Protokol

Imunodifúze podle Manciniové

Materiál: gel (1,2% agarósa), Borat-fosfátový pufr, automatické pipety, víčko ELISA, inkubátor,
fyziologický roztok, destilovaná voda, varné sklo, vařič, odsávačka s korkovrtem, protilátky Ab
(různé typy, např.:SwaHu: Swine antibody against Human serum, HAHu: Horse Antibody against Human
serum), antigeny Ag (Lyonorm, Human control serum), mikrozkumavky typu Eppendorf

Teorie: Imunodofúze je jednou z nejstarších imunochemických metod. Dnes tuto metodu nahradily
v rutinních laboratořích automatizované systémy nefelometrické a turbidimetrické. Výhodou této
metody je velká jednoduchost, nevýhodou velká pracnost, vyžaduje určitou zručnost a má poměrně
omezený rozsah při kvantitativním měření. Princip metody je založen na tvorbě komplexů
antigen-protilátka v prostředí agarósového gelu po difúzi.

Existuje několik modifikací této metody: např. podle Ouchterlonyho a podle Manciniové, jež jsou
nejčastěji využívány.

Modifikace podle Ouchterlonyho je založena na difúzním protisměrném pohybu molekul antigenu a
protilátky. V místě setkání antigenu a protilátky vzniká v gelu precipitát, který je důkazem
přítomnosti hledaného antigenu nebo protilátky (kvalitativní stanovení).

Modifikace podle Manciniové je založena na radiální difúzi antigenu v gelu s rozpuštěnou
protilátkou nebo na radiální difúzi protilátky v gelu s rozpuštěným antigenem. V gelu vznikají
precipitační prstence. Gel se nechá ve vodní lázni vytemperovat na teplotu 56°C, aby nedošlo
k denaturaci protilátky. Následně se přidá protilátka, která se důkladně vmíchá do gelu
(kvalitativní i kvantitativní).

Cíl: Připravit precipitační prstence po difúzi protilátky, zatímco antigen je rozpuštěn v gelu a
zjistit koncentraci neznámého vzorku.

Postup:
 1. Očistěte destičku 95% etanolem
 2. Připravte 1,2% agarosový gel pro celou skupinu (agarósa + Borát-fosfátový pufr) a nechte
vychladit na 56°C a přidejte antigen v množství 400µl Ag / 100ml gelu (17x ředěné). Vytemperovat
odměrný válec s ryskou na 30ml (60°C)

3.      Ihned nalejte pomocí válce 30ml gelu na destičku a nechte gel ztuhnout

4.      Pomocí odsávačky a šablony vytvořte v gelu jamky podle obrázku 3

5.      Připravte si ředění protilátky 1:0, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 plus vzorek a blank

6.      Napipetujte 40µl protilátky do jamek v různém ředění podle obrázku

7.      Nechte inkubovat při lab. teplotě 48 hodin ve vlhké komůrce

Barvení

8.      Barvěte amidočerní (75ml CH₃OH, 8ml CH₃COOH, 0,08g amidočerní), pak promyjte
v diferenciačním roztoku (CH₃OH : CH₃COOH = 10:1)

9.      Nakonec promyjte v dest. vodě


      ¨

Obr. č. 1:   Destička podle Manciniové

Vyhodnocení:      Pokud odpovídá hledaný antigen Ag protilátce Ab, vznikne precipitační linie ve
tvaru kruhu, kdy změříte druhou mocninu průměru dle přiloženého pravítka Sevak. Podle výsledku
koncentrací ze standardní křivky si vytvoříte graf a odečtete z něj koncentraci neznámého vzorku.