Makromolekulami krystalografie - aplikace Metody biofyzikálni chemie - seminář (C5856) Jan Novotný novotnyjan@mail.muni.cz 3. října 2016 j. Novotný 3. října 2016 1/11 Rozhodně o pravdivosti následujících tvrzení: • Pozice každého atomu molekuly v elementární buňce ovlivňuje intezitu všech reflexí. • Čím vyšší jsou hkl indexy reflexe, tím úžeji jsou rozmístěny příslušné difraktující roviny. • Rozlišení difrakčního experimentu nezávisí na počtu detekovaných reflexí. • Přesnost určení průměrné intezity dané reflexe je tím vyšší, čím větší má redundanci. • Refinement proteinu o molekulové hmotnosti 20kDa zahrnuje optimalizaci cca. 600 parametrů. • R-faktor (J^ \F0t>s — Fca/C|/ ^2 F0bs) popisuje jak inherentní chyby experimentu, tak odlišnost molekulárního modelu od reality. 1.5A 0.65A FEBS J. 2008 Jan; 275(1): 1-21. j. Novotný 3. října 2016 2/11 Rozhodně o pravdivosti následujících tvrzení: • Pozice každého atomu molekuly v elementární buňce ovlivňuje intezitu všech reflexí. • Čím vyšší jsou hkl indexy reflexe, tím úžeji jsou rozmístěny příslušné difraktující roviny. • Rozlišení difrakčního experimentu nezávisí na počtu detekovaných reflexí. • Přesnost určení průměrné intezity dané reflexe je tím vyšší, čím větší má redundanci. • Refinement proteinu o molekulové hmotnosti 20kDa zahrnuje optimalizaci cca. 600 parametrů. • R-faktor (J^ \F0t>s — Fca/C|/ ^2 F0bs) popisuje jak inherentní chyby experimentu, tak odlišnost molekulárního modelu od reality. 1.5A 0.65A FEBS J. 2008 Jan; 275(1): 1-21. j. Novotný 3. října 2016 2/11 Disorder O čem vypovídá následující výsledek difrakčního experimentu? FEBS J. 2008 Jan; 275(1): 1-21. Vysvětlete rozdíl mezi pojmy static a dynamic disorder? j. Novotný 3. října 2016 3 / 11 Řešení fázového problému: izomorfní náhrada Na jakých předpokladech je založen tento přístup? j. Novotný 3. října 2016 4 / 11 Řešení fázového problému: izomorfní náhrada Na jakých předpokladech je založen tento přístup? Fpn = Fp + FH Je dán vektor Fh a amplitudy |Fp| a |Fph|- Načrtněte možné fáze strukturního faktoru Fp j. Novotný 3. října 2016 4 / 11 Řešení fázového problému: izomorfní náhrada Na jakých předpokladech je založen tento přístup? Fpn = Fp + FH Je dán vektor Fh a amplitudy \Fp strukturního faktoru \Fp lm Fph - Načrtněte možné fáze SAXS Načrtněte odhad závislosti intezity rozptýleného záření pro dvě částice o různých velikostech? SAXS Načrtněte odhad závislosti intezity rozptýleného záření pro dvě částice o různých velikostech? SAXS Načrtněte odhad závislosti intezity rozptýleného záření pro dvě částice o různých velikostech? 29 ~1 /velikost Do schématu závislosti SAXS experimentu na rozptylovém vektoru doplňte klíčový typ informace, kterou lze získat z jednotlivých regionů. 3 O) O j. Novotný Heimo Schnablegger, The Basics of Small-Angle )^pRay 3. října 2016 5 / 11 SAXS Načrtněte odhad závislosti intezity rozptýleného záření pro dvě částice o různých velikostech? 29 ~1 /velikost Do schématu závislosti SAXS experimentu na rozptylovém vektoru doplňte klíčový typ informace, kterou lze získat z jednotlivých regionů. Shape Size Surface tí O ▼ iog(<7) Radius of Gyration / Cross-section Structure / Surface per Volume j. Novotný Heimo Schnablegger, The Basics of Small-Angle )^pRay 3. října 2016 5 / 11 Tvar molekuly Vysvětlete význam přiložených diagramů SAXS experimentu provedeného na homogenní částici. Přiřaďte ke každé dvojici odpovídající tvar částice: válec, koule, disk Heimo Schnablegger, The Basics of Small-Angle X-Ray Scattering j. Novotný ■E "o ^ o' 3. října 2016 6 / 11 Tvar molekuly Vysvětlete význam přiložených diagramů SAXS experimentu provedeného na homogenní částici. Přiřaďte ke každé dvojici odpovídající tvar částice: válec, koule, disk Heimo Schnablegger, The Basics of Small-Angle X-Ray Scattering j. Novotný ■E "o ^ o' 3. října 2016 6 / 11 Příprava vzorku biomolekuly pro strukturní analýzu K uvedeným charakteristikám se pokuste uvést příklad exp. metody k jejich zjištění: O Homogenita, čistota O Fold, rozpustnost O Monodisperzní O Aktivita O Stabilita j. Novotný 3. října 2016 7 / 11 Příprava vzorku biomolekuly pro strukturní analýzu K uvedeným charakteristikám se pok zjištění: O Homogenita, čistota Q Fold, rozpustnost O Monodisperzní Aktivita O Stabilita uvést příklad exp. metody k jejich • ELF, MASS • CD, FTIR • DLS, DOSY • enzymatic assay • (viz výše) j. Novotný 3. října 2016 7 / 11 Rentgenová krystalografie vs. SAS vs. N M R spektroskopie Kterou z metod považujete za vhodnější pro řešení následujících problémů a proč? A) Řešení struktury membránového proteinu. B) Určení protonačního stavu cytosinového nukleotidu v i-motivu DNA. C) Strukturní analýza proteinového komplexu o Mr=l MDa. D) Analýza radiální distribuční funkce solvatačního obalu kationtu. E) Strukturní analýza metalloproteinu s paramagnetickým centrem. F) Studium segmentového pohybu domény. H) Určení rozměrů příčného řezu celulózové mikrofibrily ve Inu. j. Novotný 3. října 2016 8 / 11 Rentgenová krystalografie vs. SAS vs. N M R spektroskopie Kterou z metod považujete za vhodnější pro řešení následujících problémů a proč? A) Řešení struktury membránového proteinu. X-ray či ssNMR B) Určení protonačního stavu cytosinového nukleotidu v i-motivu DNA. NMR C) Strukturní analýza proteinového komplexu o Mr=l MDa. X-ray D) Analýza radiální distribuční funkce solvatačního obalu kationtu. SANS E) Strukturní analýza metalloproteinu s paramagnetickým centrem. X-ray F) Studium segmentového pohybu domény. NMR H) Určení rozměrů příčného řezu celulózové mikrofibrily ve Inu. SAXS j. Novotný 3. října 2016 8 / 11 Použitá literatura Wlodawer, Alexander et al. "Protein Crystallography for Non-Crystallographers, or How to Get the Best (but Not More) from Published Macromolecular Structures." The FEBS journal 275.1 (2008): 1-21. http://dasher.wustl.edu/bio5357/reading/eisenberg-xray-79.pdf R.M. Sweet: Fundamentals of Crystallography j. Novotný 3. října 2016 9 / 11 Příště: Luminiscenční metody j. Novotný 3. října 2016 10 / 11