Hematopoetické kmenové buňky - HSCs (hematopoietic stem cells) (Hematopoéza) HSC(GO) HSC L-blast Mo-blast Lympho Mono cyte cyte Progenitor Pro-M Myeloblast Myelocyte t r Meta-M (band) % (seg) Neutro phil Eosino Baso phil phil Progenitor Promegakaryo cyte Baso-E Pro-E • Poly-E Megakaryocyte Ortho-E Erythrocyte Platelet HEMATOPOÉZA - HEMATOPOETTCKE KMENOVÉ BUNKY - HSC (hematopoietic stem ce\\s) - Hematopoéza je v současné době zřejmě nejlépe prostudovaná diferenciační dráha s nej dokonalejším fenotypovým rozlišením jednotlivých buněčných stádií buněk založeno na tzv. CĎ (cluster determinants) antigény. - Jednotlivé diferenciační dráhy jsou často majoritně závislé na jediném cytokinu (kolonie stimulujícím faktoru - CSF; např. G-CSF, faktor stimulující tvorbu zejména granulocytů) - V průběhu ontogeneze je hematopoéza realizována jedinečným způsobem (časově a prostorově, viz. níže), což dobře umožňuje i studium rozdílů mezi embryonálními a adultními somatickými kmenovými buňkami. Každopádně již v průběhu embryonálního vývoje vznikají jisté typy populací ve smyslu „fakultativních kmenových buněk" (některé tkáňové makrofágy, mikroglie, různé typy lymfocytů). - HSC vzniklé ve žloutkovém váčku také migrují do oblasti AGM a do jater, kde dávají vznik adultním HSC (Samokhvalov, 2007) CD antigens (I)ll7t lib- CTCSSa*" (i)H7i llb-/+ ( l)235»~ (1)117- Hb+ CD36"-"' r<>ir\throhliiM orthochromiilic vryllirobliiNl (1)34++ HI.A-I)K+t ( D38++ C 1)34+ (1)4+ CD 13+ (1)33+ HLA-DR+ MI'O- ( 1)4« (1)13+ (1)13+ (1)15+ (1)15+ (1)33+ CD33++ ( 1)36+ (1)36+ ( 1)64+ (1)64+ HLA-DRH 111 A-DR+ < i > 1111 CDIIb++ (1)14+ ( 1)14» 1 (1)16+ (1)16.1* ("1)4+ (1)13+ (1)15+ CD33++ CD36* CD64+ RLA-DR4 CDllb++ ( 1)14« ' |irniiu't>akuryocyH' l.ill- (1)34+7- (1)34- CD34+ Cl>38+/- (1)38+ (1)38- CD6I + (1)61+ (1)123- (1)41 + • I'll ( D45KA- (1)42- CD42+/- Tl»()-R+ (1)34-CD38++ ( 1)61++ CD41++ (1)42» iiU'Kakui'yitcylc Rozlišujeme: LT-HSC (long-term HSC) - schopné opakovaně kompletní obnovy hematopoézy (vyžadují osteo b lasty), Kostní dřeň - <0.01% buněk ~ 98 % v G0 fázi buněčného cyklu ST-HSC (short-term HSC) - schopné jen krátkodobé obnovy hematopoézy (vyžadujíendotelie - vaskulární niche) ~ 1 - 3% proliferujících (aktuální X potencionální (proliferující) kmenová buňka) Harrison et al. (1979): transplantoval myším opakovaně identický štěp HSC déle jak 8 let - > výrazné překročení délky života myši!!! - > OPRAVDOVÉ AĎULTNÍ KMENOVÉ BUŇKY! Dělení hematopoietických buněk Feedback signal regulates self-renewal ................. • • • — long-term short-term multipotent commited repopulting repopulting progenitor progenitor precursors mature cells stem cells stem cells cells cells (CPC) (LT-HSC) (ST-HSC) (MPC) Symmetric differentiating cell division Asymmetric cell divisions Symmetric self-renewing division 1 V Differentiation LT-HSC ST-HSC MPC 1st 2ai CO c o CO ■> •B o n E 3 d) O c 0 O CO o> d) CO > CO o Q. 0 2nd 2a i 3rd 2a | ith 2a i ;th 2a i 6th 2a 1 7th 2a 1 A1 1 A2 i » A3 l A4 \ A5 1 A6 i A7 49 th 2a i 50 th A49 \ A50 100di 100dj 100d B1 i B2 i B3 i B4 1 10Od i 100di 100d| B5 i B6 i B7 100dÄ B49 I B50 10d( 10d< 10d< 10d| 10d< 10d| 10d< C1 l C2 i C3 1 C4 I C5 C6 i C7 ♦ ■ '4 T 10d/ C49 I C50 CPC precursors mature cells 5d Q D1 1 5d Q D2 5d 5d D3 D4 5d 5d 5d D5 1 D6 i D7 A T ■ 5d Q D49 i 2d 2d E1 I E2 e 2«% E3 E4 2d 2d 2d E5 i E6 I E7 'A ▼ 2d D50 E49 I E 50 F2 ^Od P^20d F3 20d F4 F5 20d P^Od F6 ^* ■ 20d ♦A F49 F50 20d 20d Doba existence buněk v jednotlivých vývojových stádiích hematopoésy (Rychlost dělení není ukázána!) Hematopoietic Stem Cell Differentiation Hematopoietic stem cell Self-renewal i Myeloid stem ceil Self-renewal Differentiation Committed precursor cells Cytokines M-CSF Differentiated cells Lymphoid stem cell Self-renewal Differentiation GM-CSF ? IL-3 * - GM-CSF IL-3 G-CSF Epo - SCF Tpo IL-2 VIL-7 N IL-12 Others macÄte Granutocyte Eosinophil Red blood cell Oik Platelets m_ Tcell t Bcell LP IL=interleukin Epo=erythropoietin GM-CSF=grantilocyte/macrophage colony-stimulating factor SCF=stem cell factor G-CSF»granuJocyte colony-9timutating factor Tpo»thrombopoietin M-CSF=monocyte colorry-atimulating factor © 2005 Cassio Lynm. To obtain permission of use please contact www.cassio-lynm.com Hematopoiesis Pluripotent stern cell V GFU-GEMM BFU~E CFU-MEG 11_-j GFU-Eo THYMUS GM-CSF VEpo GFU-E IL-3 ,G M-CSF Epo GM-CSF CFU_GM GM-CSF IL-3 GM-CSF Epo I Megakaryocyte i IL-3 GM-CSF IL-3 GM-CSF GM-CSF IL-3 M-CSF TG-CSF T IL-3 i i Red blood Monocyte Granulocytes B eel Platelet Tcel ■j el M-CSF fGM-CSF Macrophage .1» ii CT ^ rip' uCr itf & CP BFU4 derived colony (erythroid) CPUGM derived colony (myeloid) CFU Meg derived colony (megakaryocyte) Erythrocytes Platelets Ncutrophls Monocytes Eosinophil Basophils Stem Progenitor Precursor Mature cell cells cells cells Příklad kolonií hematopoézy v in vitro experimentu Palis 1999 Ep - primitivní erytropoéza, MAC - primitivní makrofagy, BFU-E - (Burst-forming unit erytroidní) z fetalních jater, GM - granulocatarní-makrofagova kolonie Fenotyp HSC (mouse) antigen HSC Myeloid SC Lymphoid S C CD 10 (C ALL A) - - + CD33 (Sialoadhesin) - + - CD34 (L-selectinR) + (-) + + CD38 (ecto-ADP-ribosyl cyclase) - - + CD90 (Thyl) + - + CD110 (Trombopoietin receptor) + + - CD111 (Nectinl) - + - CD112 (Nectin2) - + - CD117 (c-Kit, SCFR) + + + CD 123 (a řetězec IL-3R) + + - CD 124 (IL-4R/IL-13R) - - + CD 127 (a řetězec IL-7R) - - + CDwl31 (P řetězec IL-3R/IL-5/GM-CSF) - + - CD133 (Acl33) - + - CD135 (Flt3/Flk2) + - - CD173 (krevní skupina H typ 2) - + - CD 174 (Lewis Y) - + - CD 176 (Thomson-Friedrenreich antigen) - + - CD227 (MUC-1) - + - CD228 (Melanotrensferrin) - + + CD243 (MDR-1) + - - Schema hematopoézy a fenotyp aktuálních a potencionálních HSC - mouse Self-renewal Stem cells Mult i potent progenitors OI i go potent progenitors Lineage-restricted progenitors Effector cells O ^ LT-HSC 2y (LINT KIT4" SCAr CD3410 FLK210) * ®ST-HSC (LIN" KIT4" SCA1* CD34Hi FLK2Lo) Í ÍC))MPP (LINT KIT SCA1+ CD34Hi FLK2Hi) Erythrocytes Platelets Granulocytes Macrophages T cells Mouse Human ELinc Kit'Scar LlnCD34XD3 I Hematopoietic Hierarchy ^ HSC ^ Long-term ^ Self-renewal Flk2 CD34 Slamtr CD38 CD90-CD45RA" Llnc-Ktt'ScaVFIk2 CD34'Slamf1 Lin CD34*CD38 CD90 CD45RA 5 I © ,_, / | (Llnc.KtfSca1,Flk2h'CD34,Slamfl) ^ q ( Llrrc-Kit'ScarFlk2'CD34*SlamM Multlpotent Progenitors / Llnc-Ktt'Sca LlnCD34 ial'ILTRg* Flk2h) / •CD38XDHT ) 7 ( Llnc-KifSca1 CD34" \-c-R (LlnCD34*CD38,IL3Ra'cv>CD45RA) y MEI* GMP ( Lin c-Kit'S calCD34 FcTR"*) 'Lin 0034X038' IL3Rct CD45RA) (Unc-Kif Seal CD34 Fc-fR') (LlnCD34,CD38,IL3Ra-CD45RA) Ep CLP Pro-T Pro-NK © a I Erythrocytes Platelets Granulocytes Macrophages Dendritic cells v Oligopotent Progenitors > I Lineage restricted Progenitors Mature effector cells T-cells NK-celte B-cells Critical transcription factors for blood development c J2 o u Is — Q. w LT-HSC Self-rehewal. Run» 1 Scl/tai-1 Lmo ? MU Tel Bmi-l Gfi-1 GATA-2 Stem cell class Required for production, survival, or self renewal of HSCs 0 O 3« 5 a ST-HSC CMP MEP GATA-1 GATA-2 FOG-1 GAIA- GATA1- -PU.1 "C/EBP<: E2A I HP Pax-5 Ben la (Ew9) Notcrv-«|» TCF-1- GATA-3- *o .t: « E3 E u 52 ü a QASA-1 FOG-1 Gfi-lb EKLF GATA-1 Gfi-lb GATA-1- Gtl-1- •C.'EBP. — 9> O 3 RBC Megakaryocyte Mast cell 4 Fli- N1-E2 Eosinophil Neutrophil Macíopfíage B ly™Ph<>cyte T lymphocyte I.V. Platelets Extrinsic a intrinsic faktory regulující sebeobnovu adultních HSC (Akala & Clarke 2006) významnou úlohu hraje hypoxie a HIF! HSC mají vysokou hladinu HIF nezávisle na hypoxii! - úloha cytokinů SCF, IL-x? Bmil - polycomb group protein PTEN - inhibitor PI3k/Akt P1^ p21 - inhibitory cdk STAT5 - signalizace cytokinů HoxB4 - transkripční faktor specifikující linii hematopoézy Self-renewal HSC Ukázka homogenity ve fenotypu jednotlivých buněk na základě exprese klíčových transkripčních faktorů zapojených v regulaci hematopoézy jako jsou Flil, PU.l a Myb. A Runx1+23GFP transgenic embryos E10.5 AGM/VUA region Endothelium VEcad* Runx1+23GFP-Ter119- CD41-CD45- FM PU.1 Myb Haemogenic Endothelium VEcad* Runx1+23GFP* Ter119- CD41- CD45- MYb FIH PU.1 Committing HSPC Fli1 VEcad* Runx1+23GFP* PU.1 Ter119-CD41*CD45- Myb Mature HSPC Fli1 VEcad* Runx1+23GFP* PU.1 Ter119-CD41*CD45* Myb Gene expression (ACt) •10 -8 Not detected -6 -4-2 0 2 4 "1 High expression Flil - Fli-1 Proto-Oncogene, ETS Transcription Factor / Friend leukemia virus integration 1 2548414^ 4199999 555555555555555345555554555555 Mobilization SNO cell N-cadherin CD45 Sinusoidal vessel Granulocyte— Lymphocyte — ^f) Platelets—#f<§ rbcs— HSC 71e2' Lin Sca-ľ c-kiť N-cadherin* CD45- Circulation Endothelial cells Vascular niche Bone Endosteal Bone marrow Mobilizace HSC (přechod HSC do periferní krve) - působením G-CSF, SCF, IL-3, TPO G-CSF - granulocyte colony-stimulating factor, SCF - stem/steel cell factor, IL-3 - interleukin 3, TPO - trombopoetin Yin & Li 2006 Osteoblastic Niche Vascular Niche Endothelial cell (CAR (Cxcll2-abundcmt reticular) cells ) Endosteum Zone Central Marow Zone Bone Endosteal quiescent-storage niche Bone marrow Migration to the thymus tint! difTcrrnti.il ion into thymocytes Differentiation into B cells that migrate to stromal cells in llie bone marrow expressing CXCL12 Změna niche - ztráta kmenovosti = diferenciace - změna statusu - quiescence x proliferace Copyright © 200b Nature Publishing Group Nature Reviews | Immunology Model významu angiopoetinu v regulaci sebeobnovy HSC Ang - angiopoetin Tie2 - receptor angiopoetinu \niil; I U-2 Míiintains the "Sternness |\1» úbytek HSC => zvýšení intenzity hematopoiésy Osteoblastic niche Vascular niche MyeloNupprcwion ATM or POXO Serial BMT Detachment Oefects of stem cell function from the niche Exhaustion of stem cells Původ HSC Podíl jednotlivých tkání na celkovém objemu hematopoézy mezi 11-13 dpc u myši I YS □ AGM Ü Circulation | Liver Embryo Age (days) 11 12 13 Total HSC 40 600 2675 Pozn. Slezina je osídlena HSCs a hematopoetickými progenitory pravděpodobně z jater, protože v době objevení se hematopoézy ve slezine, v žloutkovém vaku a v aortě už hematopoéza neprobíhá a kostní dřeň dosud není vyvinuta. Místo vzniku krevních ostrůvků (blood island) v průběhu embryogeneze u myši E7.6 Schema vyvoje AGM (aorta-gonads-mcsoncphros) - zacdtek f etdlni hematopoezy Ectoderm ] % I Somatopleura Mesoderm 1 | ^ I Splanchnopleura Endoderm J MOUSE Lokalizace, změna „niche" u hematopoézy v průběhu ontogeneze Vznik krevních ostrůvků ve vznikajícím žloutkovém vaku mezi mezodermem a buňkami viscerálního entodermu visceral endoderm mesoderm 7.5 dpc 0 1 1 M V 1 .11 l !]<(< " 11 ] III ■MOdtlM \ endothelial cell e erilhrohli^l IiImimI islands HSC CFU-GM BFU-E JÁTRA 11 dpc Hematopoéza v endotelu aorty (AGM), ~10.5 d Dorsal Somite mesoderm XL / Red l'.l.....1 Cell Kndotheliul Cell ( I).I4,('1»I. \ Iwadherin. Flt-1, Flk-1/KDR. Tie2, AA4.1. c-kit. vWF, SCL. AMI I . GATA2, VF.CF Hematopoietie Intra-aortic Cluster Ventral Splundi in »pleural Mesoderm CD45, CD164, CD43, CD44, CD41, CD34, CD31. AA4.1, VlO-cadherin, r-Kit, c-Mpl, gp130 G-CSFR, TIF.2. CXCR4, Flt-1. Flk-1/KDR?. cMyb, LM02. SCL, AMU, GATA2, CATA3 BMI'4. G A I A3, VA4.1. Tcnascin C, CD 166. Subaortic Mesenchyme smooth miiscle-a actin, Sca-I AMU, GATA2. SDF1. VF.GF\ C-Kll iip,and. II.-ft. OSM. Tpo Kostní dřeň, ~15 dpc S vývojem kostní dřeně se HSCs usazují v jejím stroma. THYMUS pT, pB - lymfocytární progenitory CFU-GM - myeloidní progenitory BFU-E, CFU-E - erythroidní progenitory Embryonální hematopoéza (mouse) Dzierzak 2008 Embryonální hematopoéza (mouse) Primitive Pro-definitive Meso-deíinitive Meta-definitive Adult-definitve Myeloid Lymphoid-myeloid CFU-S HSCs Neonatal HSCs Dzierzak 2008 Embryonalni x adultni HSC (mouse) H-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-r— 6.5 7.5 8.5 9.5 10.5 11.5 12.5 Gastrulation I Circulation I Liver Colonization L/3VS L.L-----^ L........J Palis 1999 CFC - colony-forming cell (progenitor), CFU - colony-forming unit Developmental time Site Functional activity Primitve E7.5 Yolk sac3 Primitive erythroid E7.5-ES fO^sp) Yolksacb Primitive erythroid Pro-definitive E7.5-ESÍEHF-23P) Allantois3 Erythroid-myeloid progenitor E7.5-E9 f0-7sp) Allantois3 Erythroid-myeloid progenitor Ea.25 Yolk sac3 Erythroid-myeloid progenitor Ea.25 Yolksacb Erythroid-myeloid progenitor E9.5 Yolksacb Erythroid-myeloid progenitor E9.0 Placenta Erythroid-myeloid progenitor Maso-definitive E7.5-ES iO-Ssp) pSpa Erythroid-myeloid-lymphoid progenitor E7.5-E 6 i0-5sp) pSpa Mult i potent low-level repopulating pfogeni-tor Mete-definitive E9.0 Yolksacc Neonatal repopulating H3C E9.0 AGMC Neonatal repopulating H3C E9.0 Yolksacc CFU-S E9.0 AGMc-d CFU-S Adult-definitive EL0.5 Adult repopulating HSC EL0.5 Umbilical and vitelline vessel Adult repopulating HSC E10.5-E11 Placenta Adult repopulating HSC- Rozdíly mezi embryonálními a adultními HSC Intenzivně proliferující HSC pomalu proliferující / quiescentní HSC A Primitive streak I-1- PRENATAL Yolk sac, AG M Fetal liver POSTNATAL Bone marrow + + E7.5 E10.S ESI Runxl L E12.5 Birth 4 weeks 8 weeks I Sox17 Gti-1 I Tel/Etv6 [ Obnova embryonální hematopoézy Obnova adultní hematopoézy Jang& Sharkis2007 Transkripční faktor RUNX1 a vývoj HSC • Knockout pro RUNX1 u myší způsobuje embryonální letalitu E12,5. Embrya postrádají hematopoézu ve f etálních játrech. • RUNX1 důležitý pro vznik HSC z hematogenního endotelia Chronologie hematopoézy u člověka a myši hematopoéza/lýmfopoéza (dny) člověk myš embryonální vývoj (dny) -270 -21 žloutkový vak 18 7.5 dorsální aorta 27 9.5 thymus 40 11 jatra 42 11 slezina 48 13 kostní dřeň 77 15 cirkulace krevních buněk 24 8.5 v Časování cest lidských HSC 4-5 weeks AGM Region 9-10 weeks Thymus 5 weeks /-v Lii/er 2-3 weeks Yolk Sac ^__j 11-15 weeks Bone Marrow 15-18 weeks Lymph Node 74 weeks Spleen i "ä S2 Intenzita hematopoésy v průběhu embryogenéze u člověka yolk sac liver — spleen ■■■ lymph nodes - bone marrow i /A A\.<-