Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Ekotoxikologie vodních ekosystémů Testování Experimentální stanovení ekotoxicity Poznání efektů, které působí přítomnost stresorů na organismy v prostředí - suborganismální úroveň - laboratorní experimenty studium mechanismů toxicity látek, in vitro biomarkery, odhady míry subletální toxicity specifických typů (dioxinová toxicita, xenoestrogenita ...) - jednotlivé druhy organismů, jednotlivci - laboratorní experimenty • tradiční ekotoxikologické biotesty s jednotlivými druhy organismů, porovnání citlivosti různých druhů ... • - polní manipulované studie (in situ) studie s jednotlivými druhy - pěstování rostlin na kontaminovaných a kontrolních plochách, klecové experimenty v akvatickém prostředí (měkkýši, ryby) Experimentální stanovení ekotoxicity Poznání efektů, které působí přítomnost stresorů na organismy v prostředí - populační efekty - laboratorní testy • dlouhodobější experimenty – celoživotní testy toxicity,testy s časnými vývojovými stadiemi, rostliny – rozmnožování, klíčení ..., bezobratlí – obratlovci – testy reprodukční toxicity - efekty ve společenstvech - laboratorní mikrokosmy uměle ustavená společenstva organismů různých druhů za definovaných podmínek (producenti – konzumenti – destruenti) - terénní vícedruhové manipulované studie in situ • polní studie, akvatické mezokosmy (tekoucí, stojaté, litorální – příbřežní – - ekosystémové efekty – - terénní pozorování – hodnocení efektů v populacích a společenstvech v reálné přírodní situaci Experimentální hodnocení ekotoxicity laboratoř Metody hodnocení efektů Hlavním požadavkem ekotoxikologické studieje průkaz KAUZALITY mezi expozicí a efektem - Praktické stanovení ekotoxicity - Laboratorní jednodruhové biotesty - Laboratorní mikrokosmy - Manipulované a kontrolované mezokosmy - Polní studie - Reálné ekosystémy obtížnost průkazu KAUZALITY Vztahy Dávka - Odpověď Pro srovnání toxicity různých látek (vzorků) se užívají odvozené parametry 1) hodnoty odvozené pro 50% efekt - odhady v oblasti 50% efektů zatíženy nejmenší chybou, nejčastější: - LC50 – koncentrace (C) způsobující 50% letalitu (L) - LD50 – dávka (Dose) - EC50 – koncentrace způsobující 50% efekt (E) - IC50 – koncentrace způsobující 50% inhibici (I) Vztahy Dávka - Odpověď Křivka dávka - odpověď 2) další odvozené parametry - ECx (x=1,5,10,25,75,90,99 ...) - LOEC/L Lowest Observable Effect Concentration/L - NOEC/L No Observable Effect Concentration/Level - NOAEC/L No Observable Adverse Effect Concentration/Level - MTC Minimum threshold concentration - MATC Maximum Acceptable/Allowable Toxicant Concentration = geometrický průměr NOEC a LOEC Vztahy Dávka - Odpověď Srovnání toxicity látek Problém - různé směrnice křivky Dávka-Odpověď Pro dobrou interpretaci – uchování celé křivky 50% 0% 100% 1 2 koncentrace efekt Příklad: Na základě EC50 je toxičtější látka 1 ALE látka 2 vykazuje efekty ve významně nižších koncentracích Vztahy Dávka - Odpověď Vyjádření KONCENTRACÍ při hodnocení TOXICITY (1) čisté látky a definované směsi látek (barvy, produkty chemické výroby ...) KONCENTRACE – mg/L, mmol/L (=mM) (2) extrakty vzorků z prostředí - KONCENTRACE EXTRAKTU (% ředění ...) - KONCENTRACE původní matrice př. sediment – extrakce organickými rozpouštědly - Extrahovatelný Organický Materiál, koncentrace v testu toxicity – mg EOM / mL Vztahy Dávka - Odpověď Vyjádření KONCENTRACÍ při hodnocení TOXICITY (2) vzorky z prostředí - přírodní matrice voda, odpadní vody - koncentrace : % ředění - ev. jen srovnání efektu odpadní voda vs. kontrola pevné matrice – sedimenty - % ředění – existují postupy míchání/ředění - nejčastěji srovnání efektů s negativní kontrolou (+ / -) Vztahy Dávka - Odpověď Vzorky v prostředí – KOMPLEXNÍ SMĚSI - Látky ve směsích mají ve srovnání s čistými – izolovanými – látkami odlišné biologické vlastnosti (vč. toxicity) ADITIVITA / SYNERGISMUS / ANTAGONISMUS (1) ADITIVITA - princip kumulativní toxicity - základní ADITIVNÍ MODEL - nejčastější u látek s "nespecifickým" mechanismem toxicity (polární narkoza) Př. látka 1 vyvolá v koncentraci c1, efekt 25% látka 2 vyvolá v koncentraci c2, efekt 30% směsný roztok L1 a L2 v koncentracích c1 a c2 vyvolá efekt 55% (25 + 30) Vztahy Dávka - Odpověď Vzorky v prostředí – KOMPLEXNÍ SMĚSI (2) ANTAGONISMUS - látky ve směsi vzájemně inhibují toxický efekt - efekt po působení směsi je menší než podle předpovědi aditivního modelu - u látek se specifickými biologickými-toxikologickými vlastnostmi Příklad Současné působení neurotoxinů s různým mechanismem (princip "protijedů") – Veratridin (otevření membránových kanálů pro Na+/K+) – Saxitoxin (inhibice kanálů) Vztahy Dávka - Odpověď Vzorky v prostředí – KOMPLEXNÍ SMĚSI (3) SYNERGISMUS - látky ve směsi se vzájemně potencují - efekt po působení směsi je vyšší než podle předpovědi aditivního modelu - u látek se specifickými biologickými-toxikologickými vlastnostmi Příklad Toxicita pro Ryby: současné působení detergentu (snížení povrchového napětí na membránách žaber) a polární látky - inhibitoru mitochondriální respirace (samotný jen obtížně vstupuje do buňky ALE v přítomnosti detergentu  rychlý vstup, významný toxický efekt) Ekotoxikologické biotesty – konzumenti - bezobratlí AKVATICKÉ PROSTŘEDÍ Akvatické testy s bezobratlími jsou velmi běžné, někdy je ekotoxikologie zaměňována s "Daphniovými biotesty" uspořádání kádinky, akutní testy 48 h, prolongované testy 21 d, hodnocení letality, růstu ... krátkodobé - zpravidla statické Akvatičtí planktonní korýši - nejčastější Daphnia magna, Ceriodaphnia dubia Artemia salina (mořská) Další bezobratlí bentičtí – Gammarus, Hyallela azteca hmyz – Pakomáři (Chironomus), jepice ... Daphnia magna Artemia salina Ceriodaphnia dubia Gammarus Chironomus riparius Ekotoxikologické biotesty – konzumenti - bezobratlí AKVATICKÉ PROSTŘEDÍ ALTERNATIVNÍ MIKROBIOTESTY ("toxkity") s bezobratlími www.microbiotests.be Ekotoxikologické biotesty – konzumenti - bezobratlí PŮDA + SEDIMENTY Alternativní mikrobiotest TOXKIT (www.microbiotest.be) Sbírky a kultivace řas Sbírky a kultivace řas Řasy a sinice jako testovací organismy Ekotoxikologické biotesty - PŘÍKLADY Konzumenti - obratlovci Ekotoxikologické biotesty - obratlovci AKVATICKÉ PROSTŘEDÍ - RYBÍ biotesty -uspořádání -akvária - akutní testy 96 h, - prolongované a embryolarvální testy dny až měsíce - hodnocení letality, růstu, rozmnožování, testy karcinogenity (nádory), testy xenoestrogenity (vývoj oboupohlavníků) - různá uspořádání (statické, průtočné ...) Rybí druhy Pstruh duhový, Živorodka duhová (paví očko), Karas, Kapr, Střevle (Pimephales promelas) Specifické testy (endokrinní disrupce, karcinogenita) Halamčík rýžovištní – Japanese medaka Vícedruhové hodnocení ekotoxicity Byly vypracovány postupy pro hodnocení ekotoxicity ve složitějších – vícedruhových uspořádáních - simulace přírodních podmínek - model ekologických vztahů mezi organismy (potravní řetězce) - hodnocení nepřímých efektů (likvidace producentů -> další efekty v celém ekosystému) Experimentální uspořádání - podle velikosti (nezcela jednoznačné limity) : mikrokosmy voda - do 1 m3 stojaté, nebo 1 m tekoucí : mezokosmy - podle umístění – laboratorní kontrolované podmínky vs. přírodní Vícedruhové hodnocení ekotoxicity Praktická realizace (principy stejné s biotesty) (1) Biologický systém - Příprava, osazení, aklimatizace - Kontrolní varianta - Jedna nebo více (více koncentrací) exponovaných variant - Definovaný počet opakování (replicates) - nutné – složitější systémy – větší variabilita (! i u kontrol) (2) Expozice - Dávkování - přímo do vodní fáze (vodní mikrokosmy), postřikem na povrch (simulace přirozené aplikace pesticidů), řada dalších možností, jednorázové opakované ... - Doba expozice – podle typu mikro/mezokosmu – týdny až roky (3) Hodnocení parametrů, srovnání kontroly vs. expozice Příklad – laboratorní akvatický mikrokosmos Příklad – laboratorní akvatický mikrokosmos Příklad - požadavky na laboratorní mikrokosmos - model stojatého (lenitického) ekosystému Příklad jednoduchý laboratorní akvatický mikrokosmos - simulace tekoucích vod Příklad – akvatický mikrokosmos s makrofyty Příklady – venkovní mikrokosmy Příklady – venkovní plovoucí mikrokosmy Příklady – litorální mezookosmos Mezokosmy pro ekotoxikologické testování přípravků proti sinicím • Microcosm experiments - 250 l Tested substances: Natutal compounds Floculants Fe-chelators Enzymatic ROS producers Mezokosmy s přírodními sedimenty v přírodních podmínkách – 17.000 l  • fotodokumentace Positions of mezocosms 20 19 18 17 16 14 13 15 712 11 10 9 8 16 5 4 3 2 ..with natural reinvasion of Microcystis colonies from sediments Příklady – venkovní mezokosmy – tekoucí voda Příklady – venkovní mezokosmy lenitické Polní studie, biomonitoring vzorkování – odběry abiotických vzorků Voda Sediment Eckmanův drapák Polní studie, biomonitoring AKVATICKÉ PROSTŘEDÍ odběry biotických vzorků Planktonní síťky Periphyton – nárosty, biofilmy Polní studie, biomonitoring AKVATICKÉ PROSTŘEDÍ odběry biotických vzorků Bentičtí bezobratlí Ryby Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky