Analýza exprese microRNA Doc. MUDr. Mgr. Marek Mráz, PhD Group leader CEITEC MU •11/16 Moderní metody analýzy genomu • • •LÉKAŘSKÁ FAKULTA MASARYKOVY UNIVERSITY •Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno •Centrum molekulární biologie a genové terapie • • • • • Lékařská fakulta MU FN Brno_modra_ctverec •1 •Nic si nepište…vše bude online • • •Další hodina příští týden • •2 qkrátké RNA molekuly • ~22 nukleotidů qkomplementární vazba k cílové mRNA qinhibují translaci a snižují stabilitu mRNA q • • • • • • • • microRNA (miRNA)‏ • • microRNA •DNA • •mRNA • •PROTEIN • •Lidské miRNA geny: cca 2000 c-elegans_esa memories_l • Stovky evolučně konzervovaných microRNA Obrázek1.png •Mraz et al., 2010 •3 •courtesy of F. Slack •4 •5 nrc1840-f1.jpg • • microRNA •DNA • •mRNA • •PROTEIN • •mRNA neznamená, že v buňce bude i protein • •Historicky vždy velká neshoda mezi daty z expresních čipů a expresí proteinů (Western Blot) •6 Specifika analýzy exprese microRNAs: ovelmi malé molekuly – 22nt – specifikum izolace, specifické značení i design sond omalé zastoupení ve vzorku – separace microRNA ov lidském genovu cca 2000 genů oněkteré mají velmi podobnou sekvenci – rozdíl 1nt opre-miR, pri-miR, mature-miR omálo se ví o jejich funkcích – obtížná interpretace výsledků ozatím málo zkušeností a standardizace o o o q qIzolace qMicroarrays qIdentifikace miRNA (cloning a Northern blot) qReal-Time PCR qNGS q o •7 •1/ Izolace a stabilita microRNA •Problémy: velikost 22nt, celkově cca 0,01% z celkové RNA •Izolace: •TRIzol/TriReagent •miRvana (Ambion) •PureLink (Invitrogen) •a další •Obohacení: •PAGE •FlashPAGE Fractionator (Ambion) •Mraz et al., 2009 •8 •Izolace: •TRIzol/TriReagent •miRvana (Ambion) •PureLink (Invitrogen) •a další •Mraz et al., 2009 •Izolace: TRIReagent/TRIzol •is the „gold standard“ (Mraz et al., 2009) •9 •Obohacení: •PAGE •FlashPAGE Fractionator (Ambion) f01551 f01193 f01325 f01180 •15min 20hours •10 •Stabilita microRNA : •Stabilita po izolaci •Stabilita v FFPE (formalin-fixed parafin-embedded tissue) • •Mraz et al., 2009 •RNA •cDNA •Bravo et al., 2007 •11 •Stabilita microRNA : •Stabilita v FFPE (formalin-fixed parafin-embedded tissue) •Jung et al., 2010 •12 Expression microarrays pro microRNAs: ovelmi malé molekuly – 22nt – specifikum izolace, specifické značení i design sond omalé zastoupení ve vzorku – separace microRNA ov lidském genovu cca 2000 genů – menší počet sond na čipu oněkteré mají velmi podobnou sekvenci – rozdíl 1nt opre-miR, pri-miR, mature-miR omálo se ví o jejich funkcích – obtížná interpretace výsledků ozatím málo zkušeností a standardizace •1. •2. •3. •Li and Ruan, 2009 •13 3/ Labeling – značení: qNení možný labeling pomocí značených polyT při reverzní transkripci qPřímé značení (direct labeling) – většinou nějaká fluorescenční barva qNepřímé značení (indirect labeling) – probíhá nějaká reverzní transkripce/PCR Přímé značení: Jednoduché, rychlé a „čím méně kroků tím méně vnesených chyb a variability“ 1/ Značení guaninu v microRNA Flurochromem vážícím se na guanin jsou označeny miRNA (Ulysis Alexa Flour 546/647) Všechny lidské miRNA obsahují guanin, ale v různém množství Nemožnost usuzovat na vzájemnou expresi různých miRNA (různý obsah guaninu) (Babak et al., 2004) 2/ Značení pomocí Poly (A) polymerázy Můžu se rozhodnout jak dlouhý bude poly(A) a tím ovlivnit sílu signálu (Shingara et al., 2005) •14 •4/ značení pomocí T4 ligasy •Krátký značený oligonukleotid •je připojen T4 ligásou k 3‘konci •Výhodou je přednostní vazba •na RNA o velikosti 18-30bp ->total RNA •(Thomson et al., 2004; Castoldi et al., 2007) • • •15 •Nepřímé značení: •Značen je produkt reverzní transkripce či PCR •Výhody: cDNA je pak stabilní a lze uchovat, Pre-amplifikace a tím snadnější detekce méně exprimovaných miRNA • •1/ značení revezního transkriptu miRNA •Reverzní transkripce pomocí náhodných 8-merů značených 2 biotiny (3‘-(N)8 – (A)12-biotin-(A)12-biotin-5‘ (Liu et al., 2004) •Reverzní transkripce pomocí náhodných neznačených 7-merů, následně označeny s pomocí terminální transferázy a biotin-dideoxy-UTP (Sun et al., 2004) •Nebezpečí chyb z nespecifické vazby primeru • •2/ značení produktu RT-PCR •Výhoda: snadná pre-amplifikace •Dva adaptory •fluorescenčně-značený primer (k adaptoru) •(Miska et al., 2004) •Nevýhoda: antisense strand přiromen při hybridizaci •Rešením je různá délka sense a antisense ->PAGE •(Baskerville, 2005) • • • • • •16 • • •3/ Microarrays/ Próby: •Problémy: krátké RNA, malé rozdíly v sekvenci, Tm •17 mosseb ppt horizontal modra •Tm – melting temperature určité próby •T – hybridizační teplota • •TmT ..........vyšší efektivita vazby miRNA • qJe třeba navrhnout próby tak,aby měly všechny podobnou Tm qTo se u „dlouhých“ mRNA řeší vhodným výběrem oblasti genu k němuž bude sonda komplementární nebo délkou sondy q navíc některé miRNA jsou téměr sekvenčně totožné • •18 •Baskerville and Bartel, 2005 •ÚPRAVA DÉLKY •Li and Ruan, 2009 •ÚPRAVA SÍLY VAZBY NUKLEOTIDŮ •LNA próby (Locked Nucleic Acid) •ribózový kruh je „uzamčen“ methylenovým můstkem mezi atomy 2´-O a 4´-C • • • • • • • • • •Použití LNA pro některé báze v próbě •19 •SÍLA VAZBY: •LNA vs DNA próba •Tm až 720C •(Castoldi et al., 2006) •20 •SPECIFITA VAZBY: LNA vs DNA próba •(Castoldi et al., 2006) •21 miRCURY LNA Array, Exiqon : 3 dny •22 •Co se nemusí podařit: •Nekvalitní RNA •Nepodaří se značení •Nepodaří se hybridizace •Nepodaří se promývání •Technická variabilita čipů je větší než ta biologická •Nepodaří se validace dat pomocí RT-PCR, atd CIT_course_Oct2005_Lisa_Page_016 •Práce s miRNA čipy je velmi obtížná. Všeobecně nižší míra standardizace. •Obtížná interpretace získaných dat z pohledu biologického smyslu např. deregulace několika miRNA (nádor vs. zdravá tkáň apod.) •23 •RT-PCR •TaqMan-based real-time PCR quantification of mature miRNAs •25 •RNA Seq Sanger vs NGS •‘Sanger sequencing’ has been the only DNA sequencing method for 30 years •…………….. •NGS has the ability to process millions of sequence reads in parallel rather than few at a time Next Generation Sequencing •Takes advantage of miniaturization to engage in massively parallel analysis –Essentially carrying out millions of sequencing reactions simultaneously in each of 10 million tiny wells •Sophisticated computer analysis of huge amounts of information allows “assembly" of a given sequence • 10 million tiny wells in a single machine, each of which Massive Parallel Seq workflow • 1) Library preparation •4) Data processing & analysis •A SAMPLE •2) Cluster generation on a flow cell •SE, PE reads, •50-250 bases •(miseq) •3) Sequencing & imaging •30 High Parallelism is Achieved in Polony Sequencing •Polony •Sanger •Polony sequencing refers to all commercial technologies except for Helicos. •Polony sequencing takes place using array of polonies, in which all amplicons of the same DNA fragment are clustered together on the same region of the array. These groups of amplicons were termed polonies, shortcut for polymerase colonies. •The degree of parallelism that can be achieved through Sanger sequencing is only a fraction of what can be achieved in polony sequencing •This is the trick • Dark downward diagonal • • •C • •A • •G • •T • •C • •A • •T • •C • •A • •C • •C • •T • •A • •G • •C • •G • •T • •A • • • • • • • • • • • • •5’ • •G • •T • •C • •A • •G • •T • •C • •A • •G • •T • •C • •A • •G • •T • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •3’ •5’ • • • • • First base incorporated •Cycle 1: Add sequencing reagents • Detect signal • Cleave terminator and dye •Cycle 2-n: Add sequencing reagents and repeat Sequencing by synthesis A •C •G A A A •T •T •T •T •C •C •G •G •G •G •G •C •T A •Emission •Excitation Purpose: Graphic support to explain Solexa technology. Details: There are 2 market unique features to the Solexa technology for genome analysis = template clusters (in the flow cell) and reversibly terminated, individually fluorescently labeled nucleotides for Sequencing by Synthesis. The steps for sequencing by synthesis supported by this slide are: Hybridize sequencing primer (complimentary to terminal adaptor) Add polymerase and all 4 dNTPs Each dNTP is individually fluoerscently labeled and is reversibly blocked at the 3’ hydroxyl The 3’ block ensures only a single base addition. Once the single base addition occurs the clusters can be excited by a laser and the color of the added base can be imaged and determined. For every cluster, in cycle 1, the first base is added turning the entire cluster the color of the base. In the example shown in this cartoon at “T” is added, turning this cluster “green”. Once the first base has been imaged and determined, the fluorescent label is cleaved and 3’ blocking group is removed, regenerating a 3’-OH and enabling extension. Add polymerase and all 4 dNTPs and single base extension will occur for the second base in the template (in this cartoon the 2^nd base is a “G”) The clusters can be excited by a laser and the color of the 2nd base is imaged and determined (in this cartoon the cluster color would be “blue”) Repeating this process allow us to step-wise determine the sequence of the original template. Conclusion: Explanation of technology behind sequencing by synthesis •47 Sequencing by Synthesis - Fluorescently labeled Nucleotides (Illumina) •Complementary strand elongation: DNA Polymerase • Solexa sequencing uses DNA polymerase for elongation of the complementary strand, in each cycle a single fluorescently labeled nucleotide is added. - Read length is limited by effectiveness of moiety cleavage and rmoval of FL labels video •https://www.youtube.com/watch?v=womKfikWlxM The general experimental procedure for RNA Transcriptom = sum of all RNA (mRNA, rRNA, tRNA and noncoding RNA) The general experimental procedure for miRNA The general experimental procedure for miRNA •52 •53 •ODPOČINEK • •courtesy of G. Calin • microRNA •DNA • •mRNA • •PROTEIN • •54 •courtesy of F. Slack •55 •microRNA exprese je schopná rozlišit původ nádoru •Lu et al. Nature 435: 834, 2005 •56 •57 •58 •59 •60 •courtesy of S. Hammond •courtesy of S. Hammond Chronická lymfatické leukémie qZ maturovaných B lymfocytů qNejčastější leukémie dospělých q qExtrémně variabilní prognóza qNejčastější aberace del13q14 – obsahuje 2 miRNA (miR-15a, miR-16) •Exprese miRNA asociuje s prognostickými subtypy CLL •Calin et al., 2005 •Fulci et al, 2007 •Zenz et al., 2009 •Stamatopoulos et al., 2009 •Mraz et al., 2009a, 2009b, 2012, 2014 •Mutované IgHV •Nemutované IgHV •Delece/mutace p53 •~ 20 miRNAs n =168 • Nižší hladiny miR-150 asociují s kratším celkovým přežitím a časem do první léčby •Mraz et al, Blood, 2014 •Jak identifikovat cíle miR-150 u CLL? •(HG-U133 Plus 2.0, Affymetrix) C:\Users\mm\Desktop\UCSD MAREK PROJECT\VYBER VZORKU-ROCHE STUDY\HODNOCENI ROCHE STUDY\quarters _divided by median.jpg •N=32 •N=32 C:\Users\mm\Desktop\UCSD MAREK PROJECT\MANUSCRIPT REVISION miR-150\FIRST EDITION\2013-527234-Kipps CORRECT VERSION\Mraz-Fig2.tiff •Mraz et al, Blood, 2014 Genové expresní čipy pro CLL s nízkou vs vysokou hladinou miR-150 q58 rozdílně exprimovaných genů q2 geny s evolučně konzervovanými vazebnými místy pro miR-150– GAB1 a FOXP1 • •GAB1 je adaptorová molekula, která je nutná k vazbě PI3K na membránu a amplifikaci BCR signalizace (Ingham et al. JBC, 2001). • • • •FOXP1 je transkripční faktor důležitý pro vývoj B lymfocytů a asociovaný s ABC DLBCL a progresí B buněčných lymfomů (Hu et al. Nat Immunol, 2006). Adaptivní imunity- centrální dráha BCR •B cell receptor (BCR) •Vyšší hladiny GAB1 nebo FOXP1 znamenaní silnější BCR signalizaci C:\Users\mm\Desktop\UCSD MAREK PROJECT\MANUSCRIPT REVISION miR-150\FIRST EDITION\2013-527234-Kipps CORRECT VERSION\Mraz-Fig5.tif •Mraz et al, Blood, 2014 Layout gab fox.jpg GAB1 •P •P •P •P •SHIP •SHP1 •FcγRIIB •PIRB •CD22 •LYN •SYK •BTK •BLNK •PLCγ2 •PI3K •SHP1 •„Negative regulators of BCR“ •CD19 •P •P •P •RAS •P38 MAPK •NFκB •AKT •ERK/ ↑Ca2+ •FOXP1 •miR-150 •Pro-proliferative and anti-apoptotic pathways activated by BCR •„Positive regulators of BCR“ •Mraz et al, Blood, 2014 •Popsali jsme první příklad regulace BCR signalizace prostřednictvím microRNA •Kater and Eldering, BLOOD, 3 JULY 2014 x VOLUME 124, NUMBER 1 •First description of miRNAs role in BCR signalling…not only in CLL • •miRNAs přispívají k regulaci mnoha drah • • • • miR_terapie • •potentially usefull as therapeutic targets •74 •Díky za pozornost •Marek.Mraz@email.cz •Hledáme nadšené studenty (Bc, Mgr, PhD) a post-doky • •CEITEC MU •Mraz Lab: Katerina Cerna, Katerina Musilova, Vasek Seda, •Gabriela Pavlasova, Veronika Svobodova, Sonali Sharma, Jan Oppelt •