MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta CHEMICKÁ SYNTÉZA – PRAKTIKUM Spektrální charakteristiky produktů Jaromír LITERÁK a Zdeněk MORAVEC BRNO 2015 Obsah Obsah 3 Molekulová spektroskopie 4 Molekulová absorpční spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Rotační spektra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Rotačně vibrační spektra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Infračervená spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Úprava vzorku pro měření . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 Ramanova spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Rayleighův rozptyl záření . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Ramanův rozptyl záření . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 Vyhodnocení získaných spekter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 Nukleární magnetická rezonance (NMR) 11 Úvod . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 Interakce jaderného spinu s magnetickým polem . . . . . . . . . . . . . . . 11 Konstrukce NMR spektrometru . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 Měření a interpretace 1D NMR spekter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Chemický posun . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Magnetické interakce jader . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 Hmotnostní spektroskopie (MS) 18 Stanovení sumárního vzorce z hmotnostního spektra . . . . . . . . . . . . . 20 Základní pravidla fragmentačních reakcí při EI . . . . . . . . . . . . . . . . 22 Interpretace hmotnostních spekter s elektronovou ionizací . . . . . . . . . . 24 Složení nenabitých fragmentů molekul při EI . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 Složení iontů molekul v MS s EI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 Bromethan 33 Benzofenon-oxim 36 3-Nitroacetofenon 39 2 3-Aminoacetofenon 42 1-(3-Nitrofenyl)ethanol 45 Ethylenacetal ethyl-3-oxobutanoátu 48 1,2-Difenylbutan-1,2-diol 51 4-Methyl-2-(2-nitrofenylazo)fenol 54 4-Methoxy-2-(2-nitrofenylazo)fenol 56 4-Fenylazo-1-naftol 59 Fe(acac)3 60 Cr(acac)3 61 Cu(acac)2 62 Mn(acac)3 63 Ferrocen 64 Trimethyl-borát 67 FeSO4 · 7 H2O 68 3 Molekulová spektroskopie Molekulová spektroskopie je důležitou skupinou spektroskopických metod, které lze výhodně použít k analýze anorganických i organických látek. My se zaměříme pouze na dvě metody – infračervenou a Ramanovu spektroskopii. Obě metody jsou důležité v oblasti jak chemického výzkumu, tak i rutinní analýzy. Pro správné pochopení principů metod a správnou interpretaci je vhodné znát alespoň základy symetrie molekul, pro zájemce doporučuji čerpat např. zde. Molekulová absorpční spektroskopie Při pohlcení fotonu molekulou se její celková energie zvyšuje a molekula přechází do excitovaného stavu. Rozdíl energie mezi stavem excitovaným, jemuž odpovídá vyšší energetická hladina E1, a stavem základním s energetickou hladinou E0 musí být roven přijatému kvantu záření podle rovnice E1 − E0 = h · ν. Tato absorpce záření se projeví změnou v rozložení náboje molekuly v excitovaném stavu proti stavu základnímu (změna dipólového momentu molekuly). Při absorpci elektromagnetického záření je změna elektromagnetického stavu molekul z nižší do vyšší elektronové hladiny doprovázena změnou vibračního i rotačního stavu. Počet energeticky blízkých možných elektronových přechodů je u molekul velký. To znamená, že ve výsledném spektru nerozlišujeme jednotlivé rotační a vibrační čáry, ale nahlížíme na ně jako na pásy. Tyto pásy jsou pro každou molekulu typické v určité oblasti vlnové délky. Podle toho, které energetické změny se v daném spektru projeví, můžeme molekulovou spektroskopii rozdělit na: mikrovlnnou (rotační), infračervenou (rotačně vibrační) a viditelnou až ultrafialovou (elektronovou). Rotační spektra Jsou z molekulových spekter nejjednodušší, protože odpovídají pouze přechodům mezi sousedními rotačními stavy molekul. Rotační spektra poskytují pouze molekuly s permanentním dipólem (polární látky). Naměřená spektra jsou čárového charakteru, přičemž jsou od sebe jednotlivé čáry vzdáleny o konstantní rozdíl vlnočtu. Rotačně vibrační spektra Řadíme sem infračervenou spektroskopii. Naměřená spektra jsou pásová, protože změna vibračního stavu je doprovázena i změnou stavu rotačního. Klíčovou roli pro aktivitu vibrací má symetrie molekuly. Symetrii molekuly popisuje operace symetrie. Ty lze chápat jako vlastnosti, které molekulu převedou do nového prostorového uspořádání totožného s uspořádáním původním. Energie vibrací závisí na hmotnosti vázaných atomů v molekule a na pevnosti vazby. Rozlišujeme dva základní druhy vibrací: • Valenční: (ν) při kterých se mění délka vazby (vzdálenost jader). 4 • Deformační: (δ) při kterých se mění vazebný úhel, zatímco vzdálenosti jader zůstávají konstantní. Čistě vibrační přechody se získávají pouze v případě, kdy molekula nemůže rotovat. Tak je tomu v případě pevného skupenství, kde rotační stupně volnosti molekuly přecházejí na vibrační pohyby v mřížce. Absorbovat se může jen záření, jehož energie odpovídá energii příslušných vibračních a rotačních přechodů. Tyto jsou u různých skupin atomů různé. Proto z vlnočtu absorbovaného záření získáváme informace vhodné pro kvalitativní analýzu. Obr. 1: Valenční a deformační vibrace molekul necyklických molekul (νs – symetrická valenční vibrace, νas – antisymetrická valenční vibrace, δ – nůžková deformační vibrace, δs – symetrická nůžková deformační vibrace, δe – degenerovaná nůžková deformační vibrace, γ – nerovinná deformační vibrace, rovinné kývání, ω – nerovinné kývání, τ – zkrut) 5 Infračervená spektroskopie Infračervená spektroskopie je založena na absorpci infračerveného záření molekulami látek. Infračervené záření má větší vlnovou délku a nižší energii než záření viditelné. V elektromagnetickém spektru se nachází v intervalu 0,78 až 1000 µm a tuto oblast ještě můžeme rozdělit na tři části: • Blízká infračervená oblast (NIR) (0,78–2,5 µm, tj. 12800–4000 cm−1) • Střední infračervená oblast (MIR) (2,5–50 µm, tj. 4000–200 cm−1) • Vzdálená infračervená oblast (FIR) (50–1000 µm, tj. 200–10 cm−1) Pro chemickou analýzu se nejčastěji využívá střední oblast. NIR spektroskopie se využívá především pro rutinní analýzy v průmyslu. Energie infračerveného záření nestačí na změny elektronových stavů, ale způsobuje změny vibračních a rotačních stavů molekul. IR spektrum je pásové, kde pásy ve spektru odpovídají různým typům vibračních přechodů. Porovnáme-li polohu pásů valenčních a deformačních vibrací pro tutéž skupinu atomů zjistíme, že vlnočty u valenčních vibrací jsou vyšší než u deformačních, což nám umožňuje rozdělit spektrum na dvě oblasti: • Oblast skupinových vibrací (charakteristických vibrací) – Jde o oblast vyšších vlnočtů (4000 až 1200 cm−1). Vyskytují se zde absorpční pásy funkčních skupin a přísluší především valenčním vibracím molekuly. • Oblast otisku prstů – Jde o oblast nižších vlnočtů (1200 až 200 cm−1). Zde leží absorpční pásy identifikující každou molekulu jako chemické individuum. To znamená, že díky domu, že jsou tyto vibrace určeny chováním celého skeletu molekuly, nenajdeme dvě látky, které by měly svá spektra v oblasti otisku prstů shodná, čehož se využívá při identifikaci vzorku. Jde převážně o deformační vibrace molekul. Toto rozdělení ale nelze považovat za striktní, neboť se obě oblasti vzájemně překrývají. Základní podmínkou interakce infračerveného záření s molekulou je změna dipólového momentu během vibrace, s čímž úzce souvisí mohutnost či intenzita absorpce záření. S nejmohutnější absorpcí se setkáváme u vibrací silně polárních látek. Při interakci infračerveného záření se vzorkem dochází k vibračním a tedy i rotačním přechodům. O rotačních pohybech molekuly, ale uvažujeme, jen pokud je látka v plynném stavu. Úprava vzorku pro měření V transmisním uspořádání, kdy měříme závislost prošlého záření na energii je nutné měřený vzorek zředit vhodným mediem. Často se využívá KBr, který nemá v oblasti MIR žádnou aktivní vibraci. Vzorek se smísí s práškovým KBr v poměru asi 1:100, jemně se rozetře a vylisuje se průhledná tableta. Mimo KBr lze využít i jiné látky, 6 např. NaCl nebo CsF. Další možností je rozetření vzorku v oleji, často se pro tyto účely využívá minerální olej Nujol, což je směs vyšších uhlovodíků. Suspenze vzorku se pak vloží mezi měřící okna z KBr. Pro vodné roztoky se používají kyvety z materiálu KRS-5, což je TlBr0,4I0,6. Moderní spektrometry jsou vybaveny ATR nástavcem (Attenuated Total Reflectance), který umožňuje měření vzorku bez jakékoliv úpravy. Nejdůležitější částí tohoto nástavce je krystal z vhodného materiálu – diamanatu, Ge, ZnSe, apod., na který vzorek přitlačíme pomocí kovového hrotu. Paprsek pak na krystal dopadá pod mezním úhlem, čímž docílíme tzv. úplného odrazu. Paprsek putuje celým krystalem a prochází i povrchem vzorku, který je na krystal přitlačen. Nevýhodou tohoto uspořádání je, že získáme informace pouze o povrchu vzorku. Ramanova spektroskopie Principem je měření rozptýleného záření, které vzniká interakcí monochromatického záření (laseru) s molekulami vzorku za současné změny jejich vibračních a rotačních stavů. Vzhled spektra (závislost intenzity Ramanova rozptylu na vlnočtu) se prakticky neliší od infračerveného. Zásadní rozdíl je jen v tom, že v infračervené spektroskopii jsou aktivní vibrace, u kterých se mění dipólmoment, zatímco v Ramanově spektroskopii jsou aktivní ty vibrace, u kterých se mění polarizovatelnost. Polarizovatelnost je schopnost posouvat v molekule náboje působením elektrického pole a vytvářet indukovaný dipól. Změna polarizovatelnosti je způsobena deformací molekulového orbitalu. Rayleighův rozptyl záření Jako zdroj záření se musí zvolit takové monochromatické záření, které není vzorkem absorbováno a po průchodu tohoto záření vzorkem, dojde k rozkmitání jeho molekul. Nepolární molekula se díky tomu v elektrickém poli polarizuje a vytvoří indukovaný dipól. Molekula převezme od fotonu jeho energii a přebytečnou energii ihned ztrácí emisí záření a vrací se do původního energetického stavu. Tento děj si můžeme jednoduše představit jako pružné srážky fotonů s molekulami (pružný rozptyl). Ramanův rozptyl záření Celý děj si můžeme představit jako nepružnou srážku fotonu s molekulou, při které foton část energie molekule ponechá (nepružný rozptyl). Při měření takto rozptýleného záření, zjistíme, že jeho určitá část změnila vlnočet. Molekula se nevrátila na původní hladinu, ale zaujala jiný vibrační a rotační stav. Ramanův posun je založen na rozdílu frekvencí primárního záření a rozptýleného záření. Pásy s nižším vlnočtem než je vlnočet dopadajícího záření (souvisejí s přechodem molekuly na vyšší vibrační hladinu, než byla původní) se nazývají Stokesovy pásy. Pásy s vyšším vlnočtem rozptýleného záření (odpovídají přechodu molekuly 7 na nižší vibrační hladinu, než byla původní) se nazývají anti-Stokesovy. Ramanovy linie jsou obecně málo intenzivní, spektrum se nejčastěji měří v oblasti Stokesova rozptylu, který má vyšší pravděpodobnost než anti-Stokesův rozptyl a jeho linie jsou tudíž intenzivnější. Ramanova a IR spektra jsou navzájem komplementární, některé vibrace vidíme pouze v IR spektrech, některé naopak pouze v Ramanových spektrech a některé vibrace jsou aktivní v obou metodách. Vyhodnocení získaných spekter Vyhodnocení infračervených a Ramanových spekter je možné dvojím způsobem. Pokud máme alespoň rámcovou představu o složení analyzovaného vzorku můžeme se pokusit přiřadit jednotlivé pásy známým vibracím. Tento postup je ale časově náročný a vyžaduje poměrně značné znalosti a velkou zkušenost. Druhou možností je porovnání naměřeného spektra (spekter) s databází standardů. Zde se využívá hlavně oblast otisku prstu, která je pro každou látku charakteristická. Při porovnávání bereme nejprve v úvahu nejintenzivnější pásy. Volně dostupnou databází spekter je např. SDBS, kterou můžeme najít na internetové adrese: http://riodb01.ibase.aist.go.jp/sdbs/. Tato databáze obsahuje spektra (MS, 13C a 1H NMR, IR, Ramanova a EPR) převážně organických sloučenin. Pro vyhledávání IR spekter slouží box IR Peaks ve vyhledávacím formuláři (viz červeně orámovaná část obrázku). Do tohoto boxu můžeme vložit vlnočty pásů ze spektra. Je vhodné vložit více pásů, aby výsledek hledání neobsahoval moc velký počet sloučenin. 8 Další dostupnou databází je NIST Chemistry Webbook: http://webbook.nist.gov/chemistry/, kde najdeme spektra a vlastnosti více než 70 000 chemických sloučenin. 9 Pozice pásů charakteristických skupin Vazba Typ sloučenin Rozsah vlnočtů (poznámka)/ cm-1 C–H Alkany 2850–2960 1350–1470 C–H Alkeny 3020–3080 675–1000 C–H Aromatické jádro 3000–3100 (slabší intenzita) 675–870 C–H Alkyny 3300 C=C Alkeny 1640–1680 (proměnlivá intenzita) C≡C Alkyny 2100–2260 (proměnlivá intenzita) C¨–C Aromatické jádro 1500, 1600 (proměnlivá intenzita) C–O Alkoholy, ethery, karboxylové 1080–1300 kyseliny, estery C=O Aldehydy, ketony, karboxylové 1690–1760 kyseliny, estery O–H Alkoholy a fenoly 3610–3640 (proměnlivá intenzita) Alkoholy s vodíkovou vazbou 3200–3600 (široký pás) Karboxylové kyseliny 2500–3000 (široký pás) N–H Aminy 3300–3500 C–N Aminy 1180–1360 C≡N Nitrily 2210–2260 (proměnlivá intenzita) -NO2 Nitro- sloučeniny 1515–1560 1345–1385 10 Nukleární magnetická rezonance (NMR) Úvod Zkratka NMR znamená Nukleární Magnetická Rezonance. Jde o analytickou metodu, která na základě absorpce radiofrekvenčního záření vzorkem umístěným v silném magnetickém poli poskytuje informace o struktuře zkoumané látky. Tato metoda je v chemii velmi důležitá a slouží jak ke studiu nízkomolekulárních látek, tak i k objasňování struktury velkých molekul z oblasti biologie a biochemie, např. bílkovin, DNA, RNA, atd. Jak je patrné z názvu, NMR spektroskopie se zabývá chováním atomového jádra v magnetickém poli. Atomové jádro se v nejjednodušším přiblížení skládá ze dvou částic – kladně nabitého protonu a elektricky neutrálního neutronu. Každá z těchto částic má důležitou vlastnost, která se nazývá spin. Zjednodušeně můžeme říct, že jde o směr rotačního pohybu částice. Hodnota spinu elementární částice (protonu nebo neutronu) může být +1/2 nebo −1/2. Součet spinů všech částic v jádře se nazývá jaderný spin. Tato charakteristika nám říká, jestli bude dané jádro vhodné pro NMR spektroskopii nebo ne. Pro vlastní měření jsou nejvýhodnější jádra se spinem 1/2, např. 1H, 13C, 19F, 31P,. . . Interakce jaderného spinu s magnetickým polem V základním stavu (bez působení magnetického pole) jsou spiny uspořádány náhodně a mají stejnou energii. Pokud na spiny začneme působit vnějším magnetickým polem, rozdělí se na dvě hladiny. Jedna bude mít nižší energii oproti základnímu stavu, druhá naopak vyšší. Na hladině s nižší energií bude mírný nadbytek spinů, oproti druhé hladině. Čím bude vnější magnetické pole silnější, tím bude i větší rozštěpení hladin a také větší rozdíl v populaci jednotlivých hladin. 11 Pokud takto rozštěpený spinový systém začneme ozařovat radiofrekvenčním zářením, může dojít k absorpci a excitaci jednotlivých spinů na vyšší hladinu. Po ukončení ozařování dochází k deexcitaci, kterou následně měříme. Konstrukce NMR spektrometru Aby byla intenzita NMR signálu co nejvyšší, je nutné použít velmi silné magnetické pole. To je získáváno pomocí solenoidu ze supravodivého materiálu (materiál bez Ohmického odporu). Protože tyto supravodiče pro svůj provoz vyžadují velmi nízkou teplotu (−269 ◦C a méně) je cívka ponořena do kapalného helia. Cívka je tvořena několika tisíci závity a teče jí proud o velikosti 100 a více A. Pole generované touto cívkou je 4–18 T. Protože se jedná o cívku bez odporu, stačí ji nabít jen jednou při instalaci přístroje a poté zůstavá plně funkční bez dodávek proudu i po dobu několika let, musí ale být neustále udržována na nízké teplotě. Protože je kapalné helium drahé, je dewarova nádoba (termoska) s cívkou vložena do vnější dewarovy nádoby s kapalným dusíkem (−195,8 ◦C). Izolace mezi dewarovými nádobami a pláštěm magnetu je tvořena vakuem. Magnet je asi nejzajímavější součásti NMR spektrometru, mimo něj je potřeba pro měření NMR spekter ještě sonda, do které se vkládá vzorek a která obsahuje vysílací a přijímací cívky a dále sada zesilovačů a vysílačů radiofrekvenčního záření. 12 Měření a interpretace 1D NMR spekter NMR spektra je možné měřit dvěma způsoby. U starších spektrometrů se využívalo postupné měření spektra bod po bodu, tzv. CW-NMR. Tento postup byl velmi zdlouhavý a neumožňoval akumulaci spekter, dal se využít pouze pro jádra s vysokou citlivostí a koncentrované roztoky. V dnešní době se měří výhradně metodou FT-NMR, kdy jedním radiofrekvenčním pulsem, příp. sekvencí pulsů excitujeme všechny jaderné spiny a měříme následnou deexcitaci. Tím získáme tzv. FID (Free Induction Decay), z něhož pomocí Fourierovy transformace (FT), z časové domény do frekvenční, získáme NMR spektrum. Výhodou tohoto přístupu je možnost několikanásobného měření, tzv. akumulace spekter a tím zlepšením poměru signál/šum ve spektru. NMR spektrum obsahuje signály, tzv. peaky, které jsou charakterizovány především chemickým posunem a intenzitou. Intenzita signálu odpovídá kvantitě dané spinu v systému a chemický posun o chemickém okolí měřeného jádra. Chemický posun Poloha peaku v NMR spektru je dána rezonanční frekvencí daného jádra. Pokud bychom měřili soustavu izolovaných jader 1H získáme pouze jeden peak. V reálných vzorcích jsou ale jádra součástí molekul, tzn. že jsou obklopeny vazebnými elektrony, které se chovají jako malé lokální magnety, tím ovlivňují intenzitu vnějšího magnetického pole, které na tyto jádra působí. Proto se rezonanční frekvence jader mění v závislosti na chemickém okolí měřeného jádra (viz tabulka). Chemický posun (δ) se udává v jednotkách ppm (parts per milion – miliontina), a je dán následujícím vztahem: δ = νx − νref νref × 106 kde νx je rezonanční frekvence měřeného jádra a νref je rezonanční frekvence referenční sloučeniny. Hodnota chemického posunu je tak nezávislá na použitém přístroji. 13 14 Každý peak ve spektru odpovídá jednomu chemicky neekvivaletnímu jádru ve sloučenině. Tzn. pokud bych měřili 1H NMR spektrum hexanu, který obsahuje tři typy neekvivalentních protonů, získáme spektrum se třemi signály. H3C CH2 CH2 CH2 CH2 CH3 Naproti tomu, nesymetricky substituovaný hexan, např. 1-chlorhexan, bude mít signálů šest, protože kvůli substituci dojde ke snížení symetrie molekuly. CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3Cl Magnetické interakce jader Pokud je v molekule několik NMR aktivních jader, může dojít k interakci jaderných spinů, která se ve spektru projeví rozštěpením peaku na složitější soustavu. Interakce jsou dvojího druhu – přímé dipól-dipólové interakce, které se šíří přes prostor a v izotropním, kapalném prostředí se neprojevují a nepřímé spin-spinové interakce, které jsou zprostředkovány vazebnými elektrony a způsobují pozorovatelné štěpení NMR signálů v kapalné fázi. Tyto interakce vznikají pouze mezi neekvivalentními jádry. C H H H C H H OH 15 Způsob štěpení je dán počtem interagujících spinů, velikost štěpení je určena počtem vazeb, které tyto spiny oddělují. Pro jádra se spinem 1/2 je velikost multipletu, tzn. počet signálů po štepení a jejich vzájemná intenzita dán Pascalovým trojúhelníkem. Pokud s měřeným jádrem interaguje jedno jádro, získáme dva signály o stejné intenzitě, tzv. dublet. Pokud interagují dvě jádra, získáme tři signály (triplet), jejichž intenzity jsou v poměru 1:2:1. V případě tří jader získáme čtyři signály s poměrem intenzit 1:3:3:1. Velikost interakce se vyjadřuje pomocí interakční konstanty, která se označuje písmenem J. Pro přesnější popis interakce se využívá indexů, např. interakci mezi atomy vodíku v ethanolu (přes tři vazby H-C-C-H) vyjádříme 3JHH. Její velikost se udává v Hz. Obrázek ukazuje třívazebnou interakci mezi protony v molekule chlorethanu. Čím více vazeb je mezi atomy, tím je hodnota interakce menší. Interakce přes čtyři a více vazeb jsou již velmi slabé a často je nejde pozorovat. 16 Charakteristické chemické posuny atomu vodíku 1H Typ atomu vodíku Chemický posun / ppm Cyklopropan 0,2 Primární RCH3 0,9 Sekundární R2CH2 1,3 Terciární R3CH 1,5 Vinylický C=C–H 4,6–5,9 Acetylenický C≡C–H 2–3 Aromatický Ar–H 6–8,5 Benzylický Ar–C–H 2,2–3 Allylický C=C–H 1,7 Fluorderiváty HC–F 4–4,5 Chlorderiváty HC–Cl 3–4 Bromderiváty HC–Br 2,5–4 Jodderiváty HC–I 2–4 Alkoholy HC–OH 3,4–4 Ethery HC–OR 3,4–4 Estery RCOOC–H 3,7–4,1 HC–COOR 2–2,2 Kyseliny HC–COOH 2–2,6 Karbonylové sloučeniny HC–C=O 2–2,7 Aldehydy RCHO 9–10 Hydroxylové skupiny ROH 1–5,5 Fenolické skupiny ArOH 4–12 Hydroxy skupina enolu C=C–OH 15–17 Karboxylové kyseliny RCOOH 10,5–12 Aminy RNH2 1–5 17 Hmotnostní spektroskopie (MS) Hmotnostní spektroskopie využívá řadu fyzikálních metod ke stanovení hmotnosti nabitých částic, kterými jsou mohou být atomy, molekuly nebo fragmenty molekul. Všechny tyto metody jsou založeny na převedení analyzovaných částic do plynného stavu, jejich ionizaci a na separaci vzniklých iontů pohybem v magnetickém, elektrickém poli nebo v kombinaci těchto polí a registraci iontů v detektoru. Separace iontů závisí vedle hmotnosti také na náboji částice, v hmotnostní spektroskopii se proto místo hmotnosti m užívá poměr hmotnosti k náboji částice m/z, protože nabitá částice je neodlišitelná od částice s dvojnásobnou hmotností nesoucí dvojnásobný náboj. Uspořádání hmotnostního spektrometru ukazuje následující schéma. V rutinní analýze organických látek se nejčastěji používají relativně levné a jednoduché hmotnostní spektrometry s elektronovou ionizací (EI, electron ionization) a kvadrupólovým hmotnostním filtrem. Vstup látky do hmotnostního spektrometru látky může například představovat výstup z kolony plynového chromatografu, látka může být také přímo zplyněna za vysoké teploty ve speciálním zařízení a analyzována bez předchozí chromatografické separace. Analyzovaná látka v plynném skupenství je vnášena do iontového zdroje přístroje, kde dochází k ionizaci účinkem proudu elektronů urychlených potenciálovým rozdílem, nejčastěji se jedná o 70 V. Průlet urychlených elektronů kolem molekul vyvolá nejčastěji vytržení jednoho elektronu z molekuly a vznik kation radikálu. Vzniklé ionty jsou z iontového zdroje vypuzeny elektrostatickou silou a jejich proud po fokusaci iontovou optikou vstupuje do kvadrupólového hmotnostního filtru. 18 Kvadrupól je soustava čtyř rovnoběžných kovových tyčí o kruhovém nebo hyperbolickém průřezu, které jsou situovány v rozích čtverce. Protilehlé tyče kvadrupólu jsou vodivě spojeny a nabity na stejný potenciál, současně je také potenciál dvou párů tyčí modulován radiofrekvenčním napětím o proměnlivé frekvenci. Ion, který vlétl do kvadrupólu, se díky působení elektrostatických sil začne pohybovat po zakřivené trajektorii. Při dané frekvenci a napětí vloženém na tyče kvadrupólu může projít celým hmotnostním filtrem pouze ion o určitém poměru m/z, zbytek iontů o odlišném poměru m/z se začne pohybovat po nestabilních trajektoriích a nárazem na stěny filtru zanikne. Ionty prošlé hmotnostním filtrem jsou registrovány v detektoru, kterým je často elektronásobič. Napětí a modulující frekvence jsou řízeny elektronicky, postupnou změnou těchto parametrů a současným záznamem odezvy detektoru můžeme získat hmotnostní spektrum, tedy závislost četnosti prošlých iontů na poměru jejich m/z. Prostory, ve kterých se pohybují ionty, musí být evakuovány na velmi vysoké vakuum (typicky 10−6 Torr), aby se zabránilo nežádoucím kolizím iontů s molekulami plynu. Energie elektronů užívaných při elektronové ionizaci (70 eV) výrazně převyšuje vazebné energie a ionizační energie molekul, není proto překvapující, že vznikající ionty s přebytkem vnitřní energie jsou nestabilní a s velkou pravděpodobností se štěpí na lehčí molekuly. Díky vysokému vakuu nejsou pravděpodobné bimolekulární reakce iontů. Následující obrázek zachycuje hmotnostní spektrum methanolu s elektronovou ionizací. Ion s m/z 32 je tzv. molekulární iont (M+), jeho hmotnost odpovídá hmotnosti molekuly složené z izotopů s nejvyšším zastoupením. Nejintenzívnějším iontem 19 v hmotnostním spektru je iont s m/z 31, tento iont se označuje jako základní pík. Fragmentační reakce probíhající po elektronové ionizaci methanolu zachycují následující rovnice: CH3OH EI CH3OH m/z 32 CH2OH + HCH3OH m/z 31 CHO + H2CH2OH m/z 29 CH3OH CH3 + OH m/z 15 + + (M+) Molekulový ion nemusí být ve spektru vůbec patrný (např. u ethylenacetalu ethyl- 3-oxobutanoátu nebo 1,2-difenylbutan-1,2-diolu se s tímto setkáme). Obecně platí, že intenzita M+ klesá s rostoucí molekulovou hmotností. Látky obsahující v molekule dlouhé lineární řetězce vykazují vyšší intenzitu M+ ve srovnání s více větvenými isomery. Na hmotnost molekuly v případě chybějícího iontu M+ mohou ukazovat fragmenty o hmotnostech M-1 (ztráta H·), M-15 (ztráta methylu CH3·), M-18 (ztráta vody H2O). Ztráta hmoty v rozmezí 19–25 je nepravděpodobná, mimo eliminace F· (M-19) a HF (M-20). Fragmentace iontů není náhodná, jako všechny chemické reakce je řízena pravidly, které lze pozorovat u klasických reakcí molekul. Hmotnostní spektrum může pomoci při identifikaci neznámé látky několika způsoby. Z produktů fragmentace lze usuzovat na přítomnost určitých funkčních skupin v molekule nebo strukturních motivů. Samotné fragmentační reakce molekuly vyvolané elektronovou ionizaci jsou monomolekulární procesy, jejichž průběh závisí relativně málo na experimentálních podmínkách. EI spektra jsou proto velmi dobře reprodukovatelná, existují obsáhlé knihovny EI hmotnostních spekter získaných při ionizační energii 70 eV, které lze prohledávat a srovnávat s naměřeným spektrem. Existuje celá řada ionizačních technik, které jsou šetrnější a nevedou k rozsáhlé fragmentaci iontů, neposkytují však stejně dobře porovnatelná a reprodukovatelná spektra. Stanovení sumárního vzorce z hmotnostního spektra Pomocí hmotnostní spektroskopie lze stanovit sumární vzorec analyzované sloučeniny. Můžeme využít skutečnosti, že hmotností nuklidů nejsou přesně celými násobky hmotnostní jednotky. Kombinace prvků (sumární vzorce) se proto liší motnostni a přesně stanovéná hmotnost zase zpětně ukáže sumární vzorec sloučeniny. Jako příklad mohou sloužit molekuly O2, N2H2 a CH3OH, které mají velmi podobné molární hmotnosti. O2 2 × 15,9949 = 31,9898 N2H2 2 × 14,0031 + 4 × 1,00783 = 32,0375 CH3OH 12,0000 + 4 × 1,00783 + 15,9949 = 32,0262 Pro rozlišení mezi těmito molekulami bychom museli stanovit m/z s přesností na nejméně tři desetinná místa. Toho lze dosáhnout pouze s užitím vysokorozlišujících hmotnostních spektrometrů. 20 Skutečnost, že naprostá většina prvků tvořících organické sloučeniny obsahuje vedle majoritního izotopu ještě další těžší izotopy, může být využita ke stanovení složení menších molekul. Následující tabulka zachycuje izotopické složení prvků podílejících se nejčastěji na stavbě organických sloučenin. Prvek Izotop Relativní Izotop Relativní Izotop Relativní zastoupení zastoupení zastoupení Uhlík 12C 100 13C 1,11 Vodík 1H 100 2H 0,016 Dusík 14N 100 15N 0,38 Kyslík 16O 100 17O 0,04 18O 0,2 Fluor 19F 100 Křemík 28Si 100 29Si 5,1 30Si 3,35 Fosfor 28P 100 Síra 32S 100 33S 0,78 34S 4,4 Chlor 35Cl 100 37Cl 32,5 Brom 79Br 100 81Br 98 Jod 127I 100 Procentuální zastoupení izotopů je vztaženo na množství majoritního izotopu prvku. Přítomnost těžšího izotopu v molekule se projeví v hmotnostním spektru jako tzv. izotopický pík o vyšší hmotnosti. Izotopy vodíku, dusíku a uhlíku přispívají ke vzniku M + 1 izotopického iontu molekuly nebo jejího fragmentu. Díky nejvyššímu obsahu jsou nejvýznamnějšími příspěvateli k M + 1 izotopy 13C (1,1 % množství 12C) a 15N (0,38 % množství 14N). Pro určení počtu atomů uhlíku a dusíku v molekule musíme první vyjádřit intenzitu prvního izotopického píku molekulového iontu M + 1 v procentech intenzity M. Poté platí: %(M + 1) ≈ (1, 1 × x) + (0, 38 × y), kde x je počet atomů uhlíku a y je počet atomů dusíku. Pro odhad počtu atomů dusíku v molekule můžeme použít dusíkové pravidlo, podle kterého sloučenina obsahující lichý počet atomů dusíku má lichou hmotnost a sudou hmotnost má molekula obsahující sudý počet atomů dusíku. Pravidlo platí pro všechny sloučeniny obsahující pouze některé z těcto prvků: C, H, N, O, S, F, Cl, Br, I, P, B, Si a As. Přítomnost atomů Br, Cl, S a Si v molekule lze rozpoznat díky přítomnosti intenzívních píků M + 2. Například přítomnost jednoho atomu bromu v molekule se v hmotnostním spektru projeví přítomností charakteristické dvojice iontů M a M + 2 o přibližně stejné intenzitě. Přítomnost jednoho atomu chloru lze také snadno odhadnout z přítomnosti iontu M + 2 s přibližně třetinovou intenzitou oproti M (37Cl tvoří 32,5 % množství 35Cl). Přítomnost většího počtu atomů Br a Cl vede ke složitější distribuci hmot iontů, poměr intenzit lze získat získat binomickým rozvojem, například pro prvek s dvěmi isotopy, které mají relativním zastoupením a a b, užijeme vztah (a + b)n, kde n je 21 počet atomů diisotopického prvku ve sloučenině. Pro sloučeninu obsahující dva atomy bromu v molekule (např. Br2) získáme a2 +2ab+b2 = 10.000+19.600+9.604, což po normalizaci poskytne pro poměr hmot M:(M+1):(M+2) poměr intenzit 51:100:49. Fuor, fosfor a jod jsou monoizotopické prvky, jejichž přítomnost je obtížné vystopovat metodou založenou na izotopických iontech. Příklady: V hmotnostním spektru látky byl kromě iontu M+ nalezen iont M + 1 s touto intenzitou: 150 (M+) 100 % 151 (M + 1) 10,2 % Sloučenina neobsahuje dusík nebo obsahuje sudý počet jeho atomů. Počet atomů uhlíku bude 9 (10,2/1,1), rozdíl hmotnosti devíti atomů uhlíku a hmotnosti molekulového iontu (42) nemůže být tvořen pouze atomy vodíku, rozdíl můžeme smysluplně doplnit atomy kyslíku a dusíku na C9H14N2 a C9H10O2. Analýza hmotnostního spektra (způsobu fragmentace) ukáže, že se jedná o 1-(2-methoxyfenyl)ethanon (C9H10O2). V hmotnostním spektru jiné látky byl kromě iontu M+ nalezen iont M + 1 s touto intenzitou: 121 (M+) 100 % 122 (M + 1) 9,2 % Lichá hmotnost napovídá přítomnost lichého počtu atomů dusíku v molekule. Počet atomů uhlíku v molekule bude 8 (vypočítáme (9,2−0,38)/1,1). Rozdíl hmotnosti osmi atomů uhlíku a molekulového iontu (25) může být smysluplně doplněn pouze jedním atomem dusíku a 11 atomy vodíku (C8H11N1). Analýza hmotnostního spektra (způsobu fragmentace) ukáže, že látkou je N,N -dimethylanilin. Základní pravidla fragmentačních reakcí při EI Ionizace molekul pomocí urychlených elektronů tudíž zanechává ionty přebytkem vnitřní energie, který ve spojení s nestabilitou samotných kation-radikálů může následně vést k fragmentaci ionizovaných molekul. 1. Pravděpodobnost štěpení vazeb vycházejících z atomu uhlíku roste s počtem alkylových zbytků, které tento atom nese. Důvodem je stabilizace vzniklého karbokationtu alkylovými substituenty. Obecně platí, že se jako radikál ze substituovaného atomu uhlíku odštěpuje nejobjemnější skupina. Stabilita karbokationtů roste v následujícím pořadí: H C H H R C H H R C H R R C R R < < < primárnímethylkation sekundární terciární 22 2. Násobné vazby, cyklické struktury a zvláště aromatické (heteroaromatické) cykly stabilizují ion M+, vedou k omezení fragmentace a tím ke zvýšení intenzity M+. 3. Přítomnost násobné vazby zvyšuje výrazně pravděpodobnost štěpení v allylické pozici, které poskytuje stabilizovaný kation. Je potřeba si však uvědomit, že u alkenů dochází po elektronové ionizaci ke snadné migraci násobných vazeb. Využit tohoto pravidla však lze ve strukturní analýze cykloalkenů. 4. Cykloalkany a jejich deriváty nesoucí na atomech cyklu alkylové substituenty, mají tendenci odštěpovat tyto skupiny jako radikály, přičemž kladný náboj zůstává lokalizaván na příslušném atomu cyklu. R + R 5. Nenasycené šestičlenné cykly mají tendenci podléhat retro-Dielsově-Alderově reakci. Při fragmentaci výchozího iontu s lichým počtem elktronů zůstává kladný náboj přednostně a nebo výhradně na fragmentu, který má nižší ionizační ener- gii. + 6. Alkylaromáty podléhají štěpení β vazeb za vzniku rezonancí stabilizovaných kationtů benzylového typu, které jsou v rovnováze s aromatickým tropyliovým kationtem. R - R H H H H H H 7. Po elektronové ionizaci relativně snadno praskají vazby C–C a C–H vycházející z atomu uhlíku, který sousedí s heteroatomem nesoucím volné elektronové páry. Kladný náboj zůstává přednostně lokalizovan na fragmentu, který obsahuje heteroatom. Popsané štěpení je umožněno účinnou stabilizací vznikajicího karbokationtu konjugací s volnými elektronovými páry heteroatomu. H3C O H - H O H H H O H H H 23 8. Štěpení ionizované molekuly je často doprovázeno eliminací malých stabilních molekul, např. CO, H2O, H2S, NH3, HCN, R–OH, R–SH, CH2=C=O, alkeny. 9. Molekuly obsahující dvojnou vazbu a relativně snadno odštěpitelný atom vodíku v γ-pozici vůči této dvojné vazbě, podléhají McLaffertyho přesmyku spojeného s eliminací. O H Y R2 R1 Y = H, R, OH, OR, NH2 O H Y R2 R1 Y O H + R2 R1 H R R H H R H H + Interpretace hmotnostních spekter s elektronovou ionizací Při interpretaci hmotnostních spekter získaných s užitím elektronové ionizace mohou napomoci následující dvě tabulky. První tabulka obsahuje výčet pravděpodobného složení nenabitých fragmentů, které se uvolňují z ionizované molekuly a které mohou poukazovat na přítomnost určité funkční skupiny v molekule. Hmotnoti těchto nenabitých fragmentů vidíme jako rozdíl hmot v hmotnostním spektru, například v hmotnostním spektru methanolu jsou to rozdíly mezi m/z 32 (M+) a 31, 29 a 15. 24 Složení často se vyskytujících nenabitých fragmentů molekul při EI m/z Fragment Možná funkční skupina 1 H 2 H2 15 CH3 16 O Ar–NO2, aminoxidy, sulfoxidy NH2 Karboxamidy, sulfonamidy 17 OH 18 H2O Alkoholy, aldehydy a ketony 19 F 20 HF 26 HC CH N C 27 N CH Aromatické nitrily, dusíkaté heterocykly H2C CH 25 m/z Fragment Možná funkční skupina 28 H2C CH2 CO (HCN + H ) 29 H3C CH2 Ethyl ketony, Ar(CH2)2CH3 CHO 30 CH2O Ar–O–CH3 NO Ar–NO2 H2N CH2 CH3CH3 31 H3C O Methyl ester H3C NH2HO CH2 32 H3C OH S 33 HS Thioly (CH3 + H2O) 34 H2S Thioly 35 Cl 36 HCl 2H2O 40 H3C C CH 41 H2C 42 H3C H2C C O NCO N C NH2 43 C3H7 Propylketony, ArCH2–C3H7 CH3 O Methylketony, CH3(C=O)–G H2C O H CH3 + CH2=CH2 HNCO 44 CO2 Estery, anhydridy karboxylových kyselin N2OH2C OH O NH2 HN CH2 CH3 26 m/z Fragment Možná funkční skupina 45 O CH2 CH3 Ethyl ester H3C OH COOH CH3CH2NH2 46 NO2 Ar–NO2 H2O + H2C CH2 CH3CH2OH 47 CH3S 48 SO Sulfoxidy CH3SH O3 49 CH2Cl 51 CHF2 52 C4H4 C2N2 53 C4H5 54 H2C CH2 55 H2C CH3 56 H2C CH3 H3C CH3 2 CO 57 C4H7 Butylketony C2H5 O Ethylketony 58 NCS NO + CO C4H10 CH3(CO)CH3 59 O O H3C 60 H2C OH OH Estery kyseliny octové C3H7OH 61 S H CH3CH2S 27 m/z Fragment Možná funkční skupina 62 H2S + CH2CH2 63 CH2CH2Cl 64 C5H4 S2 SO2 69 CF3 C5H9 77 C6H5 79 Br 80 HBr 85 CClF2 100 F2C CF2 119 F3C CF2 122 COOH 127 I 128 HI 28 Následující tabulka může pomoci v odhadu složení a struktury iontů, které pozorujeme v hmotnostním spektru s elektronovou ionizací. Možné složení iontů molekul v MS s EI m/z Složení iontu m/z Složení iontu 14 CH2 41 C3H5 C2H2NH 15 CH3 42 C3H6 C2H2O 16 O 43 C3H7 CH3CO C2H5N 17 OH 44 CH2CHO + H CO2 (vzduch) CH3CHNH2 (CO)NH2 (NH3)3N 18 H2O NH4 45 CH3CH(OH) CH2CH2OH CH2OCH3 (CO)OH 19 F H3O 46 NO2 26 C N C2H2 47 CH3S CH2SH 27 C2H3 49 35Cl CH2 28 C2H4 CHO 51 C4H3 CH2F 30 CH2NH2 NO 53 C4H5 31 CH2OH CH3O 54 CH2CH2CN 32 O2 (vzduch) 55 C4H7 H2C O H 33 SH CH2F 56 C4H8 34 H2S 57 C4H9 C2H5CO 35 35Cl 58 CH3(CO)CH3 C2H5CHNH2 (CH3)2NCH2 C2H5NHCH2 C2H5S 36 H35Cl 59 (CH3)2COH C2H5OCH2 CH3OCHCH3 CH3CH2CHOH H2N O CH2 + H COOCH3 C2H5CHOH 39 C3H3 60 CH2COOH + H CH2ONO 40 CH2CN Ar (vzduch) 61 CH3COOH + HCH2CH2SH CH2SCH3 29 m/z Složení iontu m/z Složení iontu 65 C5H5 79 H H HH H H H 79Br 67 C5H7 80 H79Br 68 CH2CH2CH2CN 81 C6H9 O CH2 69 C5H9 CF3 OH3C H 82 (CH2)4CN C6H10 C35Cl2 70 C5H10 83 C6H11 CH35Cl2 S 71 C5H11 C3H7CO 85 O O O C6H13 C4H9CO 72 C2H5(CO)CH2 + H C3H7CHNH2 (CH3)2NCO C2H5NHCHCH3 (a isomery) 86 C3H7(CO)CH2 + H C4H9CHNH2 (a isomery) 73 (CH3)3Si CH2 homology 59 87 C3H7COO CH2 homology 73 CH2CH2COOCH3 74 CH2COOCH3 + H 88 CH2COOC2H5 + H 75 COOCH2CH3 + 2H C2H5COO + 2H CH2SC2H5 (CH3)2CSH (CH3O)2CH (CH3)2SiOH 89 COOC3H7 + 2H C 76 H H HH 90 CH CH3CHONO2 77 H H HH H 91 CH2 (CH2)4 35Cl C6H5N 78 H H HH H H 92 N CH2 H H 30 m/z Složení iontu m/z Složení iontu 93 CH2 79Br C7H9 O N C O 105 C O CH2CH2 CHCH3 94 O N + H H CO 106 NHCH2 95 O CO 107 CH2O CH2 HO 79BrC2H4 96 (CH2)5CN 108 CH2O + H N CH3 CO 97 C7H13 S CH2 109 CO 98 + H O CH2O 111 S CO 99 C7H15 C6H11O O O 119 CF3CF2 C CH3 CH3 H3C CO H3C CHCH3 100 C4H9(CO)CH2 + H C5H11CHNH2 120 O C O 101 COOC4H9 121 NH C O OCH3 CH2 CO OH C9H13 102 CH2COOC3H7 + H 122 COOH + H 103 COOC4H9 + 2H C5H11S CH(OCH2CH3)2 123 COO + 2H CO F 104 C2H5CHONO2 125 SO 31 m/z Složení iontu m/z Složení iontu 127 I 139 CO 35Cl 128 HI 141 H2C I 130 N H CH2 147 O Si O CC CH3 CH3 H3C CH3 CH3 131 C3F5 CO 149 O O O + H 135 79BrCH2CH2CH2CH2 150 138 COO + H HO 32 Bromethan 1H NMR, CDCl3 13C NMR (APT), CDCl3 33 IR – čistá látka v NaCl kyvetě 34 MS m/z 108 109 110 111 Relativní intenzita / % 100 4 102 3 35 Benzofenon-oxim 1H NMR, CDCl3 13C NMR (APT), CDCl3 36 IR – tableta KBr 37 MS m/z 197 198 199 Relativní intenzita / % 100 13,4 1,2 38 3-Nitroacetofenon 1H NMR, CDCl3 13C NMR (APT), CDCl3 39 IR 40 MS m/z 165 166 167 Relativní intenzita / % 100 8,6 0,4 41 3-Aminoacetofenon 1H NMR, CDCl3 13C NMR (APT), CDCl3 42 IR – tableta KBr 43 MS m/z 135 136 137 Relativní intenzita / % 100 19,4 0,7 44 1-(3-Nitrofenyl)ethanol 1H NMR, CDCl3 13C NMR (APT), CDCl3 45 IR – tableta KBr 46 MS m/z 167 168 Relativní intenzita / % 100 3,5 47 Ethylenacetal ethyl-3-oxobutanoátu 1H NMR, CDCl3 13C NMR (APT), CDCl3 48 IR – čistá látka v NaCl kyvetě 49 MS 50 1,2-Difenylbutan-1,2-diol 1H NMR, CDCl3 13C NMR (APT), CDCl3 51 IR – tableta KBr 52 MS 53 4-Methyl-2-(2’-nitrofenylazo)fenol IR – tableta KBr 54 MS m/z 257 258 259 Relativní intenzita / % 100 15,4 0,8 55 4-Methoxy-2-(2’-nitrofenylazo)fenol 1H NMR, CD2Cl2 3.54.04.55.05.56.06.57.07.58.0 f1(ppm) -5E+07 0 5E+07 1E+08 2E+08 2E+08 2E+08 3E+08 4E+08 4E+08 4E+08 5E+08 6E+08 6E+08 6E+08JL_01_CD2Cl2 3.00 0.95 0.95 0.91 1.06 1.08 0.93 0.99 3.85 6.91 6.93 7.05 7.06 7.07 7.08 7.27 7.28 7.55 7.55 7.56 7.57 7.72 7.74 7.74 7.99 7.99 8.01 8.01 8.08 8.08 8.10 56 13C NMR, CD2Cl2 4550556065707580859095100105110115120125130135140145150155 f1(ppm) 0 5E+07 1E+08 2E+08 2E+08 2E+08 3E+08 4E+08 4E+08JL_01_CD2Cl2 56.43 113.67 118.47 121.20 125.85 126.35 130.37 134.80 138.38 143.32 144.78 152.76 153.86 57 MS m/z 273 274 Relativní intenzita / % 100 13,2 58 4-Fenylazo-1-naftol MS m/z 248 249 250 Relativní intenzita / % 100 18,4 1,5 59 Fe(acac)3 IR – ATR 60 Cr(acac)3 IR – ATR 61 Cu(acac)2 IR – ATR 62 Mn(acac)3 IR – ATR 63 Ferrocen IR – tableta KBr 64 IR – ATR 65 MS m/z 184 185 186 187 188 Relativní intenzita / % 9,0 2,1 100 13,4 1,4 Isotopy železa a jejich zastoupení v přírodě Isotop Hmotnost / amu Zastoupení / % 54Fe 53,939612 5,845 56Fe 55,934939 91,754 57Fe 56,935396 2,1191 58Fe 57,933277 0,2819 66 Trimethyl-borát MS m/z 103 104 105 Relativní intenzita / % 27,0 100 3,8 Isotopy boru a jejich zastoupení v přírodě Isotop Hmotnost / amu Zastoupení / % 10B 10,012937 19,82 11B 11,009305 91,754 67 FeSO4 · 7 H2O IR – ATR 68