C5720 Biochemie 25_Speciální metabolické dráhy 11/26/2013 1 Petr Zbořil Obsah •Speciální metabolické dráhy. •Mikrosomální elektronový transport, cyt P450. •Nitrogenasový systém. • 11/26/2013 Petr Zbořil 2 Mikrosomální elektronový transport •Elektronový transport o– aktivace kyslíku – reakce se substrátem – monooxygenace •Řetězec elektronového transportu CYT P450 o– nutnost redukce ½ O2 •Mikrosomální omálo specifický, metabolismus xenobiotik •Mitochondriální ospecifický, metabolismus eobiotik (steroidy, MK atd.) •Základem hydroxylace ovýsledkem i dehalogenace, deaminace, N- a O-dealkylace, epoxidace aj. – multifunkční oxidázy •Lokalisace v membráně, zdrojem elektronů NADPH 11/26/2013 Footer Text 3 Systém Cyt P450 • • • • • • • • • •Schema lokalisace v membráně ER ozdrojem elektronů NADPH • 11/26/2013 Footer Text 4 Systém Cyt P450 • • • • • • • • • •Elektrony dodává z NADPH CYT P450 reduktáza o– vícefunkční enzym • 11/26/2013 Footer Text 5 Systém Cyt P450 • • • • • • • • • •CYT P450 reduktáza - obsahuje FAD i FMN • 11/26/2013 Footer Text 6 Systém Cyt P450 • • • • • • • • • • •Reakční cyklus Cyt P450 • 11/26/2013 Footer Text 7 Systém Cyt P450 • • • • • • • • • •Příklad transformace xenobiotika oalifatická hydroxylace pentobarbitalu • 11/26/2013 Footer Text 8 Systém Cyt P450 •Typy přeměn •Hydroxylace – alifatická, aromatická •O- nebo N-dealkylace •Oxidace dvojné vazby •N-oxidace •S-oxidace •Oxidační deaminace •Oxidace alkoholů •Oxidační dehalogenace • •Nomenklatura • •CytP450 1A2 rodina – 40% homologie • podrodina – 59% • isoforma • 11/26/2013 Footer Text 9 Systém Cyt P450 •57 lidských cytP450 • • • • • • • • • 11/26/2013 Footer Text 10 Sterols Xenobiotics Fatty Acids Eicosanoids Vitamins Unknown 1B1 1A1 2J2 4F2 2R1 2A7 7A1 1A2 4A11 4F3 24A1 2S1 7B1 2A6 4B1 4F8 26A1 2U1 8B1 2A13 4F12 5A1 26B1 2W1 11A1 2B6 8A1 26C1 3A43 11B1 2C8 27B1 4A22 11B2 2C9 4F11 17A1 2C18 4F22 19A1 2C19 4V2 21A2 2D6 4X1 27A1 2E1 4Z1 39A1 2F1 20A1 46A1 3A4 27C1 51A1 3A5 3A7 Systém Cyt P450 •Inducibilní enzymy – monitorování životního prostředí •XENOBIOCHEMIE • metabolismus cizorodých látek, účast P450 • • • • • • • • • • •Metabolická aktivace xenobiotik v 1. fázi – vznik reaktivních sloučenin – toxicita, kancerogenita aj. • 11/26/2013 Footer Text 11 Nitrogenasový systém •Asimilace N – ze sloučenin anorganických do organických oběžné (rostliny, mikroorganismy obecně) •N2 – inertní, problém převést na sloučeninu • kyslíkaté – výboje • redukce na NH3 – energeticky náročná • • N2 + 3H2 2NH3 DG°' = 32,6 kJ.mol-1 • •Technologicky – katalýza (pův. Os a U, dnes Fe3+, 400 – 650 oC, 10 – 40 MPa) • – Haber-Bosch 1913 • – spotřebuje ca 1% veškeré celosvětově produkované energie • •Biochemicky – enzymová katalýza + ATP • – probíhá za mírných podmínek 11/26/2013 Footer Text 12 Nitrogenasový systém •Redukce dusíku probíhá podle rovnice • • N2 + 8H+ + 8e- 2NH3 + H2 • •na každý elektron se spotřebují 2 ATP, tedy • • 16 ATP → 16 ADP + 16Pi • •Celkově • • N2 + 4NADH+ H+ + 16MgATP → 2NH3 + H2 + 4NAD+ + 16MgADP + 16Pi • •Tato redukce je omezena na několik mikroorganismů – symbiotické a volně žijící •Rhizobium – symbiont vikvovitých rostlin •Azotobacter, Klebsiella, Clostridium a cyanobakterie (vodní) • 11/26/2013 Footer Text 13 Nitrogenasový systém •Reakce je katalysována nitrogenázovým komplexem složeným oz FeS-proteinu dinitrogenasa reduktasy (složena ze 2 podjednotek o ca 65 kD, obsahuje 4Fe a 4S na dimer, citlivá na kyslík) oa MoFe-proteinu dinitrogenasy (a2b2 heterotetramer s velkým redoxním centrem obsahujícím Fe4S3 a Fe3MoS3 spojené 3 sulfidovými skupinami) • • 11/26/2013 Footer Text 14 Nitrogenasový systém •Nitrogenasová reakce může být rozložena do 3 kroků: oredukce FeS-proteinu externím donorem elektronů oredukce MoFe-proteinu redukovaným FeS-proteinem – ta je usnadněna fosforylací FeS-proteinu oredukce N2 MoFe proteinem • • 11/26/2013 Footer Text 15 Nitrogenasový systém •První reakce vyžaduje NADH a je katalysována feredoxinem. •Ve druhém stupni dochází ke spřažení s exergonickým pochodem – hydrolýzou ATP. oPodstatou je snížení redoxpotenciálu (z -250 mV na -400 mV , jinde z -350 mV na -450 mV) po fosforylaci proteinu, to umožní redukovat koncový enzym – FeMo-protein o nízkém E’0, jenž je pak schopen redukce N2. • • 11/26/2013 Footer Text 16 Přenos elektronu mezi FeS klastry • • • • • • • • • • • • • 11/26/2013 Footer Text 17 Vazba N2 v klastrech dinitrogenasy 11/26/2013 Footer Text 18 Nitrogenasový systém • • •Nitrogenasa (podobně jako RUBISCO) je syntesována ve velkých množstvích, u diazotofytů tvoří až 10% všech bílkovin (efektivita symbiosy). •Nitrogenasa redukuje i jiné substráty se strukturou podobnou N2, dobrým měřítkem její aktivity je redukce acetylenu: •HCCH + 2e- + 2H+ → H2CCH2 • • 11/26/2013 Footer Text 19 Nitrogenasový systém •Problém citlivosti ke kyslíku oprodukce leghemoglobinu odčerpávajícího O2 (v rostlinné buňce, kodován v jejím jádře) •Symbiosa – rostlina zásobuje symbionta metabolity (z TCA) • • • • • • • • • 11/26/2013 Footer Text 20 Fixace dusíku • •Možnosti GMO – nitrogenázy v rostlinách. • •Jiné typy nitrogenas (V místo Mo, účast azotoflavinu aj.) • 11/26/2013 Footer Text 21 • • • •DĚkuji za pozornost 11/26/2013 Footer Text 22