Moderní metody analýzy genomu: aplikace technologie NGS Mgr. Martin Trbušek, Ph.D. D:\Disk Google\FN_disk D\Loga\FN Brno_modra_obdelnik_maly.JPG Interní hematologická a onkologická klinika, FN Brno Centrum molekulární biologie a genové terapie Obsah •Obecné využití NGS •Aplikace v různých biologických oborech •Využití v biomedicíně a onkologii •Hematoonkologie •Aplikace při studiu CLL a využití na našem pracovišti • • Stratton et al., Nature 2009 Vývoj sekvenování •SNV = single nucleotide variants (mutace/SNP) •CNV = copy number variation (inzerce/delece) •strukturní aberace (translokace/inverze) •genová exprese (mRNA) •epigenetika (metylované oblasti) •interakce DNA-protein Obecné využití NGS Simon et al., Nat Rev Drug Discovery 2013 Přístupy NGS: oblast analýz Genom Exom Amplikon Transkriptom Celogenomové sekvenování (WGS) Sekvenace celé chromozomální DNA ® úplná informace o genomu (pokryty i promotorové a regulační sekvence) • 1.De novo asembly - využívá překryvů sekvencí, předpokladem dostatečné pokrytí (>10x) 2.Resekvenování - mapování na referenční sekvenci Celogenomové sekv. od ~ $10.000 (výzkum od $4.000) Využívá se nejčastěji k identifikaci nových nebo vzácných mutací, chromozomálních přestaveb, pro nalezení nových potenciálně terapeutických cílů Exomové sekvenování •WES = whole exome sequencing •Sekvenování jen kódujících oblastí = exom (asi 1 % genomu) •Efektivnějsí: rychlost, cena, vyšší pokrytí WES a rekurentní „driver“ mutace u CLL SF3B1, ATM, TP53, NOTCH1, POT1, regulace c-MYC Landau et al., Nature 2015 Cílené sekvenování •Targeted sequencing •Identifikace vzácnějších variant pod detekčním limitem Sangera (až 1% při vysokém pokrytí) •Výhodné pro sledování klonální evoluce nádorů •Výhody: rychlost, cena, méně prostoru pro skladování dat •Pro sekvenování velkého počtu vzorků (screening) nebo validaci genetických variant v populaci Count Coverage Frequency Gene_function RefGene Exon_number cDNA Codon 1752 1752 100 exonic ATM exon40 c.5948A>G p.N1983S 2261 2452 92,21 exonic ATM exon22 c.3161C>G p.P1054R 690 2962 23,3 exonic ATM exon50 c.7311C>A p.Y2437X 100 1203 8,31 exonic ATM exon24 c.3433_3435del p.1145_1145del 74 1433 5,16 exonic ATM exon30 c.4578C>T p.P1526P 46 1281 3,59 exonic ATM exon43 c.6258T>A p.Y2086X 243 8231 2,95 splicing ATM exon19 c.2921+1G>A p.P962Q 19 699 2,72 exonic ATM exon25 c.3705_3709del p.P1235fs 25 1087 2,3 exonic ATM exon5 c.480delT p.S160fs 24 1046 2,29 exonic ATM exon5 c.483G>C p.Q161H 67 3357 2 exonic ATM exon26 c.3837G>A p.W1279X 73 5626 1,3 exonic ATM exon26 c.3952_3960del p.1318_1320del 64 5151 1,24 exonic ATM exon49 c.7181C>T p.S2394L 11 904 1,22 exonic ATM exon63 c.9022C>T p.R3008C 42 3514 1,2 exonic ATM exon10 c.1402_1403del p.K468fs Mutační analýza genu ATM pomocí NGS Tři způsoby přípravy knihovny 1.multiplex PCR: AmpliSeq (Life Tech.) až 6144 párů primerů 2.single-plex PCR: Microdroplet PCR (RainDance Tech.), Access Array System (Fluidigm) 3.targeted capture (cílený „záchyt“ sondami) s následnou multiplex PCR: TrueSeq Amplicon (Illumina), HaloPlex (Agilent Tech.), SeqCap EZ technology (Roche NimbleGen) 1. AmpliSeq-, 10 ng vstupní DNA Klinické využití •Nejvhodnější „targeted capture“ •Komerční kity: •diagnostické kity (panely genů různých onemocnění) •nádorové panely (záchyt hereditárních nádorových onemocnění) •panely genů dle přání zákazníka • Klinickému využití nejlépe vyhovují techniky targeted capture, jelikož jsou vhodné pro sekvenování stovek genů v malém, ale i větším počtu vzorků. Příprava knihovny zabere pouze jeden den. Senzitivita a specificita je srovnatelná. Transkriptom = soubor všech molekul RNA (mRNA, rRNA, tRNA a noncoding RNA) Sekvenování transkriptomu (RNA seq) Wang 2009 Aberantní exprese u CLL lymfocytů (RNA seq) Ferreira et al., Genome Res 2014 Distribuce genů s expresí odlišnou u CLL lymfocytů ve srovnání se zdravými B-buňkami Identifikace mutací SF3B1: synergie různých přístupů Quesada et al., Nat Genet 2011 •Detekce somatických mutací, mezigenových fúzí a alternativních sestřihových variant •Studium ncRNA: regulace proliferace, diferenciace a apoptózy, regulace genové exprese (miRNA) •Na rozdíl od čipových technologií není limitována předchozí znalostí genomu, dynamickým rozlišením nebo zkříženou (cross) hybridizací • • RNA seq - možnosti NGS a epigenetika Metylace DNA: 80% C, umlčení transkripce genů Bisulfitová konverze + NGS: •konverze C ® U, Met-C se nemění •přesná identifikace jednotlivých metylovaných bazí Konvertovany C na U je detekovan v sekvenci jako T, zatímco metylovany C se nemeni a je detekovan jako C. Chromatinová imunoprecipitace (ChIP-Seq) •Sledování interakcí mezi proteiny, DNA a RNA ® vazebná místa pro TF, histony, a další proteiny •Regulace genové exprese, epigenetické modifikace chromatinu Mundade et al., Cell Cyle 2014 Kombinace chromatinové imunoprecipitace a paralelního sekvenování. Studium druhové diverzity (genotypizace): •fylogeneze živočišných druhů (Ellegren et al., 2012) •identifikace nových virových variant (Kapgate et al., 2015) •šlechtění plodin v zemědělství (Fridman et al., 2012) • Mezioborové využití NGS Ellegren-druhova diverzita lejsku Metagenomika: studium mikrobiálního složení v různých typech prostředí (střevní mikroflóra, zubní plak, půda, korálové útesy, mořské dno) •bez potřeby kultivace •identifikace patogenů, virulence, rezistence, atd. Padmanabhan et al., J Microbio Methods 2013 Forenzní genetika: Analýza stop z místa činu Polymorfní místa v genomu Yang 2014 Aplikace forenzni genetiky: DNA databáze, identifikace osob/druhů (STR=single tandem repeats, miRNA, SNP/zivocisne, bakterialni, roslinne druhy na miste cinu), příbuzenské vztahy, odlišení jednovaječných dvojčat, … Využití v medicíně •molekulární diagnostika dědičných chorob a infekčních onemocněních •prenatální diagnostika (neinvazivní, z fetální DNA v mateřské plazmě) •farmakogenomika (identifikace nových terapeutických cílů, studium rezistence) •Onkologie; bezbřehé možnosti! Základní aplikace v onkologii •molekulární diagnostika nádorů •analýza prognostických markerů •objasnění mechanizmů kancerogeneze (mutační profily nádorů) •hledání nových rekurentně mutovaných genů (nezachytitelných standardními metodami) rekurentní mutace-identické mutace detekované ve velkém počtu vzorků opakovaně Přínos NGS v onkologii •RNA seq: objev nových fúzí genů ® mohou být využity jako dg markery a potenciální terapeutické cíle (tkáňově specifické nebo univerzální) •translokace EML4-ALK u nemalobuněčného karcinomu plic •translokace TMPRSS2-ERG u karcinomu prostaty •Využití při sledování minimální zbytkové nemoci (Dong and Wang, Frontiers in Medicine 2012) •Identifikace germinálních mutací (WES): •familiární nádory pankreatu (PALB2) •dědičný feochromocytom (MAX) •familiární melanom (MITF) • •Cílené sekvenování: •detekce mutací v 21 genech včetně BRCA 1 a 2 asociovaných s hereditárními nádory mléčné žlázy a vaječníku (neodhalitelné Sangerem a MLPA) (Walsh 2010) Vyvinuta nová metoda pro detekci mutací BRCA 1,2: amplifikace dlouhých úseků pomocí PCR + NGS sekvenace (Ozcelik, J Mol Diagn 2012) NGS ® personalizovaná léčba Guan et al., Chin J Cancer 2012 Integrace omických dat: U daného pacienta je osekvenován nádorový a zdravý genom. Genetická informace je analyzována a interpretována multidisciplinárními experty. Pacientovi je navržena léčba „šitá na míru“. Z analýzy profi tuje také pacientova rodina, protože se zjistí i hereditární riziko vzniku nádorového onemocnění a mohou být provedena příslušná opatření International Cancer Genome Consortium (ICGC): Cancer GenomeProjekt – charakterizace genomických, transkriptomických a epigenomických změn u 50 nejčastějších nádorových onemocnění Využití NGS v onkologické praxi National Cancer Institute (NCI): projekt vytvoření atlasu nádorových genů – The Cancer Genom Atlas (TCGA) za účelem zlepšit nádorovou prevenci, včasnou detekci a léčbu Skrínink nových léků na panelu 60 buněčných linií Hematoonkologie První celogenomový sekvenační projekt 2008: porovnání nádorového a normálního vzorku téhož pacienta s AML ® identifikace dvou známých a osmi nových somatických mutací (Ley et al., Nature 2008) Studium klonální evoluce AML pomocí WGS: identifikace somatických mutací objevujících se při relapsu (pravděpodobně díky cytotoxické terapii) Ding et al.,Nature 2012 Využití NGS při výzkumu CLL Objev nových rekurentně mutovaných genů (WGS, WES) – SF3B1, NOTCH1, BIRC3, MYD88 (Puente et al., Nature 2012, Quesada et al., Nature 2012) Wang et al., New Eng J Med 2011 Nové geny - rostoucí frekvence od dg k progresi Klonální architektura CLL – časné klonální (del13q, tri12, MYD88) a pozdější subklonální aberace (TP53, SF3B1) ® selekce léčbou a urychlení progrese Landau et al., Cell 2013 Landau et al., Cell 2013 Model vývoje CLL 1. Passenger events: prior transformation, klonalni, mohou byt zakladajici klon leukemie, hromadeni mutaci s vekem a mut-IGHV 2. Driver events: klonalni zakladajici mutace, rekurentni mezi pacienty (MYDD88, del 13, tri 12) – tzv. CLL drivers 3. Subklonalni driver mutace se mhou stat dominatnim klonem Klinický dopad TP53 subklonů – ultra-deep sequencing (median alel. frekvence 2%) ® špatné přežití, evoluce klonu při relapsu a účast na vzniku chemorezistence Rossi et al., Blood 2014 Deep seq. – pokrytí min. 100x, detekce mutací v méně než 1%, hlavně pro studium klonální evoluce Negativní dopad selektovaných mutací na přežití Malčíková et al., Leukemia 2015 Přežití stanoveno od diagnózy „Mutation acquisition“ = přítomnost mutace v relapsu Naše zkušenosti (IHOK FN Brno) Přechod od čipových technologií k NGS – flexibilita, citlivost, rychlost, cena, přesnost •Ultra-deep sekv. (MiSeq) – klonální evoluce mutací v TP53 u CLL; citlivost 0,2% (Malcikova et al., Leukemia 2015) •Detekce ATM mutací u CLL a MCL (Miseq) •Detekce mutací SF3B1, NOTCH1 a BIRC3 u CLL •Exomové sekv. (NextSeq) – germinální mutace u hematologických malignit •Celogenomové sekv. (EMBL, Heidelberg) Resekvenační čipy - nutnost doprovodných analýz (sekvenování, qPCR, WB, …) Malcikova 2014: minoritní mutace už před terapií a mohou se objevit při relapsu; většina expanduje do dominantního klonu pod takem chemoterapie; častý výskyt mnohonásobných minoritních klonů Nevýhody NGS Limity zavedení do klinické praxe: •cena celogenomového sekvenování (cíl 1 000 $ /běh/pokrytí 30x, Illumina) •obrovské množství generovaných dat (otázka uchovávání ® vysoké náklady) •absence standardu pro určení kvality sekv. dat, rozdílné bioinformatické strategie •Obtížná interpretace dat •etická otázka nakládání s NGS daty Klinicka praxe podleha akreditaci metod – problém jak standardizovat (rozlišení chyba vs. varianta) Nejblíže je tomu genetické testování hereditárních syndromů Literatura •Stratton 2009: The cancer genome. •Simon 2013: Implementing personalized cancer genomics in clinical trials. •Wang 2009: RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics •Meaburn 2012: Next generation sequencing in epigenetics: insights and challenges. •Mundade 2014: Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. •Padmanabhan 2013: Genomics and metagenomics in medical microbiology. •Ellengren 2012: The genomic landscape of species divergence in Ficedula flycatchers. •Kapgate 2015: Next generation sequencing technologies: Tool to study avian virus diversity. • •Fridman 2012: Next-generation education in crop genetics. •Yang 2014: Application of next-generation sequencing technology in forensic science. •Dong 2012: Exploring the cancer genome in the era of next-generation sequencing. •Walsh 2010: Detection of inherited mutations for breast and ovarian cancer using genomic capture and massively parallel sequencing. •Koubkova 2014: Sekvenování nové generace a možnosti jeho využití v onkologické praxi •Guan 2012: Application of next-generation sequencing in clinical oncology to advance personalized treatment of cancer. •Ley 2008: DNA sequencing of a cytogenetically normal acute myeloid leukaemia genome. • • • • • • •Ding 2012: Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. •Jardin 2014: Next generation sequencing and the management of diffuse large B-cell lymphoma: from whole exome analysis to targeted therapy. •Wang 2011: SF3B1 and Other Novel Cancer Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia •Landau 2013: Evolution and Impact of Subclonal Mutations in Chronic Lymphocytic Leukemia •Rossi 2014: Clinical impact of small TP53 mutated subclones in chronic lymphocytic leukemia. • • Děkuji za pozornost D:\Verca\Moje prezentace,postery,publikace\Dizertace\Dokumenty\Obhajoba\foto CMBGT.JPG FN Brno_modra_ctverec