Protokol Vyšetření slin na přítomnost antigenů krevních skupin Teorie: Antigeny systému ABO (H) se v lidském organismu vyskytují ve dvou formách: První – v alkoholu rozpustné Ag jsou vázány na membrány téměř všech buněk těla, včetně erytrocytů; druhou – tvoří metabolický produkt první skupiny-ve vodě rozpustné Ag přítomné přibližně u 77% lidské populace. Metabolická přeměna je řízena geny Se/se, zcela nezávislými na genech ABO určujících příslušnost ke krevní skupině. Dominantně recesivní kombinace sese zajistí dokonalý rozklad vázaných Ag a tedy nepřítomnosti Ag v tělních tekutinách. Tito jedinci se označují jako nevylučovatelé (nonsekretoři). Jedinci s dominantní alelou Se v genotypu mají Ag přítomny v tělních tekutinách a označují se vylučovatelé (sekretoři). Cíl: Zhodnocení výskytu vylučovatelů a nevylučovatelů ve skupině studentů Metoda: Adsorpčně inhibiční metoda (AI) jejímž principem je inhibice hemaglutinace, je založena na vysycení vazeb míst na Ag přítomných ve slinách přidaným aglutinačním sérem vhodného titru a následným stanovením množství nenavázaných Ab přidáním určitého množství (20µl) 5% suspenze odpovídajících erytrocytů. Intenzita aglutinace je nepřímo úměrná množství skupinových substancí ve slinách. Absorpčně inhibiční metoda je složena ze dvou fází: 1. absorpce. K vyšetřovanému vzorku (antigenu) se dodá známé množství protilátky, do jde k vazbě antigen-protilátka. 2. aglutinace. V této fázi je zjišťována kvantita nenavázaných protilátek poklesem jejich titru. Pokles se projeví inhibicí aglutinace přidaným náplavem známých krvinek o známém objemu a koncentraci. Použití: Hemaglutinačně inhibičního testu se hojně užívá k průkazu slabých A a B aglutinogenů a při zjišťování ABO substancí v buňkách lidských tkání, ve spermiích, na leukocytech, trombocytech a v krevních skvrnách. Materiál: Komerční séra (EXBIO Olomouc) anti-A (IgM) monoklonální1, anti-B (IgM) monoklonální1, lektin anti-H; náplav diagnostických erytrocytů A,B,O; destičky s otvory, fyziol. roztok 0,85% (0,15 mmol/l) NaCl, vodní lázeň na 100%C Postup: Příprava sér: Jako vhodná ředění sér byla experimentálně vybrána 1:8 pro anti-A, 1:32 pro antiB a 1:2 pro lektin anti-H. Příprava 5% suspenze (náplavu) diagnostických erytrocytů (čisté krvinky bez bílkovin plazmy a séra): připravená kapilární krev skupin A, B, O. 100 ml krve (krevní masy je obaženo v 50%) se v označených zkumavkách dvakrát promyje fyziologickým roztokem a zcentrifuguje do 1500 ot/min. Po odstranění supernatantu se přidá 900 ml fyziologického roztoku. Bromelin hydrolyzuje peptidické vazby v membránách erytrocytů a tímto způsobem membránu „natráví“. Z fyzikálního hlediska se jedná o snížení povrchového napětí membrány. Důsledkem je zesílení některých interakcí antigen – protilátka, v našem případě by se účinkem bromelinu měla zvýšit intenzita aglutinace erytrocytů. Krvinky natrávené bromelinem by tedy měly být citlivější k působení příslušných protilátek, tj. aglutinace by se měla projevovat i při větším zředění protilátek, než tomu bude u krvinek neovlivněných bromelinem. Postup jen pro krevní skupinu 0 1. )fyziologický roztok pro červené krvinky – 0,85% NaCl 2.) 5% suspenze erytrocytů krevních skupin A, B, O ve fyziologickém roztoku – již připraveno 3.) 5% suspenze erytrocytů hydrolyzovaných (natrávených) bromelinem – nutno připravit: - do eppendorfek s 20 μl 0,5% bromelinu přidáme 180 μl erytrocytární suspenze (z bodu 2), tj. 10x zř. - zkumavky inkubujeme 10 – 15 minut při 37°C. - centrifugujeme při 1000 ot., cca 30 sec, opatrně odsajeme supernatant, k sedimentu erytrocytů na dně eppendorfky přidáme 180 μl fyziologického roztoku, opět centrifugujeme a odsajeme, celkem 3 x, čímž ze suspenze erytrocytů důkladně vymyjeme bromelin. Po posledním promytí přidáme 180 μl fyz. roztoku a tímto máme připravenou 3% suspenzi natrávených erytrocytů. Zpracování slin: Sliny vyšetřovaných osob se zahřívají v čisté skleněné nádobce v množství asi 1 ml při teplotě 100 °C ve vodní lázni po dobu 10 minut z důvodu inaktivace enzymů, aby nedošlo k natrávení, a tím snížení množství skupinových substancí. Varem ztratí sliny svou vazkost, stanou se tekutějšími a lépe se zpracovávají. Sliny se pak centrifugují při 2000ot./min po dobu 10 minut, tím se odstraní koagulovaný hlen a buněčný detrit. Čirá tekutina se ze supernatantu pipetuje do sterilní zkumavky. Samotný pracovní postup: Sliny naředíme fyziologickým roztokem na základní ředění 1:100. Do první a druhé zkumavky v každé řadě (A, B, H) dáme po 30 ml naředěných .slin. Do všech zkumavek kromě prvních (tzn. do 2., 3. a 4.) pipetujeme 30 m1 fyziologického roztoku a provedeme titraci 30 ml s ředicím koeficientem 2, tzn. obsah 2. zkumavky promícháme a přeneseme 30 ml do 3. zkumavky, promícháme, přeneseme 30 m1 do 4. zkumavky, promícháme a odebereme 30 m1 i z této poslední zkumavky. Totéž provedeme pro řady B a H. Výsledná ředění slin ve zkumavkách jsou 1:100, 1:200, 1:400 a 1:800. Do 4 zkumavek řady A přidáme po 20 ml séra anti-A 1:8, do zkumavek řady B po 20 ml séra anti-B 1:32, do zkumavek řady H po 20 ml séra anti-H 1:2. Směs promícháme a ponecháme při laboratorní teplotě po dobu 20 minut. Poté přidáme 20 ml 5% suspenze erytrocytů, vždy příslušných danému séru, tzn. do zkumavek řady A erytrocyty skupiny A, do zkumavek řady B erytrocyty B, do zkumavek řady H erytrocyty O. Zkumavky jemně promícháme a necháme 10 minut odstát při laboratorní teplotě. V jednotlivých řadách skupin A, B a H je tedy množství sér i erytrocytů konstantní, liší se pouze množství slin, a to sestupně. Dalším krokem je centrifugace všech zkumavek při 1000 ot./min po dobu jedné minuty. Anti-A a anti-B jsou absorbovány snadno, centrifugace je dostatečná. Protilátky anti-H nereagují tak dobře, proto je třeba zkumavky řady H protřepat a znovu centrifugovat 1 minutu při 1000 ot./min. Obr: Schéma vyšetření: pro každý antigen čtyři ředění slin 30µl slin 1:100 20µl antiA 1:8 20µl ery A 5% 30µl slin 1:200 20µl antiA 1:8 20µl ery A 5% 30µl slin 1:400 20µl antiA 1:8 20µl ery A 5% 30µl slin 1:800 20µl antiA 1:8 20µl ery A 5% 30µl slin 1:100 20µl antiB 1:32 20µl ery B 5% 30µl slin 1:200 20µl antiB 1:32 20µl ery B 5% 30µl slin 1:400 20µl antiB 1:32 20µl ery B 5% 30µl slin 1:800 20µl antiB 1:32 20µl ery B 5% 30µl slin 1:100 20µl antiH 1:2 20µl ery 0 5% 30µl slin 1:200 20µl antiH 1:2 20µl ery 0 5% 30µl slin 1:400 20µl antiH 1:2 20µl ery 0 5% 30µl slin 1:800 20µl antiH 1:2 20µl ery 0 5% Tab.: Schematicky znázorněné obsahy 12 zkumavek při popsaném postupu vyšetření slin Po centrifugaci jsou zkumavky připraveny k hodnocení (odečítání). Výhodou aglutinačně inhibičního testu je, že negativní výsledek je dán přítomností aglutinace, a tudíž máme kontrolu, že jsme umístili do zkumavek sérum a erytrocyty stejné specifičnosti. Odečítání a hodnocení výsledků: Je-li ve vyšetřovaných slinách vyšetřovaný antigen a přidané erytrocyty se neshlukují, značí to, že antigen slin vysytil diagnostický titr aglutininu a můžeme s určitostí říci, že jde o sliny vylučovatele. Jde-li o sliny nevylučovatele, přidané krvinky jsou diagnostickým sérem aglutinovány. Při vizuálním hodnocení se zaznamená pro každou zkumavku stupeň aglutinace podle následujících pravidel ++++ kompletně shluklý kompaktní sediment +++ sedimentované erytrocyty se po jemném poklepání na dno zkumavky rozdělí na 2-4 nepravidelné hrudky ++ sediment se rozpadne na víc drobných částí + sediment zůstane po poklepání na dno zkumavky ve tvaru jemně zrnitého písku - negativní reakce, sedimentované erytrocyty se volně zvíří ve fyziologickém roztok Průběh reakce: Ag(sliny)+Ab+Ag (ery) = Ag-Ab+Ag-Ab pokud je člověk vylučovatel, výsledkem je náplava červených krvinek, slabá nebo žádná aglutinace Ab+Ag (ery) → Ab-Ag = pokud je člověk nevylučovatel, Ab reagují jen s erytrocyty a vznikne aglutinace silná