opalescenční pruhy
uvnitř zkumavky. Tyto lze pak odebrat (např. injekční stříkačkou) a dále zpracovat. V případě
analytické centrifugace se obsah zkumavky po centrifugaci rozdělí na jednotlivé frakce (např.
vykapáním) a každá frakce se odděleně analyzuje z hlediska fyzikálních vlastností (tj. hustota,
absorbance, radioaktivita, index lomu apod.). Číslo frakce udává současně i její vzdálenost od povrchu
(dna) zkumavky a tím i od středu otáčení. Srovnání fyzikálních veličin jednotlivých frakcí umožní pak
identifikovat polohu částic v gradientu a blíže je charakterizovat.
Materiál:
• Zakoncentrované fágové částice druhu Staphylococcus aureus rozpuštěné přes noc ve
fágovém pufru (cca 10 ml).
• Polykarbonátové zkumavky o objemu 5 ml, sterilní injekční jehly, pipety, špičky.
• Připravené roztoky CsCl v SM pufru.
• Předchlazený rotor: SW 55 Ti, ultracentrifuga Beckman.
Obr. 1: Příprava preformovaného gradientu CsCl
Postup
1. Proteiny a zbytky bakteriální DNA a RNA lze odstranit ultracentrifugací v diskontinuálním gradientu
CsCl. Gradient připravíme opatrným podvrstvením roztoků CsCl v SM médiu o hustotě 1,45 g/ml (1
ml), 1,5 g/ml (1 ml), 1,7 g/ml (1 ml). Příprava roztoků a SM média viz tabulka. Začíná se nejřidším
roztokem a špička s roztokem s vyšší hustotou se umístí na dno zkumavky a opatrně se podvrství.
Pro gradient CsCl používáme 5 ml polykarbonátové zkumavky bez šroubovatelného uzávěru.
SM médium na 1l (složení):
5,8 g NaCl
2,0 g MgCl2
50 ml 1 M Tris-Cl pH 7,5
2. Na gradient naneseme cca 1 ml vzorku obsahujícího fágové částice, centrifugujeme při 12°C, 2,5 -
4 hodiny, 40 000 otáček (Ultracentrifuga Beckman, Rotor: SW 55 Ti). Před vlastní centrifugací je
nutné vyvážit zkumavky v kyvetkách s přesnosti na 0,01g a umístit kyvety označené čísli do
příslušných pozic v rotoru.
3. Vrstvu fágů (Obr. 2) odebereme pomocí injekční jehly, frakci obsahující fágové částice zachytíme
do připravené mikrozkumavky. Pracujeme v rukavicích.
A: Příprava roztoků CsCl (100 ml) v pufru SM B: Odběr frakcí po ultracentrifugaci v hustotním
gradientu:
Obr. 2: Purifikované fágové částice v gradientu CsCl
Pozn.: Pro další zpracování fágových částic je nutné odstranit CsCl dialýzou proti fágovému pufru.
Pufr několikrát vyměníme, aby došlo k úplnému odstranění CsCl.
zbytky bakteriálních buněk
purifikované fágové částice