Bi8240 GENETIKA ROSTLIN doc. RNDr. Jana Řepková, CSc. repkova@sci.muni.cz Prezentace 01 Rostlinný genom Rostlinný genom Evoluční aspekty Velikost rostlinného genomu Organizace rostlinného genomu Jaderný genom – kódující, repetitivní a mobilní sekvence Chloroplastový genom Mitochondriální genom Studium funkce genů Srovnání genomů jednotlivých druhů rostlin Rostlinná buňka a genetická informace 800 mil. let mnohobuněčné organizmy 1. a 2. endosymbióza 1,2 miliardy let 3,8–4,2 miliardy let a důsledek! Evoluční linie rostlin Eukaryotické organizmy jsou stejně staré jako prokaryotické. Podstatná část genů člověka a jiných savců vykazuje vysokou homologii. Existuje určitý stupeň homologie mezi genomy různých organizmů Stupeň homologie závisí na jejich evoluční příbuznosti. Genetická informace rostlin Jaderná Chloroplastová Mitochondriální Specifické rysy Evoluční původ genomů Komunikace tří složek genetického aparátu Evoluce rostlin a rostlinných genomů Nejstarší fosilie rostlin cévnatých – 410 mil. let Původ krytosemenných – 200 až 250 mil. let Rostliny cévnaté Krytosemenné Kapradiny Jehličnany Kvetoucí Gingo CykasyŘasy Mechy Divergence 2 a 1děložné 160 až 240 mil. – Arabidopsis a rýže 200 mil. – Arabidopsis a rajčete 150 mil. Původ trav 100 až 65 mil. Nejstarší známé fosilie trav 50 až 70 mil. Nejstarší fosilie linie rýže 40 mil. Divergence v rámci čeledí – pšenice a žita 10 až 14 mil. – Arabidopsis a Brassica 12 až 19 mil. – Arabidopsis a Capsella rubella 6 až 10 mil. Navazuje evoluce kulturních rostlin! Začátek pěstování před 10 až 12 tis. lety Evoluce rostlin a rostlinných genomů Bylo domestikováno 230 plodin ze 180 rodů a 64 čeledí. Poaceae, Fabaceae, Brassicaceae, Solanaceae Fixace znaku 100 až 2000 let Evoluce a domestikace kulturních rostlin Kukuřice Zea mays teosinte kukuřice Z. mays ssp. parviglumis Pšenice Triticum aestivum http://www.newhallmill.org.uk/wht-evol.htm AA BB AABB DD AABB AABBDD AABB AABBDD Planá jednozrnka Kulturní dvouzrnka Pšenice Pšenice tvrdá Pšenice setá Mnohoštět 1 Mnohoštět 2 Planá dvouzrnka Plané Kulturní X X Planá jednozrnka Mnohoštět 1 Planá dvouzrnka Mnohoštět 2 Kulturní dvouzrnka Pšenice setá Pšenice tvrdá Šlechtění kulturních druhů je pokračující evoluce T. aestivum AABBDD AABB Triticale (AABBDDRR) (AABBRR) x Secale cereale (RR) Hlavní domestikační znaky 1. Omezení vypadávání semen – nerozpadavá vřetena klasu, nepukavost lusků 2. Synchronizace dozrávání 3. Minimalizace dormance 4. Jednoletost 5. Změny v rozmnožování – ztráta alogamie 6. Změny v chemickém složení a kvalitě užitečných orgánů 7. Bezsemenné plody Kukuřice Tga-1 Teosinte glume architecture – tvorba pevného osemení Některé geny pro domestikační znaky promotor 3 exony Lokus tga1 TF SBP squamosa-promoter binding protein (modře) Protein teosinta vs. kukuřice Záměna K → N lysin asparagin Tga1 tga1 Tb-1 Teosinte branched – architektura rostliny Transkripční faktor TCP (pouze u vyšších rostlin) – T Teosinte branched – kukuřice C Cycloidea – Antirrhinum P rýže – represe buněčného cyklu Dominantní mutace u kukuřice – potlačení větvení Pšenice Q – rozpadavost klasu, volná obilka Některé geny pro domestikační znaky Pleiotropie genu Q Rozpadavost vřetene klasu Tvar a pevnost plevy Délka klasu Výška rostliny Doba metání Zelená intron, červená exon, modrá 3´UTR Kulturní genotyp Q Exon – isoleucin, pozice 329 Planý genotyp q valin Ječmen5 genů: – vrs1 – šestiřadost klasu – Vrs1 – dvouřadost, chromozom 2H Některé geny pro domestikační znaky Transkripční faktor – leucinový zip Vrs1 exprese v laterálních primordiích Vrs1 suprimuje vývoj laterálních větví Mutace – tvorba fertilních klásků v šestiřadém fenotypu Rýže Sh4, qSh1 Shattering – uvolňování semen Některé geny pro domestikační znaky Rostlinné genomy 1. Velikost rostlinných genomů 2. Struktura rostlinných genomů a další poznatky Arabidopsis thaliana Fritillaria assyriaca Druh J/D n ploidie bp Arabidopsis thaliana D 5 2 1,25x108 Oryza sativa J 12 2 4,50x108 Brassica oleracea D 9 2 6,00x108 Lycopersicon esculentum D 12 2 1,00x109 Brassica napus D 19 2 1,23x109 Antirrhinum majus D 8 2 1,54x109 Vicia sativa D 6 2 1,60x109 Solanum tuberosum D 12 4 1,80x109 Zea mays J 10 2 2,70x109 Pisum sativum D 7 2 4,40x109 Nicotiana tabacum D 24 4 4,40x109 Hordeum vulgare J 7 2 4,90x109 Secale cereale J 7 2 9,50x109 Triticum aestivum J 21 6 1,60x1010 Fritillaria assyriaca J 1,20x1011 Záhada C-hodnoty DNA Extrémní počty chromozomů u rostlin Mitotická metafáze v kořenových špičkách A) trávy Zingeria biebersteiniana – 2n=4 B) Palmy Voanioala gerardii – 2n asi 600 Haplopappus gracilis: 2n = 4 Sedum suaveolens: 2n = cca 640 Velikost chromozomů se mezi druhy liší až 60x Evoluční mechanizmy ovlivňující velikost genomů rostlin Duplikace Spontánní delece a inzerce Aktivita transpozonů Přídatné chromozomy Expanze mikrosatelitů Expanze heterochromatinu (např. centromer) Důsledky → redundance genů u rostlin Arabidopsis je dávný tetraploid Jako zřejmě většina rostlin Duplikované úseky chromozomů tvoří 60 % genomu (67.9 Mb) Polyploidizace výrazně zvyšuje plasticitu genomu a zřejmě hrála významnou roli v evoluci rostlin (rostlinných genomů) Četné duplikace jsou i v genomu rýže B chromozomy a) Brachycoma dichromosomatica (mitóza, 2 B a 2 mikro-B chromozomy) b) Secale cereale (metafáze, 2 B chromozomy) c) Secale cereale (metafáze I meiózy, 1 B chromozom, 7 bivalentů) d) Secale cereale (1. mitóza v pylovém zrnu, nondisjunkce B chromozomu) B chromozom – struktura B chromozom Zea mays 4 oblasti nezbytné pro nondisjunkci Brachycoma dichromosomatica a) B chromozom b) Mikro-B chromozom Strukturní genomika 1. Velikost rostlinných genomů 2. Struktura rostlinných genomů a další poznatky Strukturní genomika – Projekt The Arabidopsis Genome Initiative 1996–2000 Nature, December 2000, Vol. 408, pp. 796–815, www.nature.com  Arabidopsis thaliana (1,25 x 108) – Projekt International Rice Genome Sequencing Project  Oryza sativa (4,50 x 108) – Populus trichocarpa – Vitis vinifera – Zea mays Genomika rostlin Genom Arabidopsis thaliana Projekt The Arabidopsis Genome Initiative 1996–2000 – Nature, December 2000, Vol. 408, pp. 796-815, www.nature.com Počet genů 25 498 D. melanogaster 13 601 genů C. elegans 19 099 genů Počet typů proteinů 11 601 Jedinečné geny 35 % Genové rodiny 65 % – s více než 5 členy 37,4 % Transpozony 10 % Nekódující sekvence 14 % Vzdálenost mezi geny prům. 4,5 kb 1 gen prům. 205 bp Porovnání jaderného a mimojaderných genomů A. thaliana Oryza sativa Current Opinion in Plant Biology 6(2), 2003 jádro plastidy mitochondrie velikost 125 Mb 154 kb 367 kb duplikace 60 % 17 % 10 % počet genů kód. proteiny 25 498 79 58 hustota genů – kb na 1 gen 4,5 1 6,25 geny s introny 79 % 18,4 % 12 % transpozony 10 % 4 % Sekvence jaderného genomu 1. Kódující – geny a genové rodiny 2. Nekódující (repetitivní a mobilní) Repetitivní – centromery – telomery – satelity – tandemové repetice  minisatelity (motiv 9 až 20 bp)  mikrosatelity (motiv 1 až 5bp) Jaderný genom Zastoupení repetitivní DNA v rostlinných genomech Geny složek genetického aparátu 1 blok genů 103 až 104 kopií, 7800 až 185 tis. bp transkripce jako 1 prekurzor postranslačními úpravami 3 typy rRNA pomerančovník 125 kopií, hyacint 32 tis. kopií Geny rostlinného genomu Organizátor jadérka Geny kódující 18S – 5,8S – 28S rRNA Geny pro 5S rRNA Geny tRNA Geny pro histony Další jednotka rDNA repetice Geny kódující proteiny Geny zásobních proteinů semen a hlíz – albuminy, globuliny, prolaminy, gluteliny, leguminy, viciliny, zeiny Geny pro enzymy fotosyntézy Geny pro stresové proteiny Geny pro leghemoglobin Geny rostlinného genomu Telomery DNA/proteinové struktury zajišťující stabilitu chromozómových konců žito – 12 až 18 % genomu 7 bp (TTTAGGG) 6 bp (TTAGGG) Centromery Primární konstrikce funkce při segregaci chromozomů rozpětí 30 až 140 bp celková délka až 1 Mb – kukuřice Kukuřice Ac/Ds (rodina transpozonů hAT) Mechanismus transpozice DNA transpozony Gen Colorless chromozom 9 Příčiny nestability fenotypového projevu – shrnutí Struktura elementů Ac a Ds u kukuřice Struktura elementu Ac u kukuřice Porovnání struktury elementu Ac s elementy Ds Mechanismus transpozice Přítomnost duplikace po excizi elementu Ac Cílové inzerční místo v genu Wx Kukuřice Zea mays Další identifikované transpozony Sp/m = En/I (rodina transpozonů CACTA) Mu (rodina TE Mutator) Hrách Pisum sativum Gen RUGOSUS Produkt genu enzym SBEI (Starch Branching Enzyme) Hledík Antirrhinum majus (rodina transpozonů hAT) Transpozony v genech pallida, nivea – Tam1 bílé pozadí, červené skvrny – Tam2 bílé – Tam3 slonovinové pozadí, červené skvrny – Tam7 regulační gen Deficiens Heterologní transpozice Arabidopsis, rýže, tabák, rajče, petúnie, len, mrkev, brambor, sója Význam a využití transpozonů Transpozonová inzerční mutageneze Transpozonový tagging Využití elementu Ac Transformace A. thaliana – gen pro rezistenci k streptomycinu inaktivován Ac. Po somatickém vyčlenění Ac – aktivace genu – zelené sektory. Ti plazmid Agrobacterium tumefaciens a infekce rostlinné buňky Retroelementy Schéma retropozice Gen Adh u kukuřice Srovnání struktury jednotlivých skupin retroelementů Struktura retrotranspozonů typu copia Výskyt retrotranspozonů a retropozonů Výskyt retrotranspozonů – Tabák Tnt1 počet kopií 100 – Huseníček Ta1 copia 100 – Kukuřice Ty1 copia 100 tis. 50–80 % genomu – Rýže Tos17 – Bob setý Ty1 copia 1 mil. – Hrách setý Ty3 gypsy 5 tis. Výskyt retropozonů – LINE – long interspersed nuclear element – kukuřice, rýže, pšenice, huseníček, tabák – SINE – short interspersed nuclear element Regulace exprese genů u rostlin Podle vývojového programu – geny jsou aktivní pouze v určitých pletivech a orgánech – orgánová a buněčná regulace Vlivy prostředí – geny jsou aktivní na základě určitého podnětu Orgánová a buněčná regulace Knotted1 kukuřice Knat1 Arabidopsis Rostlinné hormony Auxiny – buněčné dělení, prodlužování a diferenciace buněk Cytokininy – buněčné dělení, růst buněk, oddalují stárnutí buněk, otevírání průduchů Gibereliny – růst rostlin, regulace klíčení semen a kvetení Kyselina abscisová – regulace vývoje a klíčení semen, funkce průduchů, odpověď na vodní deficit Etylén – klíčení semen, růst klíčních rostlin, odpověď na poranění, zrání plodů Podněty z prostředí Charakterizace sekvencí potřebných pro expresi genu Reportér GUS Sucho ABA - + - + Exprese transgenu responzivního na podněty sucha – fúze promotoru genu s reportérovým genem GUS (detekovaný signál v průduchách). Exprese tohoto transgenu je indukována také ABA, která je součástí dráhy přenosu signálu z jádra do průduchů v podmínkách sucha. Transgenní A. thaliana Světlo Funkce: absorbce světla cytoplazmatickým proteinem fytochromem Konformační změny fytochromu – biologická aktivace a změny v dalších proteinech, některé z nich aktivují gen rbcS Aktivace genů pro klíčové enzymy fotosyntézy RBC – Enzym ribulózo-1,5-bifosfát karboxyláza – Rubisco – Multiproteinový komplex – Geny rbcS, rbcL Molekulární řízení transkripce genů Několik cis-elementů promotoru genu Adh1 kukuřice Regulují transkripci genu jako odpověď na nedostatek kyslíku v prostředí Element ARE (anaerobic response element) Transkripční faktory Funkce chromatinu v genové expresi histonová acetyltransferáza deacetyláza Matrix attachement regions Smyčkové domény chromatinu 5 až 200 kb MAR bohaté na motiv AT (200 až 1000 bp) Funkce ve strukturní organizaci genomu Usnadňují transkripci genů nebo skupin genů prostřednictvím tvorby méně kondenzované struktury chromatinu MAR obklopují kódující oblasti genů, jsou spojeny s regulačními elementy Chloroplastová DNA (cpDNA) Dvouřetězcový kružnicový chromozom Lokalizace – chloroplasty v mnoha kopiích Velikost 120 až 160 kb Struktura Mimojaderný genom Sekvenovaná cpDNA – Nicotiana tabacum – Marchantia polymorpha (porostnice mnohotvárná) – Oryza sativa – Triticum aestivum – Zea mays – Pinus thumbergii – Spinacia oleracea – Medicago truncatula – Lotus japonicus Epifagus Organizace cpDNA Uspořádání genů chloroplastového operonu a transkripce Koordinace buněčných kompartmentů Mitochondriální DNA (mt DNA) Několik subgenomových kružnicových struktur Velikost Lokalizace Struktura Subgenomové struktury a jejich tvorba Tři typy tvorby subgenomových struktur Geny mt genomu První osekvenovaná mt DNA Rýže – cp DNA – mt DNA Transport proteinů do organel Transport proteinů přes lipidické dvojvrstvy umožňují chaperony. Vážou polypeptidy a transportují je přes póry v cytoplazmatické membráně. Udržují proteiny v rozmotaném stavu na jedné straně membrány a pomáhají jim vytvářet prostorovou strukturu na straně druhé. Proteiny kódované cpDNA i jadernými geny a transport v rámci chloroplastů Mechanizmus transportu proteinů z cytoplazmy do chloroplastů Chaperony v cytosolu + signální sekvence Transport do stromatu a do lumen thylakoidů Transportní aparát přes Membrány: – TOC Translocon of the outer membrane of the chloroplast – TIC Translocon of the innermembrane of the chloroplast+rozpoznávací částice SRP + GTP rozdílné pH + ATP Transport proteinů do mitochondrií Cytoplazma: preprotein + signální sekvence uchopeny systémem chaperoninů a pomocných proteinů, dopraveny k vnější mit. mem. TOM (Translocase of the Outer Membrane)/TIM (Translocase of the Inner Membrane) Vnitřní strana: chaperonin HSP70, odštěpení signální sekvence pomocí proteinázy Vesmír 2000 Srovnání chloroplastové RNA polymerázy eukaryot a prokaryot Sekundární struktura rRNA v chloroplastech tabáku Menší podjednotka ribozomů 16S rRNA se 4 doménami rRNA chloroplastů Větší podjednotka ribozomů 23S a 4,5S rRNA se 6 doménami; doména V je místem pro tRNA k podjednotce 50S tRNA chloroplastů Cytoplazmatická tRNAMet fazolu Chloroplastová tRNAMet Zralá chloroplastová mRNA Funkce genů Funkční genomika – Projekt „Arabidopsis 2010 Program“ 2001–2010 – Plant Physiology, June 2002, Vol. 129, pp. 394-437, www.plantphysiol.org – Nástroje studia funkcí rostlinných genů Genomika rostlin Nástroje funkční genomiky Mutageneze Typy mutagenů – chemomutageny  přístupy přímé i reverzní genetiky – fyzikální mutageny – biologické mutageny  T-DNA  transpozony  přístupy reverzní genetiky  retroelementy Fenotyp gen/mutace T-DNA tagging Infekce rostlinné buňky při transformaci A. tumefaciens Inzerční mutageneze Model tvorby jednořetězcové T-DNA A. tumefaciens Metody transformace rostlinných pletiv Semena, embrya, listové disky, kořeny, protoplasty, vakuová infiltrace – Arabidopsis thaliana – Medicago truncatula Markerové geny Selektovatelné – NPT (neomycin fosfotransferáza) – HPT (hygromycin fosfotransferáza) – BAR (rezistence k herbicidu fosfinotricinu) Signální = reportérové – GUS, GFP Exprese GFP Funkce genu GUS Identifikace inzerčních míst přístupem reverzní genetiky 1. Inzerční mutageneze 2. Organizace rostlin 3. Izolace DNA 4. Specifická PCR 5. Inzerce v genu X rostliny I, c, 5 6. Klonování genu inzert inzert specifické primery Ad 6) Izolace rostlinného genu Inzert Zkratky restriktáz R EcoRI Sm SmaI X XbaI Využití T-DNA mutageneze Past na geny Specializované vektory Past na regulační sekvence – promotor Specializované vektory Past na regulační sekvence – zesilovač Specializované vektory Aktivační vektor pPCV6NFHyg Specializovaný vektor Inzert RB Selekční marker Zesilovač LB Rostlinný gen Výsledky inzerční mutageneze Modelové druhy Arabidopsis – velké kolekce inz. mutací od 90. let – SALK: asi 150 tis. T-DNA linií (ekotyp Columbia) – GABI: 60 tis. (ekotyp Columbia) – Feldmann: 4,9 tis. (ekotyp Wassilevskaja) – Semenná banka ABRC: 175 tis. (ekotyp Columbia) Teoreticky 180 tisíc nezávislých inzercí s 95% pravděpodobností detekce určité specifické inaktivované alely genu o velikosti 2,1 kb. Redundance genů v genomu Mutace letální, nebo vedou ke sterilitě v homozygotní konstituci. Proto je tato pravděpodobnost jen 80%. Doposud nebylo asi 2000 genů zasaženo žádnou inzercí. Izolace genů a jejich funkční charakterizace Přímá genetika – několik desítek genů Gl1 vývoj trichomů 1989 Gi signály fytochromů 2000 Dfl1 kontrola auxinů Reverzní genetika – hlavní podíl identifikovaných genů Genová rodina ACTIN celkem 63 genů Aktivační tagging - asi 20 genů Speciální typy vektorů Komplementace Kulturní duhy Kukuřice čtyři rodiny retrotranspozonů: Huck, Ji, Opie a Zeon. Transpozony – Ac/Ds, Mu více než 100 kopií – kolekce inz. linií (45 tis.) Izolace genů 1. gen bronze – pro klíčový enzym syntézy antokyanů An1, Zag1 – vývoj květů Rýže Transpozony Ac/Ds kukuřice T-DNA 20 tis. linií, 25 tis. inzercí v genech Retrotranspozony – Tourist, Stowaway, Gaijin, Tos17 Klasická mutageneze – chemomutageny TILLING (Targeting Induced Local Lesions in Genome) Detekce bodových mutací Detekce konkrétních genů Metodický přístup reverzní genetiky Detekce polymorfizmů v přírodních populacích (ekotilling) Arabidopsis thaliana, kulturní plodiny (ječmen) Další metody identifikace funkcí rostlinných genů Homologní rekombinace „Gene targeting“ U rostlin se využívá v menším rozsahu Techniky založené na umlčování specifických genů Především RNA interference A. thaliana – Projekt AGRIKOLA – Arabidopsis – Genomic – RNA Interference – Knock-Out – Line Analysis GST GST Tvorba 20 tisíc RNAi konstruktů Z kolekce 21 120 GST (Gene Specific Tag) Arabidopsis Schéma RNA interference Genetika: Snustad, Simmons, Kap. 20 Srovnávání genomů Srovnávací genomika: – Brassicaceae:  Arabidopsis – Brassica oleracea 57% – Capsella rubella 85% – Solanaceae:  rajče – brambor, také tabák, paprika – Poaceae:  rýže – ječmen, pšenice, kukuřice – Fabaceae – Malvaceae Genomika rostlin Genomy rostlin se podobají Paterson et al., Plant Cell 12: 1523–1539, 2000 Kolineární oblasti genomů Arabidopsis thaliana a A. lyrata Syntenie = přítomnost orthologních lokusů u dvou druhů na stejném chromozomu A’ B’Species A Species B Ancestral Species C’ A” B” C” A B C Kolinearita = skupina lokusů je u dvou druhů přítomna ve stejném pořadí A’ C’Species A Species B Ancestral Species B’ C” B” A” A B C Orthology vs. paralogy Orthologní geny = geny u různých organismů, které jsou přímými potomky genu přítomného u společného předka těchto organismů Paralogní geny = geny, které se duplikovali u daného druhu Species A Species B Ancestral Species Gene A Gene A” Gene A’ Species A Species B Ancestral Species Gene A Gene A” Gene A’” Gene A’ Paralogous genes Makrosyntenie vs. microsyntenie Makrosyntenie (daná společným původem), makrokolinearita – konzervativní uspořádání genů v určité oblasti chromozomu v rozsahu mnoha Mb, geny A, B, C – může být maskována výraznými lokálními změnami v pořadí i zastoupení genů (mikrosyntenie není detekována), mikrokolinearita A B C A’ B’ C’ o t u w x q n k v g A B C A’ B’ C’ w t u w x x u t v v Vlevo: – nejen geny A, B, C syntenní, – mikrosyntenie Vpravo: – pouze geny A, B, C syntenní – mikrosyntenie není Porovnání genetické mapy rajčete a lilku Syntenní mapy rajčete a bramboru se liší 5 paracentrickými inverzemi Srovnávací genomika - obiloviny Názorné přiřazení homologních bloků Vysoce konzervovaná struktura genomů obilovin Srovnávací mapa genomů 7 obilovin Přilehlé segmenty chromozomů žita Kolinearita (syntenie) genomů lipnicovitých telomery centromery Genomy obilovin a asociované znaky Kolineární úseky se liší především zastoupením repetitivní DNA Genomy „brasik“ B. nigra n=8 B. oleracea n=9 B. campestris n=10 Výukovou pomůcku zpracovalo Servisní středisko pro e-learning na MU http://is.muni.cz/stech/