Sekvenační knihovny Knihovna Soubor různých fragmentů DNA, se kterými lze pracovat jednotným způsobem Klasická DNA/cDNA knihovna Klonování genomu/cDNA do vektorů Sekvenační knihovna Přidání sekvencí, které umožňují amplifikaci (klonální) a sekvenování Sekvenační knihovny Několik stovek typů Vstup DNA, RNA, krátké RNA, crosslinkovaná DNA/RNA Přidání adaptorů Ligace, tagmentace, PCR Selekce sekvencí Hybridizace, PCR, imunoprecipitace B t or ap ad on a ti fic pli xB de Am /i n rB de me rco pri Ba ing q Se nc ue Sekvenační knihovny DNA A er rim gp cin en qu xA A Se de t or /in ap de ad rco on Ba a ti lific p Am Sekvenační knihovny - Ligace Celé genomy Základ pro obohacování Amplikony ChIP, cDNA 3 kroky: End repair A-tailing Ligation (A-T) Oligo B A T DNA Náhodný fragment Amplikon T A Oligo B p Am A er rim gp cin en qu xA A Se de t or /in ap de ad rco on Ba a ti lific q Se B t or ap ad on a ti fic pli xB de Am /i n rB de me rco pri Ba ing nc ue Primer B B t or ap ad on a ti fic pli xB de Am /i n rB de me rco pri Ba ing q Se nc ue Sekvenační knihovny - PCR DNA Primer A p Am A er rim gp cin en qu xA A Se de t or /in ap de ad rco on Ba a ti lific Jednotlivé geny Metagenomika - 16S Sekvenační knihovny – dvoukolová PCR Jednotlivé geny Metagenomika - 16S Primer B - ext Primer B - int DNA Primer A - int Primer A - ext q Se B t or ap ad on a ti fic pli xB de Am /i n rB de me rco pri Ba ing nc ue p Am A er rim gp cin en qu xA A Se de t or /in ap de ad rco on Ba a ti lific Sekvenační knihovny - tagmentace Fragmentace a připojení části adaptorů v jednom kroku Transpozáza Dokončení pomocí PCR DNA q Se B t or ap ad on a ti fic pli xB de Am /i n rB de me rco pri Ba ing nc ue p Am A er rim gp cin en qu xA A Se de t or /in ap de ad rco on Ba a ti lific Cílený screening Exome sequencing Všechny exprimované geny Většinou včetně nekódujících Hybridizace (v roztoku) Gene enrichment Jeden gen – např. dědičné poruchy PCR, hybridizace multiplexing Skupiny genů – např. multifaktoriální nemoci, nádory PCR, hybridizace Úseky genomu – strukturní aberace hybridizace Cílené sekvenovaní (targeted resequencing) Hybridizace Exomy, genové panely Cílená exprese (Molekulární) inverzní proby HaloPlex PCR enrichment – (masivně) paralelní PCR Fluidigm AccessArray 48x48 reakcí, objem 10nL Wafergen SmartChip TE 5184 reakcí, 100nL RainDance Až 20.000 párů primerů, miliony reakcí, objem pL Knihovny pro epigenomiku Metylace MeDIP-Seq – protilátka proti metC BS-Seq – bisulfitová konverze, rozlišení na bázi Protein-DNA interakce ChIP-Seq – crosslink DNA/protein, vychytání protilátkou Aktivní chromatin DNAse-Seq