Změny v mozku na základě zkušeností - vliv prostředí na strukturu a funkci mozku - “stárnutí” mozku – často klesá schopnost těchto změn - Kritická perioda – doba, do kdy je ještě vliv prostředí účinný - zlom – náhlý nebo pozvolný = doba, po kterou je určité chování výrazně náchylné (nebo dokonce vyžaduje) na specifický vliv prostředí, aby byl umožněn normální vývoj Příklad – husy 1. den po narození následují 1. větší pohybující se objekt (i neživý) - ireversibilní proces - kritická perioda je méně než jeden den - pokud malé husy nejsou vystaveny tomuto stimulu 1. den – problémy ve vztahu potomek-rodič Zpěvní ptáci - zpěv pro přilákání pozornosti opačného pohlaví - učí se při dospívání poslechem v hejnu od “učitelů”, napodobuje je, trénuje – až se to naučí - jakmile pohlavně dospěje bez předchozího stimulu – “abnormální” zvuky Vývoj jazyka - u lidí nutná dlouhá postnatálni “zkušenost” a trénink pro správný vývoj - tato zkušenost a trénink ale musí proběhnout v raném dětství - “feral children” - schopnost naučit se cizí jazyk bez přízvuku a gramaticky správně do 7-8 let věku - pak dramatický pokles - nicméně změny na základě zkušeností i u dospělého mozku Učení a paměť Učení – proces získávání nových informací Paměť – je schopnost uchovávat a používat informace Mozek získává, zpracovává a ukládí informace a tato informace může být následně využita aby ovlivnila naše chování - důsledkem je změněná odpověď na opakovaný stimulus Neurobiologie – determinace oblastí mozku které důležité pro učení a paměť - determinace změn synapsí vlivem zkušenosti - určení molekul které ovlivňují paměť Modelové organismy – schopnost změnit své chování na základě získané informace (na základě události, situace, místa, objektu, chování …) Učení a paměť je komplexní fenomén – zahrnuje celý organismus - snaha o zjednodušení a o korelace s elektrofyziologickými a molekulárněbiologickými proces v částech CNS, které se zde uplatňují Hledají se změny v CNS, které se odehrávají během učení a vyvolání paměti A tyto změny se hledají na izolovaných neuronech a neurálních drahách/sítích … a to v oblastech CNS, které jsou pro tyto procesy důležité Učení a paměť Učení a paměť Hypotéza: - síla synaptických spojení – je plastická (modifikovatelná) – zkušenost – ovlivnění síly synapsí Tedy – síla synapse je základní jednotkou ukládání informací Správné chování – naučeno protože důsledek úspěšného chování posílil spojení mezi stimulem a správnou odpovědí A naopak Špatná reakce – v důsledku vede k zeslabení spojení mezi stimulem a správnou odpovědí Nervová plasticita = schopnost neuronů modifikovat své biochemické a morfologické vlastnosti jako odpověď na externí stimuly - predevším regulací síly synapsí - tvorba a zánik synapsí Jakékoli změny synapsí = synaptická plasticita – dva typy: krátkodobé změny účinnosti synapsí (obvykle posílení zapojením iont. kanálů, proteinkinaz, ...) → aktivace postsynaptických receptorů – obvykle rychlé změny (hodiny) dlouhodobé změny – strukturální modifikace existujících synapsí a tvorba nových – závislé na aktivaci genové exprese, pravděpodobný mechanismus dlouhodobé paměti Synaptická plasticita Funkční synaptická plasticita - změna účinnosti již existujících synapsí např. dlouhodobá potenciace (LTP) – vysoká frekvence vzruchu v hipokampu → zesílení synaptické síly spojů jež pouzivají glutamát jako neurotransmiter - postsynaptická buňka aktivuje blokované glutamát. receptory - presynaptická buňka zvyšuje uvolňování glutamátu Morfologická synaptická plasticita - změna struktury synapsí nebo tvorba nových – počet váčků, velikost aktivní zóny, velikost synaptického knoflíku, velikost postsynaptické struktury, počet a velikost postsynaptických receptorů Zvětšení synaptické struktury - inkorporace nové membrány: - snížení endocytózy váčků z membrány po uvolnění neurotransmiteru - fůze jiných váčků s membránou – např. plasmalema prekurzor vesicles (PPV) tvorba nových synapsí – kontrola geny regulujícími expanzi membrány, skladování a fůzi váčků (SNARE a SNAPs) Učení a paměť 2 základní modelové systémy pro studium změny síly synapsí – jednoduchý systém a LTP Jednoduchý systém – reflex u Aplysia californica Habituace Senzitizace Short-term habituace – udělám-li habituaci jednou, po krátké pauze po dotyku siphonu je reakce skoronormální Long-term habituace – opakuji-li habituaci několik dní– po krátké pauze je reakce na dotek siphonu stále snížena Nervová plasticita - Aplysia Nervová plasticita - Aplysia Short-term senzitizace - prodloužení trvání depolarizace fosforylací/inhibicí draselných kanálů – uvolní se více glutamátu Nervová plasticita – Aplysia Long-term senzitizace Ubiquitin-hydroláza → degradace regulačních podjednotek PKA → dlouhodobá aktivita PKA Long-term potenciace v hipokampu LTP - hipokampus – u savců – učení a paměť - zde již nemožno na jeden neuron proto měřeny skupiny neuronů - v jednotlivých částech hipokampu 1. pokus: - silný impuls zesiluje odpověď na slabý impuls LTP LTP LTP - pokusy dělány původně na živých zvířatech ale lze i in vitro - na Schafferových kolaterálách v hipokampu - různé kombinace různě silných stimulů LTP – neurotransmiter glutamát (hlavní excitační neurotransmiter v mozku) - glutamátové receptory LTP NMDAR – studie s inhibitory – jejich fce důležitá pro vznik ale nikoli pro udržení LTP - propouští Na+, ale při určitých podmínkách i Ca2+ ionty - vazebné místo pro glutamát i pro Mg2+ ionty (je v póru) – Mg2+ musí být odstraněn, aby prošel Ca2+ - Mg2+ odstraněn, když se naváže glutamát a když doje k depolarizaci – k depolarizaci dojde diky AMPA-glutamátovým receptorům LTP - asociativní učení (Pavlovovské reflexy) - dva nezávislé inputy blízko sebe (časově) – opakovaně – pak i CS vyvolá reakci - asociativita – sousední synapse silně stimulované – “asociativní” depolarizace - CS – glutamát na NMDAR - US – depolarizace membrány – otevření NMDAR pro CS - silný podnět umožní reakci na slabý podnět LTP Ca2+ influx je klíčový pro vznik LTP – funguje jako druhotný přenašeč – posttranslační modifikace - transkripce, translace - zvýšená funkce AMPAR – jejich vyšší počet - tiché synapse nemusí mít AMPAR LTP Ca2+ – váže na kalmodulin – aktivace CaMKII CaMKII – hodně v PSD zóně, inhibice – zablokovani LTP - regulace aktivity i transportu AMPA receptorů - důležitá pro indukci i udržení LTP (studie s inhibitory) - schopnost autoaktivace - v LTP i další kinazy – PKA, PKC … LTP AMPAR – různá kombinace podjednotek GluR1 až 4 - GluR1 hodně v LTP – fosforylována CamKII, - vyšší propustnost pro Ca2+ ionty - GluR2 – naopak snižuje aktivitu GluR1 - v klidu v hipokampu – AMPAR hlavně z GluR2 a 3 - po synaptické stimulaci vedouci k LTP – hodně AMPAR bez GluR2 LTP Fosforylace GluR1 – aktivace PKA – AMPAR inzerce do extrasynaptického prostoru, následně Ca2+ z NMDAR – aktivace PKC a AMPAR do PSD zóny, GluR1 AMPAR v LTP po čase nahrazeny GluR2 AMPAR, ale jejich počet v PSD zóně je mnohem větší než před LTP stimulaci LTP LTP – trvání závisí na parametrech stimulu slabý stimulus – krátkodobá LTP (hodiny) (S-LTP) silný stimulus – dlouhodobá LTP (dny až měsíce) (L-LTP) S-LTP – postranslační modifikace (nikoli produkce nových proteinů) L-LTP – hypotéza genomové signalizace (stimul – signalizace – transkripce – preoteosyntéza – L-LTP) LTP CREB – TF – KO myš – ne L-LTP (ale ano S-LTP) drozofila s mutovaným CREB – poruchy paměti CREB – aktivace fosforylací – celá řada signálních drah vede k této fosforylaci LTP inhibitory PKA a ERK – blokují L-LTP ERK aktivován neurotrofními faktory přes RTK CaMKIV LTP L-LTP – je potřeba transkripce a translace - nicméně translace prakticky ihned po indukci L-LTP - mRNA už tam musí byt přítomna - prvotní translace probíhá lokálně v dendritech - je tam ER, Golgi, mRNA – inhibitory proteosyntezy jen do somatu – pořád dochází k indukci LTP (měřeno elektrodami na preparovaných Schafferových kolaterálách), pokud inhibitor do dendritu – inhibice indukce L-LTP Genomická signální kaskáda – nové proteiny až za 30 – 40 minut Lokální proteosyntéza – nové proteiny během minut Synaptická plasticita časové fáze Synaptická plasticita - molekuly uplatňující se v ranné fázi LTP Proteinkinázy PKA, PKG, ERK, PKC, CamKII – jejich inhibitory prevence LTP tyrozin-kinázy– src, fyn, pyk2 - KO myši rovněž poruchy LTP - receptory pro neurotransmitery - fosforylace – změna účinnosti, internalizace, receptor recruitment na membránu - fosforylace cytoskeletu – změny morfologie – změny architektury synapsí Nitrosylace Glykosylace LTP se účastní také presynaptický terminál – zvýšené uvolňování neurotransmiterů ← uvolnění retrográdního přenašeče z postsynaptického terminálu (oxid dusnatý, kyselina arachidonová) → fosforylace proteinů v presynaptickém terminálu Synaptická plasticita Fáze II – syntéza nových proteinů - zvýšená translace - zvýšená stabilita mRNA - CamKIIalpha v LTP CamKIIalpha mRNA nejen v těle neuronů ale i v dendritech (lokálně zvýšená stabilita?) Fáze III – zvýšená transkripce, geny ranné a pozdní fáze, role transkripčních faktorů Synaptická plasticita – fáze III – geny ranné fáze – zvýšená transkripce 15-45 minut po stimulu - jejich syntéza nezávisí na syntéze jiného proteinu Transkripční faktory • bZIP family (leucin zip) – fos, jun, CREB, C/EBP • zinc-finger proteiny – zif/268, NGF-IA, Krox24 • Rel proteiny - NFKB • CREB – KO myš – nemá pozdní fázi LTP - problémy s učením • zif/268 – KO myš – nemá pozdní fázi LTP - problémy s učením Ostatní • - růstový faktor beta-activin, tPA, cox2 • tPA KO myši – deficit v indukci LTP v některých regionech hipokampu Synaptická plasticita – fáze III geny pozdní fáze – zvýšená transkripce 2-3 hodiny po stimulu – nárůst patrný i po 2 dnech • vesicle associated proteins – syntaxin, synapsin • receptory neurotransmiterů – NMDA, mGluR5 • růstové faktory – BDNF, IGF-1 • proteinové kinázy – ERK2, PKC • proteázy a jejich inhibitory • adhezivní molekuly morfologická remodelace synapsí • regulátory cytoskeletu LTP Jaké mRNA v dendritech translatovány: – CaMKII, , GluR1 a GluR2, eukaryotický elongační faktor 1A … Klíčová otázka – neuron – více synapsí – některé aktivní a některé ne – jak zajištěno že mRNA (protein) dopravena k té aktivní synapsi Synaptic tagging hypothesis – po stimulaci synapse – generován tag, který označí aktivní synapsi, ke které je potřeba dodat materiál (ten tag nejspíš lokálně syntetizovaný protein (skupina proteinů) Možné tagy/signalizace – profilin, CamKII, Homer 1a, PAK, ERK1/2 …. – důležitý aktinový cytoskelet a vazba na něj Ca2+ v LTP - nárůst Ca2+ iontů v cytoplazmě je klíčový - zdroje Ca2+ - extracelulární - intracelulární (ER – rychle uvolnění a načerpání Ca2+) - IP3R (aktivovány IP3 – např po aktivaci mGluR1) - RyR receptory (regulace influxem Ca2+) Ca2+ v LTP na indukci LTP se mohou podílet všechny 3 možné zdroje Ca2+ (RYR, IP3R, vdCC) - každý indukován jiným signálem IP3R i v dendritech, vdCC a RYR asi spíš fungují v somatu - agonista IP3R – zesílení LTP, indukce lokální proteosyntézy v dendritech, - influx Ca2+ z NMDAR je důležitý, ale sám nestačí pro indukci LTP (nutné i jiné zdroje Ca2+) LTP a morfologie synapsí LTP – změna struktury (morfologie) synapsí Synapse – mnoho tvarů a velikostí Obvykle – malé synapse – dynamičnost - velké synapse – stabilnější - velikost tedy ukazatelem stability synapse Tvar synapsí - aktinový cytoskelet – regulace během LTP Glutamát - NMDAR – zvětšení objemu synapse a přidání AMPAR (nikoli NMDAR) čím větší synapse v LTP – tím více AMPAR (korelace s NMDAR není) Aktin – lešení pro proteiny, transport, morfologie, internalizace AMPAR … - inhibitory polymerizace aktinu – inhibice LTP - LTP – více F-aktinu (polymerizovaného aktinu) LTP a morfologie synapsí ADF/cofilin – buněčný regulátor polymerizace aktinu – role v LTP LTP a morfologie synapsí Kadheriny – důležité pro udržení struktury synapse (pre a postsynaptická buňka) • neurální kadheriny – Ca2+ dependentní cell-adhesion molekuly • monomery – slabá adheze, dimery – silná adheze • stimulace LTP – dimerizace kadherinu (blokována inhibicí NMDAR) LTP stabilita Paměť – synaptic plasticity hypothesis – synapse jsou modifikovatelné, ale musí být i stabilní (dlouhodobá paměť) Stabilita velké synapse po LTP – nepřibude-li NMDAR ale jen AMPA – pak do stejné (ale mnohem větší synapse) je stejný influx Ca2+ a ten už u mnohem větší synapsi nemusí stačit na další aktivaci plastických změn synapse – což odpovídá pozorování, že větší synapse jsou stabilnější Paměť a LTP • Ale pochopitelně – LTP ke skutečné situaci v mozku a ukládání paměti může mít daleko – nicméně změny synapsí se dosud jeví jako nejpravděpodobnější hypotéza • Paměť – všechny testy – subjekt je vystaven nějaké zkušenosti - a pokud dojde k vytvoření paměťové stopy – následuje změna chování (což je trochu zjednodušení skutečnosti - roli totiž hraje cela řada faktorů - chuť zúčastnit se testu, pozornost, schopnost vnímání …. ) • Možnosti na úrovni CNS – poškození (vypnutí) určité části mozku (elektroda do této části mozku), ovlivněni určité části mozku látkou (místo elektrody kanyla), genetické inženýrství • Problém – poškodím-li (vypnu-li) určitou část mozku a pozoruji neschopnost se učit – může to být i tím že poruším motivaci, pozornost, schopnost vnímat podněty, motorické schopnosti … Paměť a LTP Paměť – krátkodobá, dlouhodobá - retrográdní amnézie – úder do hlavy – nepamatujete si co se stalo krátce před úderem, ale to co se stalo dříve si pamatujete - hypotéza – to co se stalo těsně předtím – paměť je ještě v aktivním stavu zatimco ta dřívější událost už je v neaktivním stavu Stabilizace paměti – konsolidace paměti – paměť je ze začátku méně odolná k narušení a potřebuje být stabilizována Ztráta paměti – porucha v ukládání paměťové stopy, porucha v jejím zpřístupnění – ta druhá možnost opět komplikuje pokusy s učením u zvířat (težko ji lze nějak v pokusech vyloučit) Testování učení Myš – 3 základní testy Inhibitory avoidance conditioning – myš do světlé části boxu, má tendenci přesunout se do tmavé části boxu (dostane-li ale po přesunu lehký elektrický šok - po následném umístění do světlé části se doba než se rozhodne přesunout do tmavé části prodlouží Fear conditioning Spatial learning in a water–escape test Glutamátové receptory a paměť NMDAR – využití antagonistů – NMDAR v hipokampu potřeba pro paměť ve spatial learning testu - geneticky upravené – NMDAR – ze 4 podjednotek – musí tam byt NR1 i NR2 podjednotky - KO NR1 myši v CA1 oblasti hipokampu - ve všech 3 typech testů poruchy - s NR2B podjednotkou lepší indukce LTP než s NR2A (různé podmínky pro otevření kanálu) - myši s overexpresí NR2B v hipokampu – zesílení paměti ve všech 3 testech (Doogie mice) kanárci – sezónní variace v kompozici NMDAR receptorů (song learning na jaře – více NR2B v některých oblastech mozku důležitých pro učení toho zpěvu) nicméně – řada studií, kde paměť i za silné inhibice NMDAR – existuji i jiné dráhy Glutamátové receptory a paměť AMPAR – infůze antagonistů AMPAR do oblasti kortexu v sousedstvi hipokampu – inhibice zapamatování v mnoha testech - fear memories – více mGluR1 v amygdale - prevence mGluR1 transportu (DN receptor) – porucha fear conditioning - kandidát pro vývoj léků pro posílení paměti – ampakiny Ampakiny – prochází blood-brain bariérou, vazba na AMPAR, po aktivaci receptoru glutamátem prodlouží dobu otevření kanálu (Na+) – zvýšení pravděpodobnosti depolarizace – zvýšení pravděpodobnosti aktivace NMDAR – řada studií prokazuje pozitivní účinek ampakinů na zlepšení paměti Využití antagonistů AMPAR a NMDAR do hipokampu – v některych testech - oba receptory potřebné pro vytvoření paměti, ale pouze AMPAR i pro její vyvolání CamKII a paměť KO myš – ne indukce LTP, špatné výsledky v spatial memory testu Autofosforylace – zesílení synapse, myši s mutací – nemožnost autofosforylace – poruchy LTP a poruchy spatial memory testu (nicméně měly problémy se vůbec naučit plavat k té platformě) – možná nejen porucha paměti ale i porucha nějakých senzorických funkcí - tyto mutantní myši - porucha v one-trial inhibitory avoidance learning, ale už nikoli pokud se to učení provedlo několikrát – mozna tedy autofosforylace CaMKII důležitá pro rychlou paměť CaMKII do hipokampu virovými vektory – malé zlepšení ve spatial learning testu Fear conditioning – více fosforylované CaMKII v amygdale, inhibitor aktivace CaMKII – inhibice fear conditioning Konsolidace paměti – translace a transkripce Short term memory – rychle se vytvoří, rychle může zmizet, náchylná k narušení Long-term memory – potřebuje čas vytvoření, pomaleji mizí, méně nachylná k narušení Důležitý parametr – čas mezi učením a pokusem – je-li 1-2 hodiny (short-term memory) - je-li 24 hodin (long-term memory) Long-term memory Transkripce - inhibitory transkripce – inhibice long-term memory (aplysia, Drosophila, myš) • CREB – KO myši – normální fear conditioning je-li čas 1 hodina (retention interval), ale poruchy když je čas delší (podobně i u dalších 2 testů) – nicméně i studie kde tomu tak není (jiná dráha aktivovaná u těchto KO myší ???) • CREB – antisense oligonukleotidy do hipokampu před učením (spatial learning) – porucha dlouhodobé paměti • Fear conditioning a inhibitory avoidance training – aktivace CREBemregulované transkripce v hipokampu a amygdale (řízeno PKA a MAPK – jejich inhibitory – porucha long-term memory a aktivace CREB) • Gen Arc – immediate early gen, rychlá transkripce, když myš prozkoumává nové prostředí (i spatial learning test), inhibice tohoto genu (poruchy spatial learning testu), lokalizace v dendritických synapsích se synaptickou aktivitou, důležitý pro konsolidaci nikoli tvorbu paměti, regulátor aktinového cytoskeletu Long-term memory Translace • Inhibitory translace – inhibice long-term memory (ale ne short-term memory) – ale – mnohé z těchto inhibitorů jsou toxické nebo ovlivňují celou řadu funkcí neuronů (množství neurotransmiterů …) – syntéza proteinů tedy ale není potřeba pro short-term memory Modulace paměti hormony Synapse, které ukládají paměť mohou byt ovlivněny např. hormony - paměťové modulátory – jejich vliv obvykle těsně po nebo během učení (např. leknu se chřestýše – adrenalin do oběhu – dlouho si to budu pamatovat) - promítání obrázků lidem (zároveň některým adrenalin a jiným ne) – ty s adrenalinem si lépe pamatují - různé oblasti mozku tak mohou ovlivňovat ukládání informací v jiných oblastech mozku (taková regulační funkce prokázána pro amygdalu) – do amygdaly agonisté nebo antagonisté adrenalinu – vliv na paměť uloženou v jiných oblastech mozku Modulace paměti hormony Adrenalin z krve neprochází blood-brain bariéru – signalizace do amygdaly přes nervus vagus Adrenalin ovlivňuje transport AMPA receptorů v hipokampu - modulační funkci i jiné hormony – Glukokortikoidy (kortikosteron) – taky vliv přes amygdalu Aktivita amygdaly – ovlivňuje transkripci a translaci v jiných oblastech mozku, kde se ukládá paměť (Arc protein v hipokampu) „Zapomínání“ Bezprostředně po vzniku paměti – ještě nekonsolidovaná a náchylná k narušení, s časem stoupá její stabilita nicméně - vyvolání paměti může vést opět ke zvýšení její citlivosti k narušení Spatial learning test – druhý den antagonista NMDAR těsně poté, co znovu proveden spatial learning test – další den problém se spatial learning testem (místo NMDAR antagonistu i inhibitory translace, ….) 2 teorie – active trace theory „Zapomínání“ • reconsolidation theory • Možné využití– drug addiction – i po vyléčení, když se dostanou zpět do stejného prostředí – často relaps – pokud by se vymazala paměťová stopa na prostředí – ne relaps (nadějné pokusy na myších), stejně tak i posttraumatické stresy by šlo odstranit během vyvolání traumatických vzpomínek) LTD - stejná dráha - stimulace Schafferových kolaterál 1Hz 10-15 minut - rozdíl mezi LTP a LTD dán množstvím Ca2+ – malý nárůst Ca2+ – LTD - větší nárůst Ca2+ – LTP LTD - Inhibitory fosfatáz inhibují vznik LTD Synaptická plasticita – poškození NS Reorganizace senzorických topografických map v kortexu primátů po ztrátě prstu (nebo jen přerušení nervu v prstu) Synaptická plasticita – trénink