CVIČENÍ Z ANALYTICKÉ CYTOMETRIE 2015/2016 4. – 6. 1. 2017, BFÚ Vyučující: Mgr. Karel Souček, Ph.D.; Mgr. Šárka Šimečková; PhamDr. Ján Remšík Skupina A Daněk, Pavel PřF N-EXB SPBI (EBZI) Depeš, Daniel PřF D-BI4 Drápela, Stanislav PřF D-BI4 FYZZ Karasová, Martina PřF D-BI4 FYZZ Krmeská, Veronika PřF N-EXB BIMG Skupina B Michaliková, Barbora PřF N-EXB SPBI (EBZI) Slanina, Peter PřF N-FY BF (ABF) Vojáčková, Eva PřF N-EXB BIMG Vymazal, Ondřej PřF N-EXB BIMG Den 1 A) B) 9 - 14 hod Úvod Hela 8 Fucci cells - analýza na průtokovém cytometru a CM MLN-4924 treatment 14- 18 hod Úvod Hela 8 Fucci cells - analýza na průtokovém cytometru MLN-4924 treatment Den 2 A) B) 9 - 12 Sběr a fixace buněk pro analýzu proliferace a BC Analýza na průtokovém cytometru 12-15 Hela 8 Fucci cells - analýza na CM Sběr a fixace buněk pro analýzu proliferace a BC Analýza na průtokovém cytometru 14-18 Den 3 A) B) 9 - 13.30 Sběr buněk, Imunofenotypizace, analýza na průtokovém cytometru 13. 30 - 18 Sběr buněk, Imunofenotypizace, analýza na průtokovém cytometru Protokol 1 Fucci 8 buňky - sběr, měření a analýza buněčného cyklu pomocí fluorescenčních proteinů, analýza na CM Protokol 2 Detekce proliferace, buněčného cyklu a buněčné životnosti po ovlivnění buněk DU 145 inhibitorem neddylace Protokol 3 Značení povrchových molekul EpCAM/CD44, viability u buněk DU 145 Protokol 1 Model HeLa 8 Fucci cells – měření a analýza buněčného cyklu pomocí fluorescenčních proteinů Cíl - cílem experimentu je seznámit se s modelovou buněčnou linií HeLa 8 Fucci, která umožňuje analýzu buněčného cyklu na živých buňkách bez potřeby fixace a značení - tento experiment bude demonstrační – bude Vám názorně předvedeno, jak se zpracovávají buňky pro tento typ analýzy, což využijete při přípravě dalších experimentů během tohoto cvičení - demonstrace měření proběhne na přístroji Attune® Flow Cytometer - ukázka vyhodnocení dat bude provedena pomocí programu FlowJo - analýza buněk na konfokálním mikroskopu po ovlivnění různými látkami Teorie Buněčná linie HeLa 8 Fucci - buněčná linie HeLa – lidská permanentní buněčná linie odvozená z karcinomu děložního čípku - nejstarší a jedna z nejčastěji používaných lidských buněčných linií - Fucci próba (fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator) – umožňuje vizualizovat progresi buněčného cyklu u živých buněk - buňky s Fucci ve fázi G1 emitují červené světlo, ve fázi S/G2/M zelené světlo - více – viz pdf. souboru uložené ve studijních materiálech (Sakaue-Sawano et al., 2008; viz studijní materiály) 1) ANALÝZA NA PRŮTOKOVÉM CYTOMETRU Materiál - připravená buněčná line HeLa 8 Fucci - roztok PBS+EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová). EDTA je chelatační činidlo, které mimo jiné vychytává Ca^2+ ionty, čímž rozrušuje mezibuněčné spoje - trypsin - pankreatický enzym (serinová proteáza), štěpí amidové a esterové vazby argininu a lysinu. Působení trypsinu uvolňuje adherentní buňky od kultivačního povrchu - nesterilní médium se sérem – inaktivace trypsinu - PBS – oplach buněčné suspenze Postup: Sběr a příprava vzorků - odsát médium z buněk - přidat 3 ml PBS+EDTA – 1-2 minuty nechat působit - odsát PBS+EDTA - přidat 0,5 ml trypsinu – nechat inkubovat v termostatu (37^oC) dokud se buňky neuvolní (cca 1-2 minuty) - přidat 2,5 ml média se sérem (inaktivace trypsinu) - misku opláchnout 1 ml PBS, přenést do zkumavky k buněčné suspenzi - stočit 200g 5 minut - odsát supernatant - pelet rozsuspendovat v 1 ml PBS - stočit 200g 5 min - odsát supernatant - pelet rozsuspendovat v 300 ml PBS a měřit Výsledky Popište postup měření buněčného cyklu u této linie + přiložte výsledky měření získané vyhodnocením v programu FlowJo 2) ANALÝZA NA KONFOKÁLNÍM MIKROSKOPU Postup: den 1: Výsev buněk HeLa 8 Fucci na mikroskopickou analýzu den 2: Ovlivnění látkami MLN-4924 (zásobní koncentrace 10 mM, výsledná koncentrace 1 µM) TRAIL (100 ug/ml zásobní koncentrace, 50 ng/ml výsledná koncentrace) Mitomycin (zásobní koncentrace 1 mg/ml, výsledná koncentrace 1 µg/ml) Doplňte poznámky k látkám TRAIL a Mitomycin (co to je za látky, co způsobují a k čemu se používají), viz poznámky u MLN-4924 v protokolu č. 2 Dopočtěte množství látek, které se bude k buňkám přidávat den 2-3: Analýza buněk na mikroskopu Popište postup analýzy na mikroskopu a změny, které jste pozorovali u buněk ovlivněných látkami. Protokol 2 Detekce proliferace, buněčného cyklu a buněčné životnosti po ovlivnění buněk DU 145 inhibitorem neddylace Cíle - cílem experimentu je ovlivnit buněčnou linii DU 145 inhibitorem neddylace (MLN-4924) a vyšetřit účinky jeho působení - působení MLN-4924 po dobu 24 hodin vede k deregulaci buněčného cyklu - měření proběhne na přístroji Attune® Flow Cytometer Teorie MLN-4924 * ATP kompetitivní inhibitor * I. fáze klinického testování pro lymfom, mnohočetný myelom, AML, ALL, melanom a další nehematologické nádory * Tvoří velmi stabilní adukt mezi NEDD8 a MLN-4924 vede k zastavení dráhy neddylace (viz obrázek). Dráha nedylace je nezbytná pro aktivitu ubikvitin ligázy Skp2^SCF, která se účastní regulace různých buněčných pochodů. Mezi její významné substráty patří proteiny řídící procesy, jako jsou buněčný cyklus (p27^Kip1, p21^cip1), buněčné replikace (Cdt1) a další. Struktura inhibitoru MLN-4924 (Soucy et al., 2009) Působení inhibitoru MLN-4924 na zastavení dráhy neddylace (Soucy et al., 2010) MĚŘENÍ PROLIFERACE A BUNĚČNÉHO CYKLU Materiál - buněčná linie DU 145 (kontrola a ovlivněné buňky) - roztok PBS+EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová). - trypsin - nesterilní médium se sérem – inaktivace trypsinu - nesterilní FACS zkumavky, špičky, pipety - PBS + 1% BSA - Live Dead Fixable stain kit Red - Edu click-iT AF488 kit - PO-PRO-1 Postup 1. Sběr a příprava vzorků - odsát médium z buněk - přidat 3 ml PBS+EDTA – nechat 2 minuty působit - odsát PBS+EDTA - přidat 0,5 ml trypsinu – nechat inkubovat v termostatu (37^oC) dokud se buňky neuvolní (cca 2 minuty) - přidat 2,5 ml média se sérem (inaktivace trypsinu) - stočit 200g 5 minut, odsát supernatant 2. Značení viability - naředit značku pro viabilitu v PBS (1:1000) - přidat 100 µl/vzorek, inkubovat 15 min, 4°C - přidat 1 ml PBS + 1% BSA, stočit (200g, 5 min), odsát supernatant 2. Fixace - rozsuspendovat buňky ve 100 µl 4% PFA - inkubovat 15 min, RT - přidat 1 ml PBS + 1% BSA, stočit (200g, 5 min), odsát supernatant 2. Permeabilizace - rozsuspendovat buňky ve 100 µl 0,15% Tritonu X-100 - inkubovat 15 min, RT - přidat 1 ml PBS + 1% BSA, stočit (200g, 5 min), odsát supernatant 2. Click-iT reakce - rozdělit vzorky do dvou zkumavek, do jedné přidat pouze PBS + 1% BSA, do druhé připravenou click-iT reakční směs - připravit click-iT reakční směs dle rozpisu - přidat 125 µl směsi/vzorek - inkubovat 30 min, RT ve tmě - do obou zkumavek přidat 1 ml PBS + 1% BSA, stočit (200g, 5 min), odsát supernatant 1 reakce PBS 109,5 μl CuSO4 2,5 μl Fluorescent dye azide 0,625 μl Reaction buffer additive (dilluted) 12,5 μl Total reaction volume 125 μl 2. Značení buněčného cyklu - naředit značku PO-PRO-1 v PBS (1:10 000) - přidat 500 µl/vzorek - inkubovat 30 min, RT ve tmě Výsledky Popište postup měření a vyhodnocování buněk na průtokovém cytometru + přiložte výsledky měření získané vyhodnocením v programu FlowJo Protokol 3 Analýza fenotypu u buněčné linie DU-145 Cíl - cílem experimentu je na živých buňkách značit povrchové molekuly CD24 a CD44 pomocí specifických primárních protilátek konjugovaných s fluorescenčními značkami - je důležité detekovat expresi těchto povrchových molekul pouze na živých buňkách, proto současně se značením těchto dvou znaků bude detekovaná i viabilita pomocí speciálního fluorescenčního kitu - celkem tedy budeme značit 3 znaky a detekovat 3 fluorescenční spektra Teorie Buněčná linie DU-145 má epiteliální charakter a je odvozená z mozkové metastázy karcinomu prostaty. Povrchové molekuly CD24 a CD44 * prokázány jako charakteristické znaky nádorových kmenových buněk (NKB) mimo jiné i u adenokarcinomu prostaty * NKB - subpopulace nádorových buněk, které jsou pravděpodobně zodpovědné za progresi nádorového onemocnění a tvorbu metastáz * vlastnosti podobné kmenovým buňkám – schopnost sebeobnovy a tvorby jak dalších maligních buněk, tak i nemaligních prekurzorových buněk pomalu cyklující buňky, zvýšená exprese antiapoptotických molekul a také molekul zodpovědných za multilékovou rezistenci (ABC transportéry), proto jsou rezistentní k běžně aplikované chemoterapii CD44 * povrchová molekula zapojená do procesů proliferace, diferenciace, migrace, angiogeneze a dalších * u mnoha nádorových onemocnění je zvýšená exprese CD44 spojena s horší prognózou * má několik ligandů – osteopontin, fibronectin, collagen, hyaluronate * u nádorových onemocnění prostaty je považován za marker nenádorových i nádorových kmenových buněk CD24 * povrchová molekula * znak nediferencovaných hematopoetických buněk * podílí se na buněčné adhezi, je receptorem pro P-selektin * popsána zvýšená exprese u některých druhů rakovin - prsu, vaječníků, prostaty.... Materiál - buněčné linie: DU-145 - roztok PBS+EDTA - trypsin - nesterilní médium se sérem – inaktivace trypsinu - nesterilní FACS zkumavky, špičky, pipety - PBS + 1% BSA - protilátky, viz tabulka níže Dopočítejte: na přípravu 10 ml 1% BSA přidat ml 20 % BSA do ml PBS použité protilátky: protilátka fluorochrom výrobce, katalogové číslo ředění CD24 CD44 viabilita IgG2a κ IgG2b Vzorky: - budou připraveny 2 vzorky: specifické značení (CD) isotypová kontrola (ISO) Postup: 1. příprava vzorků - odsát médium - oplach 3 ml PBS+EDTA – inkubace 3minuty/10 minut 37^oC linie (suchý termostat) - odsát PBS+EDTA - přidat 0,5 ml trypsinu – inkubace 2 minuty 37^oC (suchý termostat, průběžně pozorovat, zda se již buňky uvolňují od kultivačního povrchu) - přidat 2,5 ml média se sérem – inaktivace trypsinu - celou suspenzi přenést do připravených nesterilních zkumavek - misky opláchnout 1 ml PBS – přenést do příslušné zkumavky - zkumavky s buněčnou suspenzí stočit 200g 5 minut - odsát supernatant - pelet rozsuspendovat v 1 ml PBS s 1% BSA - každou ze zkumavek rozdělit na poloviny do dvou zkumavek určených pro měření na cytometru - do každé zkumavky přidat 1 ml 1% BSA - stočit 200g 5 minut - odsát supernatant a přidat příslušné protilátky ředěné v 1% BSA 2. Značení protilátkami CD24 a CD44 - do každého vzorku se přidá 100 ml 1% BSA s příslušnými protilátkami nebo isotypovými kontrolami Dopočítejte: 1. mikrozkumavka ISO – do 50 ml 1% BSA přidáme ml IgG ml IgG 2. mikrozkumavka specifické značení – do 50 ul 1% BSA přidáme ml CD44 ml CD24 - všechny vzorky důkladně propipetovat - inkubace 20 min v lednici - po 20 min přidat ke všem vzorkům 1 ml PBS + 1% BSA - stočit 200g 5 minut - odsát supernatant - pelet ve všech mikrozkumavkách rozsuspendovat ve 100 ul PBS s naředěnou značkou pro viabilitu 3. značení viability - vzorky rozsuspendovat v 500 ml PBS - přidat Propidium iodid (1:200) a měřit Výsledky Popište postup měření a vyhodnocování buněk na průtokovém cytometru + přiložte výsledky měření získané vyhodnocením v programu FlowJo Imunofenotypová analýza linie DU 145 vyhodnocení výsledků: