Embryonální kmenové buňky (Embryonic stem cell – ESC)
Embryonální zárodečné buňky (Embryonic germ cell – EGC)
Embryonální nádorové buňky (Embryonal carcinoma cell – ECC)
Kmenové buňky epiblastu (Epiblast stem cell – EpiSC)
Early-primitive ectoderm-like – EPL
Indukované pluripotentní kmenové buňky (Induced pluripotent stem cell – iPSC
(Multipotentní dospělé zárodečné kmenové buňky – maGSC)
Pluripotentní, odvozené kmenové buňky
ESC
ECC
EGC
EPL
EpiSC
iPSCmaGSC
Embryonální kmenové buňky
(Embryonic stem cell)
ESC
- jsou odvozené z vnitřní buněčné masy blastocysty
- fenotypem odpovídají přibližně buňkám vnitřní buněčné masy (mESC,
ICM – inner cell mass) nebo epiblastu (hESC, EpiSC)
- jsou pluripotentní
- přirozeně neexistují, pouze in vitro
- jsou nesmrtelné
- mají schopnost si udržet stabilní genotyp (!?)
- po injikaci do imunitně tolerantního organismu tvoří teratomy
(důkaz pluripotence)
- po injikaci do blastocysty mají schopnost tvořit kompletní chiméry
(známo jen u mESC (ale také u mECC, mEGC a miPSC), důkaz pluripotence)
Gilbert 1997 / Bílek 2004
Ontogeneze a diferenciační potenciál buněk vnitřní buněčné masy
3,5 dní p.c.
ICM
Linie ES buněk na feederu MEF
4-5 dní
Fibroblastová výživná vrstva
„feeder“- tvořená MEF
TE
Odstranění
PEF
Homogenní populace ES buněk
Vyseknutí a
disociace ICM
Izolace myších ES buněk
Upraveno podle Kroupová 2004
Imuno-chirurgie
6-8 ddnů IVF
TERATOM
CHIMÉRA
Organismus je směsí geneticky odlišných buněk / tkání / orgánů
Chimeričtí jedinci vzniklí injikací ES buněk (dárce) do blastocysty (příjemce)
jsou směsí geneticky odlišných buněk na ůrovni všech tkání, a tak také vytváří
pohlavní buňky s genotypem jak dárce, tak příjemce!
Nádor, který obsahuje buňky více jak jednoho zárodečného listu, většinou
všech tří. Tyto buňky mohou být fenotypu od časných stádií až po
terminálně diferencované
Teratomy jsou typické nádory původem ze zárodečných buněk (ovariální a
testikulární teratomy. Teratomy jsou jak benigní, tak maligní
(teratokarcinom)
Kmenové buňky teratokarcinomu = embryonální nádorové buňky
(Embryonal carcinoma (EC) cells)
Růst a kultivace ES buněk
PROLIFERACE – DIFERENCIACE - APOTÓSA
Existence a charakter ES buněk je udržován kombinací účinků vnějších
(extrinsic) a vnitřních (intrinsic) faktorů. Vnější faktory si ES buňky částečně
syntetizují samy, ale ve větší míře musí být dodávány. Významným zdrojem těchto
faktorů je výživná vrstva na které se ES buňky kultivují = FEEDER. Vnitřní faktory
si ES buňky nesou jako pozůstatek svého embryonálního původu.
FEEDER
- výživná vrstva = zdroj růstových faktorů (cytokiny, ECM, ..) a vhodný podklad
- nejčastěji se používají myší embryonální fibroblasty (13d p.c., MEF (PEF))
- bez „feederu“ z MEF = definované podmínky, ale horší ES buňky
- tendence používat druhově identické MEF = sníženi rizika přenosu virů, …
- MEF lze nahradit i jinými typy fibroblastů případně jinými buňkami
- MEF lze částečně nahradit komponenty ECM, specifickými cytokiny a přídavky,
matrigelem,…, obecně definovanějšími preparáty
Důležitou komponentou kultivačního média pro ES jsou také nedefinované faktory séra,
které lze nahradit dodáváním specifických růstových faktorů. Často se také používá
tzv. Serum-replacement = lépe definovaná náhražka séra (patentované složení).
- ES buňky spontáně diferencují, v kultuře je třeba této diferenciaci zabránit
- diferenciace je často spojena s apoptózou
- vhodnými kultivačními podmínkami, lze diferenciaci inhibovat
- faktory inhibující diferenciaci ES buněk se částečně liší u různých druhů,
ale existují výjimky i v rámci jednoho druhu!
ES
cell
mezoderm
+
entoderm
ektoderm
A B
Obecný model inhibice diferenciace ES buněk
feeder
(výživná vrstva)
auto- a parakrinně působící factory
ES
cell
mezoderm
+
entoderm
ektoderm
LIF* BMP-4
(BMP-2
/BMP-12
/FCS nebo SR*)
LIF – leukemia inhibitory factor
BMP-2,4,12 bone morphogenetic protein 2,4,12
FCS – fetal calf serum
Model inhibice diferenciace myších ES buněk
- existují i linie mES buněk nezávislé na LIF
- zdá se, že z LIF závislé linie, lze vyselektovat LIF nezávislou (!?)
- mES buňky pěstované bez „feederu“ ztrácí schopnost tvořit chiméry in vivo
- některé linie nelze bez „feederu“ pěstovat vůbec
vlastnosti mES buněk jsou ovlivněny genotypem imbredního kmene myší
z kterého byly izolovány!
IGF, (FGF-4), Wnt
FGF-4 – fibroblast growth factor
SR – serum replacement
Feeder*
*ABSOLUTNÍ OPTIMUM
ES
cell
mezoderm
+
entoderm
ektoderm
FGF-2 Activin/Nodal
Noggin
Wnt
FCS?
Model inhibice diferenciace lidských ES buněk
+
MEF (feeder) nebo matrigel
IGF, ?, Wnt, FGF-2
?
FCS – obsahuje jak difereciaci indukující, tak diferenciaci inhibující faktory. Kvalitu
FCS také ovlivňuje titr protilátek a složek koplementu. FCS se liší mezi jednotlivými
šaržemi = je třeba je testovat. Lépe je používat náhrady FCS se sníženou
koncentrací negativně působících látek na kultivaci ES buněk, např. SerumReplacement
( fy. Invitrogene-Gibco)
OPTIMUM???
Základní vnitřní faktory charakterizující / regulující ES buňky
(pluripotentní embryonální buňky)
Oct-4 (Oct-3/4, Oct-3, Pou5f1 – master of pluripotency)
- transkripční faktor, homeoprotein
- exprimuje se již u 2/4 (myš – aktivace transkripce) buněčného embrya
- ve stádiu moruly je jeho exprese výrazně zvýšena
- ve stádiu blastocysty je pouze v buňkách ICM
- později jeho exprese vymizí, zachovává se pouze v PGC (a později v
zárodečných buňkách)
- (nebyl nalezen u kuřat)
- reguluje expresi FGF-4 (Oct-4/Sox-2), PDGFa, ….
- v průběhu diferenciace za snížení jeho exprese odpovídá GCNF( germ cell
nuclear factor, RA (retinoic acid),…
- v primitivním ektodermu je exprese Oct-4 podporována LRH-1 (liver receptor
homologue 1)
- speciální varianta vzniklá alternativním sestřihem, se ale exprimuje i u MF
Nanog
- transkripční faktor, homeoprotein
- jeho exprese vede k udržení vysoké hladiny Oct-4
- objevuje se již ve vnitřních buňkách moruly
- později se zdá být nezbytný zejména pro specifikaci PGC!
- (výskyt i u některých progersivních nádorů (?!))
Sox-2
- Transkripční faktor Sry-rodiny (sex-determining region Y protein)
- Kooperuje s Oct-4 na vlastní expresi
- V průběhu indukce neurální diferenciace se jeho exprese zvyšuje
Boiani & Scholer 2005
Potencionální mechanismus účinků LIF
u mES buněk LIF/gp130/LIFR
Jak2/STAT3 PI3K/Akt + Erk
Nanog
Klf4
Sox2
Tbx3
Oct4
Niwa 2009
Krüppel-like transcription factors and control of pluripotency.
Bourillot PY, Savatier P.
BMC Biol. 2010 Sep 27;8:125
a) standard protocol
b) 3i/LIF protocol
c) 2i/LIF protocol
LIF
(indukce STAT3)
SU5402
(inhibice FGF-R)
PD0325901 / PD184352
(inhibice Erk signalizace)
CHIR99021
(inhibice GSK3, aktivace Wnt signalizace)
Alternativní kultivace mES protocol 2i/LIF, 3i/LIF
(A. Smith laboratory)
Wnt a mES
Niwa 2011
Pan2006
Boyer2005
Regulace transkripce faktory Oct-4, Nanog a Sox-2
Předpokládaný model vzájemné regulace exprese FoxD3,
Nanog a Oct-4 u mES. FOxD3 není exprimován u hES.
Model vzájemné regulace Oct-4, Nanog a Sox-2 a některé
jimi řízené geny u hES.
Promotory genů
Proteiny
Vzájemná regulace Oct-4 a Nanog není dosud plně objasněna.
Je však již jasné, že Oct-4 řídí transkripci Nanog přímou vazbou
v jeho promotoru (společně se Sox-2), jak u mES tak hES.
Pro self-renewal ES buněk je klíčové zachovat rovnováhu
v hladinách Oct-4 a Nanog (viz. níže).
Promotorové sekvence
rozpoznávané Oct-4, Nanog
a Sox-2 u hES.
Příklady vývojově významných genů pod kontrolou heterodimeru Oct4/Sox2
Zhou et al., 2007
Oct4/Sox2/Nanog zprostředkované regulace u mES buněk
Ztráta pluripotence u ES buněk v důsledku
deregulace rovnováhy mezi hladinou Oct-4 a Nanog
Chamber, 2004
Johnson 2006
ES BUŇKY
a) myší ES (mES) x b) lidské ES (hES)
(LIF / gp130* / STAT3 dependent) (LIF / gp130* / STAT3 independent)
Toto rozdělení je pravděpodobně dáno možností některých živočišných druhů mít
skrytou březost ve stádiu blastocysty (embryonální diapauza).
Rao, 2004
mESC PGC (h/m) EGC (h/m)
gp130 signalling
dependent / STAT3
somatické SC ??
pluripotent multipotent a méně
embryonální diapauza (myš / lasicovití)
hESC/mEpiSC
mouse
Signální dráha gp130 ->-> STAT3 ve vztahu k pluripotentním buňkám u člověka a myši
Současné studie však ukazují, že za regulaci
diapauzy je odpovědná zejména matka =>
u každé blastocysty lze navodit diapauzu !?
(G.E. Ptak et al., PLOS One 2012)
Některé charakteristické znaky myších a lidských ES buněk
‡Glykolipidy, § Keratan chondroitin sulfát
proteoglycan, ITetraspannin transmembránové
proteiny, AP – alkalická fosfatáza,
EB – embryoidní tělísko, ESC – embryonální
kmenové buňky, SSEA – vývojově specifický
embryonální antigen (stage-specific embryonic
antigen), TRA – antigen odmítnutí nádoru
(tumor-rejection antigen), NR – nestudováno
(not reported)
+ mES
- hES / mEpiSC
- mES
+ hES / mEpiSC
Signální dráha TGFbeta / BMPs u ES buněk
Kmenové buňky epiblastu – EpiSC (Epiblast stem cell)
Brons, 2007 & Tesar, 2007
Kmenové buňky epiblastu – EpiSC (Epiblast stem cell)
Brons, 2007 & Tesar, 2007
EpiSC
- neintegrují se do moruly a blastocysty => rozdíl s mES
- netvoří kompletní chiméry
- nebyla detekována aktivní alkalická fosfatáza (AP)
(mES, hES, EC, EG, PGC, mají aktivní AP)
- EpiSC částečně vysvětlují rozdíly mezi mES a hES
Kmenové buňky epiblastu – EpiSC (Epiblast stem cell)
Brons, 2007 & Tesar, 2007
Gadue 2005
mES je možno reverzibilně převést na buňky připomínající buňky primitivního ektodermu
tzv. EPL (early-primitive ectoderm-like) buňky. Tyto buňky již nemají podobně jako buňky
primitivního ektodrmu schopnost tvořit buňky parietálního entodermu. Také některé jejich
další schopnosti diferencovat, jsou oproti ES buňkám pozměněny (Pelton 2002) .
EPL
(+ FGF-5*)
ES
(- FGF-5*)
+LIF
- LIF + HepG2 buňkami kondiciované médium
*EPL buňky jsou podobně jako buňky primitivního ektodermu exprimují FGF-5 na rozdíl od ES buněk,
které exprimují zejména FGF-4 (platí pro myš)
Metylace DNA a kondenzace chromatinu u ES buněk
Meshorer & Misteli 2006
Epigenetika ES buněk
Proliferace ES buněk
S laskavým nedovolením z katalogu Santa Cruz Biotechnology, Inc.
- ES buňky relativně intenzivně proliferují (podobné nádorovým buňkám)
- G1 fáze buněčného cyklu je krátká (u mES ~ 1.5 h), zdá se, že chybí G1-checkpoint*
- velké procento buněk je v S fázi buněčného cyklu (mES > 60%, hES > 50%)
- doubling time mES ~ 10-12h, hES ~ 18-20h
- specifická charakteristika regulace buněčného cyklu (odolnost k p16,
nízká hladina cyklinů D, vysoká hladina cyklinu E, není potřeba proteinů rodiny Rb)
- inhibice proliferace, prodloužení G1 fáze (suboptimální podmínky) vede k diferenciaci
a apoptóse, diferenciace a apoptósa ES buněk, však nemusí vést ke snížení proliferace
jako takové
*tzv. kontrolní bod R, o průchodu tímto bodem rozhodují zejména mechanismy rozpoznávající
itegritu/neporušenost genomu, buňky s požkozenou DNA jsou za normálních okolností v tomto bodě
zastaveny. Porucha tohoto kontrolního mechanismu je typická pro nádorové buňky.
Rozdílné proporce v jednotlivých fázích cyklu
u časných embryonálních buněk
A short G1 phase is an intrinsic determinant of naïve embryonic stem cell pluripotency.
Coronado D, Godet M, Bourillot PY, Tapponnier Y, Bernat A, Petit M, Afanassieff M, Markossian S, Malashicheva A, Iacone R,
Anastassiadis K, Savatier P.
Stem Cell Res. 2013 Jan;10(1):118-31
Zpomalení proliferace a prodloužení G1 fáze vede k diferenciaci ES buněk
Chromosomální stabilita a ES buňky
Draper, 2004; Hanson, 2005
- dlouhodobá kultivace ES buněk vede k selekci odolnejších klonů a subpopulací
- menší responzivnost na vnější signály, rychlejší proliferace, menší nároky
na kultivaci, klíčové znaky často zachovány (Oct-4, Nanog, příslušné SSEA,...)
- u myší snížena schopnost tvorby chimér a zéjména germline u těchto chimér
- často spojeno s genetickou manipulací (knock-out, -in ES linie)
- nestabilita chromosómů, polyploidie, trizomie, zlomy a přeskupování genů
=> adaptace na in vitro podmínky
- hES, primární je trizomie chromozomu 12 nebo 17, vzácněji chromosomu 14 a 20
- často dochází i ke zdvojení dlouhého raménka chromosomu 17 a k translokaci
této kopie na dlouhé raménko chromosomu 6 => posílení exprese genů
na chromosomu 17 (Survivin – proti apoptóse, STAT3 – self-renewal mES a nadbytek
u většiny nádorů, GRB2 a 7 (growth factor receptor bound protein, viz. signální transdukce))
- na chromosomu 12 je lokalizován nanog (Nanog)
- časté i změny malých oblastí na chromosomech 1, 8, 18 a 20
- u mES se jedná o změny zejména chromosomů 8 a 11
(myší chromosom 11 je z části ekvivalentní k lidskému chromosomu 17)
Apoptická kontrola nestability karyotypu a ES buňky
Checkpoint-apoptosis.... of karyotipic instability. Mantel, 2007
- u zdravých somatických buněk při poruchách mitotického aparátu během jejich dělení
a tak vznikající chyby v mitóse vedou k jejich přechodu do senescentního stavu
nebo k indukci apoptósy
- ES buňky mají zvýšenou toleranci k poruchám mitózy, menší citlivost tzv. SAC
(SAC – splindle assembly checkpoint)
=> akumulace aneuploidních
a polyploidních buněk v populaci
- indukcí diferenciace lze tyto buňky
částečně eliminovat (apoptósa)
- tetraploidní buňky (blastomery)
mohou tvořit jen trofoblast
=> G1 MTA/tetraploidity checkpoint
=> využití při tvorbě embryí plně ES
původu
Příklad nárůstu apoptósy s diferenciací a požkozeným mitotickým aparátem
ES – embryonální kmenové buňky
EB – ES diferencovanou formou embryoidních tělísek
Noc/NOC – nocodazol
PAC - paclitaxel
Jak vypadá správná ES buňka?
Jsou všechny ES buňky v kultuře stejné?
Davey, 2006
Fortunel, 2003
LIF -> STAT3 aktivita u mES buněk
Microarray analýza exprese „stemness“ genů
pokračování
pokračování
Model narůstající heterogenity v rostoucí kolonii ES buněk
za dodržení známých optimálních kultivačních podmínek
růst kolonie ES buněk
Buňky odpovídající buňkám ICM/epiblastu
Časného neuroektodermu
Buňky primitivního entodermu
(morphologicky navíc tvoří také malá granula)
30<* 50<* 100<*
*orientační počet buněk v kolonii
epiblastICM
blastocoel blastocoel
trofoectoderm
Myší ES
Lidské ES
vývoj blastocysty
Fortunel, 2003
10
58 685
286
30157
674356
798
1389275
1744337
238
54 267
2
6
23
1
475
332
343
204
637
201
1341 792
Ramalho-Santos
Fortunel
Ivanova
ESC x NPC + RPC/HSC
ESC
ESC + NPCNPC
Variabilita v analýze transkripčního profilu u ES buněk (ESC), neurálních progenitorů (NPC),
progenitorů retiny (RPC) a hematopoetických kmenových buněk (HSC) u myši.
Tři pracovní skupiny, jedna metoda.
Existují geny kmenovosti,
tzv. „stemness geny“ ?
Vývojově specifické geny
=> potenciál buněk
Příslušné signální dráhy, specifický patern jejich aktivit
=> regulace diferenciace, proliferace, sebeobnovy
+
VYUŽITÍ ES BUNĚK
1. Biologický a biomedicínský výzkum
- Příprava geneticky modifikovaných organismů
- Studium mechanismů časné embryogeneze / diferenciace
- Studium mechanismů kancerogeneze
- Studium embryotoxicity
- Testování farmak
2. Lékařství
- Buněčné a tkáňové terapie
- Příprava biologicky aktivních preparátů
- Nosiče biologicky aktivních látek (pathotaxe)
Pro vytvoření linie GMO je potřeba, aby požadovaná genetická modifikace byly obsažena
i v pohlavních buňkách. Tuto modifikaci je tedy potřeba provést na buňkách toti- nebo
pluripotentních.
• Náhodným nebo cíleným(?) vložením požadované DNA do zygoty
• Náhodným nebo cíleným vložením požadované DNA do ES buněk
Příprava geneticky modifikovaných organismů -
GMO
- Díky prakticky neomezené možnosti kultivace ES buněk, lze mít prováděnou genetickou
modifikace plně pod kontrolou, a také ji můžeme velice přesně naplánovat!!!
- ES buňky jsou pluripotentní, po zpětné injikaci do blastocysty a vložení této blastocysty
do dělohy pseudo-pregnantní myši, blastocysta pokračuje ve vývoji a vzniklý jedinec je
chimérou buněk původni ICM a injikovaných ES na ůrovni všech tkání, tedy i zárodečné.
Příprava KO/I myší
ES buňky v buněčné terapii
Model regenerace poškozené hematopoesy v důsledku mutace Rag2-/s
použitím ES buněk, genetických manipulací a jaderného reprogramování
Rideout, 2002
Diferenciace ES
buněk
a) In vivo
- teratomy: injikace suspenze ES buněk do vaskularizované tkáně
imunitně tolerantního zvířete, popřípadě do zvířete s
farmakologicky potlačenou imunitní odpovědí
- chiméry: injikace ES buněk do blastocysty, navrácení takové
blastocysty do pseudo-pregnantní myši = vznik chimerického
jedince
b) In vitro
- metodiky korespondující s ontogenezí
- metodiky získané empiricky (kopírující ontogenezi?)
Musí buňka diferencující z ES buňky vždy kopírovat ontogenezi aby dosáhla určitého stavu?
In vitro diferenciace ES buněk
a) Embryoidní tělíska (Embryoid
bodies - EB)
+jednoduché, více buněčných typů
+ tolerující genotyp
- špatně definované podmínky
b) V monovrstvě
+ dobře definovné podmínky
- malá efektivita (většinou)
- silně závislé na genotypu
kultivace
selekceindukce
Rathjen 1998 / Bílek
2004
Loebel, 2003
Úloha specifických růstových faktorů v ontogenezi myši
Loebel, 2003
Příklady diferenciace myších ES buněk
kombinací typu jejich kultivace
a specifických růstových faktorů
s porovnáním úlohy těchto faktorů
v myší ontogenezi
pokračování
Guasch, 2005
Schuldiner, 2000
Příklad účinků jednotlivých specifických růstových faktorů na indukci diferenciace
u lidských ES buněk v kombinaci s tvorbou embryoidních tělísek
Barberi 2003
Příklad difernciace ES buněk do různých typů neurálních buněk
NSC – neural stem cell, DA/Ser/GABA – dopaminergní/serotonergní/gabanergní neurony,
MN - motoneurony
SOUČASNÉ PROBLÉMY S VYUŽITÍM ES BUNĚK V TERAPII
- hES se nedaří dlouhodobě kultivovat beze změn v genotypu / fenotypu
- dlouhodobá kultivace za sub-optimálních podmínek vede k dosud neznámým,
epigenetickým změnám snižujícím schopnost pluripotence (ireverzibilními i
pro cytoplasmu zygoty, Amano 2006)
- dosud není spolehlivě vyřešen potencionální vznik teratomů
- biologie a diferenciační potenciál ES buněk nejsou dosud dobře
prozkoumány
- kultivace ES buněk je stále závislá na nedefinovaných faktorech
- vliv pohlaví, inaktivace X chromosomu x aktivace genů na Y chromosomu
(variabilita v odpovědí na stimuly diferenciace, stabilitu vlastností..)
- etika získávání nových lidských ES linií (různé státy, různé pohledy na věc)
- finance, přes velice atraktivní potenciál, který v sobě ES buňky mají, není jisté,
jestli současná společnost bude mít dost prostředků na jejich využití
např. v buněčné terapii
Primordiální zárodečné buňky – PGC
(primordial germ cell)
- PGC se u myši objevují již 6 dpc, pravděpodobně je jejich vznik indukovaný v průběhu
gastrulace, a to vnějšími signály, zejména BMP (na rozdíl od žab, Drosophily a C. elegans).
- 6 – 7.5 dpc migrují vně vlastní embryo, později (8.5 dpc <) migrují podél zadního střeva
embrya do vytvořené zárodečné lišty.
- PGC zanikají po usazení v zárodečné liště (10-13 dpc u myši), stávají se z nich
zárodečné buňky. Prodělají ještě 2-3 mitózy a u samců vznikají prospermatogonie
zastavené v G0/G1 fázi mitózy. U samic vstupují do meiotické profáze (obojí > 12.5 dpc).
- Podobně jako ICM a ES buňky mají vysokou hladinu alkalické fosfatázy (ale ne TNAP,
ale GCAP/TNAP), také exprimují Oct4, Nanog, ..
- Významné (pro specifikaci) jsou zdá se zejména Stella, Fragilis, Nanog,….
- PGC nejsou pluripotentní, jsou unipotentní!
- PGC mají omezený počet dělení, u myši napočítáno kolem 1000 buněk, rozdíly v závislosti
na imbrední lini (případně metodě )
Další klíčové geny ve specifikaci PGC
Stella (DPPA – developmental pluripotent associated 3)
Od oocytu (maternalní) po epiblast, později jen u PGC,
podílí se na udržení jejich fenotypu, po jejich usazení v
zárodečné liště jeho exprese vymizí. Také u ES buněk a
některých nádorů. Represor transkripce.
Fragilis (IFITM3 – Interferon induced transmembrane protein 3)
Z rodiny IFN indukovaných genů, je silně exprimován při
formování PGC, s jejich migrací jeho exprese klesá.
Transmembránový protein, narušuje intracelulární
metabolismus cholesterolu a tím modifikuje vlastnosti
buněčných membrán.
Cyklus zárodečných buněk u myši
Exprese Fragilis mezi 6 – 7 dpc
Exprese Oct-4 v PGC
usazených v zárodečné liště
PGC
primordiální zárodečné buňky
Hayashi, 2007
Mechanismus vzniku PGC
Hayashi, 2007
Blimp1 – represor transkripce; Prmt5 - metyltransferáza
Embryonální zárodečné buňky – EGC
(Embryonic germ cells)
- EGC jsou odvozeny z primordiálních zárodečných buněk (PGC – primordial germ cell).
- Podobně jako ES buňky je lze expandovat in vitro, a jsou pluripotentní, jak dokazuje
jejich schopnost diferencovat do buněk všech tří zárodečných listů jak in vitro (EB),
tak in vivo (chiméry a teratomy).
- Z epigenetického pohledu (DNA metylace) jsou však více podobné PGC než ES buňkám
- Rozdíly v metylaci DNA se týkají zejména imprintovaných genů v závislosti na pohlaví,
u EGC izolovaných z pozdějších embryonálních stádií se tento rozdíl zmenšuje.
Tyto „imprinting-free“ PGC, však již netvoří zdravé chimerické jedince.
- U myší lze EGC izolovat z PGC mezi 8.5 – 12.5 dpc, později to již nelze
- PGC a následně EGC lze izolovat in vitro z ES buněk (lidských i myších)
- m/hEGC jsou závislé na LIF, během časné kultivace i na FGF2
a Stem cell faktoru (SCF; + feeder & FCS/SR).
- Exprimují podobné markery jako ES buňky, lidské EGC jsou fenotypem více podobné
mES než hES (morfologie + exprese SSEA-1!;
u hES se SSEA-1 exprimuje až s jejich diferenciací)
Vznik EGC z PGC
(Durcova-Hills 2008)
Porovnání transktiptomů mES, mPGC a některých tkání
R1, E14tg2a, TMA5 – linie mES buněk
TMA55G (male), TMA58G (female) – EGC
GS – germ stem cell (derived from spermatogonia)
(Mise et al., 2008)
blue – ES specifický patern
red – PGC specifický patern
purple - ES/PGC specifický patern
green – nevýznamné pro specifikaci
ES/PGC
Analýza hlavních komponent expresních profilů
Donovan, 2003
Schema předpokládaného zapojení FGF, LIF a KL (c-Kit ligand = Steel factor (SF)/
stem cell factor (SCF) v regulaci sel-renewal EG buněk
Donovan, 2003
Vztahy mezi pluripotentními buňkami a některé klíčové regulační komponenty
těchto buněk
Sl – Steel locus, Ter – Teratoma locus, pgct1 – primordial germ cell tumor susceptibility locus, PTEN –
Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10, mTR (mTOR) - serine-threonine kinase
mammalian target of rapamycin
Není původ ES buněk v PGC ???
Zwaka, 2005
Není původ ES buněk v PGC ???
M- myš; H –člověk; N/D – netestováno; ES – embryonální kmenové buňky; EGC – časné primordiální
zárodečné buňky (!); LGC – pozdní primordiální zárodečné buňky; ICM – vnitřní buněčná masa;
PE – primitivní ectoderm/epiblast
Zwaka, 2005
Nature. 2013 Oct 30. doi: 10.1038/nature12745. [Epub ahead of print]
Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells.
Gafni O, Weinberger L, Mansour AA, Manor YS, Chomsky E, Ben-Yosef D, Kalma Y, Viukov S, Maza I, Zviran A, Rais
Y, Shipony Z,Mukamel Z, Krupalnik V, Zerbib M, Geula S, Caspi I, Schneir D, Shwartz T, Gilad S, Amann-Zalcenstein
D, Benjamin S, Amit I, Tanay A,Massarwa R, Novershtern N, Hanna JH.
Source
1] The Department of Molecular Genetics, Weizmann Institute of Science, Rehovot 76100, Israel [2].
Abstract
Mouse embryonic stem (ES) cells are isolated from the inner cell mass of blastocysts, and can be preserved in vitro in a
naive inner-cell-mass-like configuration by providing exogenous stimulation with leukaemia inhibitory factor (LIF) and small
molecule inhibition of ERK1/ERK2 and GSK3β signalling (termed 2i/LIF conditions). Hallmarks of naive pluripotency
include driving Oct4(also known as Pou5f1) transcription by its distal enhancer, retaining a pre-inactivation X chromosome
state, and global reduction in DNA methylation and in H3K27me3 repressive chromatin mark deposition on developmental
regulatory gene promoters. Upon withdrawal of 2i/LIF, naive mouse ES cells can drift towards a primed pluripotent state
resembling that of the post-implantation epiblast. Although human ES cells share several molecular features with naive
mouse ES cells, they also share a variety of epigenetic properties with primed murine epiblast stem cells (EpiSCs). These
include predominant use of the proximal enhancer element to maintain OCT4 expression, pronounced tendency for X
chromosome inactivation in most female human ES cells, increase in DNA methylation and prominent deposition of
H3K27me3 and bivalent domain acquisition on lineage regulatory genes. The feasibility of establishing human ground
state naive pluripotency in vitro with equivalent molecular and functional features to those characterized in mouse ES cells
remains to be defined. Here we establish defined conditions that facilitate the derivation of genetically unmodified human
naive pluripotent stem cells from already established primed human ES cells, from somatic cells through induced
pluripotent stem (iPS) cell reprogramming or directly from blastocysts. The novel naive pluripotent cells validated herein
retain molecular characteristics and functional properties that are highly similar to mouse naive ES cells, and distinct from
conventional primed human pluripotent cells. This includes competence in the generation of cross-species chimaeric
mouse embryos that underwent organogenesis following microinjection of human naive iPS cells into mouse morulas.
Collectively, our findings establish new avenues for regenerative medicine, patient-specific iPS cell disease modelling and
the study of early human development in vitro and in vivo.
Lidské „naivní“ pluripotentní kmenové buňky (human naive hESC = ekvivalent mESC
Dospělé multipotentní zárodečné kmenové buňky
(AMGDSC Adult multipotent germ-derived stem cell)
- odvozeno ze spermatogonií
- fenotyp velmi podobný ES buňkám
- oproti ES buňkám snížená schopnost pluripotence – jen chiméry
- pluripotence také in vitro
Pluripotency of spermatogonial stem cells from adult mouse testis.
Guan K, Nayernia K, Maier LS, Wagner S, Dressel R, Lee JH, Nolte J, Wolf F, Li M, Engel W, Hasenfuss G.
Nature. 2006 Apr 27;440(7088):1199-203.
Condition II & IV + LIF
Concise review: challenging the pluripotency of human testis-derived ESC-like cells.
Tapia N, Araúzo-Bravo MJ, Ko K, Schöler HR.
Stem Cells. 2011 Aug;29(8):1165-9.
V současnosti ale pochybnosti
Kmenové buňky teratomu / teratokarcinomu - ECC
Embryonální nádorové buňky (Embryonal carcinoma cells)
- Izolované rozkultivováním a klonální selekcí buněk teratomu / teratokarcinomu
- Lidské spontálně, myší indukované transplantací časných embryonálních buněk
do dobře vyživované tkáně (varlata, ledviná kapsa, břišní dutina,…), musí být
imunotolerance
- Podobné vlastnosti jako ES buňky, ale méně závislé na specifických růstových
faktorech (+)
- Tvoří také chiméry, ale nedokonalé, většinou hynou v průběhu embryogeneze (-)
- Většinou snížená schopnost pluripotence jak in vivo, tak in vitro (-)
- Obecně nestabilní genotyp a časté aneuploidie (-)
- Modelové studie genetické nestability a diferenciace, vzniku teratomů
- Levnější alternativa k ES buňkám, lepší stabilita v experimentálních systémech
jak ES (+)
Neurální lišta a kmenové buňky
neurální lišty
Neural crest stem cell - NCSC
Sebeobnova
Růstové faktory - FGF2, Notch, Wnt
Transkripční factory – Slug (Snai2), Sox10
Fenotyp - blízký NSC – exprese Nestinu (protein intermediálních filament)
Experiment potvrzujicí pluripotenci buněk neurální lišty
ESC
iPSC
ECC
EGC
maGSC ?
EPLC
epiSC
Schopnost pluripotence – tvorba chimér a teratomů
hESC
hEGC(?)
hiPSC(?)
neural
crest
(? všechny)
hECC
Kmenové buňky extraembryonálních tkání
A) Kmenové buňky trofektodermu (trofoblastu)
FGF-dependent (FGF4, FGFR2); Cdx2, Eomes, Errb
B) Kmenové buňky primitivního entodermu (hypoblastu)
XEN – buňky extraembryonálního entodermu
blastomery
ICM
trofektoderm linie trofoblastu
primitivní entoderm
primitivní ektoderm
zárodečný epiblast / embryoblast
allantois
amnion
mezoderm žloutkového vaku
viscerální entoderm
parietální entoderm
Regulace kmenových buněk trofoblastu signály z epiblastu