UV-VIS absorpční a luminiscenční metody, Metody biofyzikálni chemie - seminář (C5856) Jan Novotný novotnyjan@mail.muni.cz 17. října 2016 J. Novotný 17. října 2016 1/20 Spektroskopické metody - kontext Doplňte údaje v přiložené tabulce: Spektrální oblast Pozorovaný děj Příklad metody X-rays UV-VIS IR MW RW J. Novotný 17. října 2016 2 / 20 Spektroskopické metody - kontext Doplňte údaje v přiložené tabulce: Spektrální oblast Pozorovaný děj Příklad metody X-rays přechody vnitřních e- absorpce, difrakce, SAXS UV-VIS valenční e- absorpce, CD, luminiscence IR molekulární vibrace IC spektroskopie, Ramanův rozptyl MW přechody e_ spinu, molekulární rotace EPR, rotační spektroskopie RW přechody jaderného spinu NMR J. Novotný 17. října 2016 2 / 20 Energetický digram Doplňte diagram a srovnejte děje podle parametrů v přiložené tabulce: S2 3 Si 6 U So i hvA^ Děj časová škála k vs. kvib pořadí Amax Absorpce Fluorescence Fosforescence J. Novotný 17. října 2016 3 / 20 Energetický digram Doplňte diagram a srovnejte děje podle parametrů v přiložené tabulce: S2 Internal I Conversion j_ Absorption hvA^ Intersystem Irossing_ Fluorescence hvp«1 Phosphorescence Děj časová škála k vs. kv-,b pořadí \max Absorpce 10_15s 1 Fluorescence 10_9s < 2 Fosforescence 10°s < 3 < □ ► < S ► < -e ► < -ž ► -š -OQ,O Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Stabilizace excitovaného stavu vede k posunu absorpčního maxima k vyšší frekvenci. J. Novotný < rS? ► < = * < -ž ► -š -OO 17. října 2016 4 / 20 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Stabilizace excitovaného stavu vede k posunu absorpčního maxima k vyšší frekvenci. O Extinkční koeficient je úměrný přechodovému integrálu, ploše chromoforu a koncentraci detekované molekuly. J. Novotný 17. října 2016 4 / 20 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Stabilizace excitovaného stavu vede k posunu absorpčního maxima k vyšší frekvenci. O Extinkční koeficient je úměrný přechodovému integrálu, ploše chromoforu a koncentraci detekované molekuly. O Elektronové přechody zachovávající paritu jsou pro centrosymetrické molekuly zakázané. J. Novotný 17. října 2016 4 / 20 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Stabilizace excitovaného stavu vede k posunu absorpčního maxima k vyšší frekvenci. O Extinkční koeficient je úměrný přechodovému integrálu, ploše chromoforu a koncentraci detekované molekuly. O Elektronové přechody zachovávající paritu jsou pro centrosymetrické molekuly zakázané. O Hypochromní posun znamená přechod k nižší hodnotě vlnové délky. J. Novotný 17. října 2016 4 / 20 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Stabilizace excitovaného stavu vede k posunu absorpčního maxima k vyšší frekvenci. O Extinkční koeficient je úměrný přechodovému integrálu, ploše chromoforu a koncentraci detekované molekuly. O Elektronové přechody zachovávající paritu jsou pro centrosymetrické molekuly zakázané. Q Hypochromní posun znamená přechod k nižší hodnotě vlnové délky. O Ve spektru chlorofylu nalezneme dvě maxima: 450nm a 700nm. J. Novotný 17. října 2016 4 / 20 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Stabilizace excitovaného stavu vede k posunu absorpčního maxima k vyšší frekvenci. O Extinkční koeficient je úměrný přechodovému integrálu, ploše chromoforu a koncentraci detekované molekuly. O Elektronové přechody zachovávající paritu jsou pro centrosymetrické molekuly zakázané. Q Hypochromní posun znamená přechod k nižší hodnotě vlnové délky. O Ve spektru chlorofylu nalezneme dvě maxima: 450nm a 700nm. O Molekuly schopné fluorescence jsou obvykle rigidní aromatické sloučeniny s omezenou vibrační svobodou. J. Novotný 17. října 2016 4 / 20 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Stabilizace excitovaného stavu vede k posunu absorpčního maxima k vyšší frekvenci. O Extinkční koeficient je úměrný přechodovému integrálu, ploše chromoforu a koncentraci detekované molekuly. O Elektronové přechody zachovávající paritu jsou pro centrosymetrické molekuly zakázané. Q Hypochromní posun znamená přechod k nižší hodnotě vlnové délky. O Ve spektru chlorofylu nalezneme dvě maxima: 450nm a 700nm. O Molekuly schopné fluorescence jsou obvykle rigidní aromatické sloučeniny s omezenou vibrační svobodou. O Fosforescence označuje emisi fotonu ze stavu o multiplicitě jedna. J. Novotný 17. října 2016 4 / 20 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Stabilizace excitovaného stavu vede k posunu absorpčního maxima k vyšší frekvenci. O Extinkční koeficient je úměrný přechodovému integrálu, ploše chromoforu a koncentraci detekované molekuly. O Elektronové přechody zachovávající paritu jsou pro centrosymetrické molekuly zakázané. Q Hypochromní posun znamená přechod k nižší hodnotě vlnové délky. O Ve spektru chlorofylu nalezneme dvě maxima: 450nm a 700nm. O Molekuly schopné fluorescence jsou obvykle rigidní aromatické sloučeniny s omezenou vibrační svobodou. O Fosforescence označuje emisi fotonu ze stavu o multiplicitě jedna. O Rotační korelační čas je menší pro objemnější molekuly ve viskóznějším prostředí. J. Novotný 17. října 2016 4 / 20 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Stabilizace excitovaného stavu vede k posunu absorpčního maxima k vyšší frekvenci. O Extinkční koeficient je úměrný přechodovému integrálu, ploše chromoforu a koncentraci detekované molekuly. O Elektronové přechody zachovávající paritu jsou pro centrosymetrické molekuly zakázané. Q Hypochromní posun znamená přechod k nižší hodnotě vlnové délky. O Ve spektru chlorofylu nalezneme dvě maxima: 450nm a 700nm. O Molekuly schopné fluorescence jsou obvykle rigidní aromatické sloučeniny s omezenou vibrační svobodou. O Fosforescence označuje emisi fotonu ze stavu o multiplicitě jedna. O Rotační korelační čas je menší pro objemnější molekuly ve viskóznějším prostředí. O Příčinou Stokesova posunu je nezářivá vibrační relaxace. J. Novotný 17. října 2016 4 / 20 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Stabilizace excitovaného stavu vede k posunu absorpčního maxima k vyšší frekvenci. O Extinkční koeficient je úměrný přechodovému integrálu, ploše chromoforu a koncentraci detekované molekuly. O Elektronové přechody zachovávající paritu jsou pro centrosymetrické molekuly zakázané. Q Hypochromní posun znamená přechod k nižší hodnotě vlnové délky. O Ve spektru chlorofylu nalezneme dvě maxima: 450nm a 700nm. O Molekuly schopné fluorescence jsou obvykle rigidní aromatické sloučeniny s omezenou vibrační svobodou. O Fosforescence označuje emisi fotonu ze stavu o multiplicitě jedna. O Rotační korelační čas je menší pro objemnější molekuly ve viskóznějším prostředí. O Příčinou Stokesova posunu je nezářivá vibrační relaxace. ® Doba života fluorescence závisí nepřímo úměrně na sumě rychlostních konstant zářivých i nezářivých dějů. ■WJ0 17. října 2016 4 / 20 Úloha 1 Ke strukturám uvedených látek přiřaďte název, biochemickou úlohu a typ elektronového přechodu: J. Novotný 17. října 2016 5 / 20 Úloha 1 Ke strukturám uvedených látek přiřaďte název, biochemickou úlohu a typ elektronového přechodu: hem - hemoglobin, myoglobin Úloha 2: Konjugace Která z uvedených sloučenin bude absorbovat při vyšší vlnové délce a proč? J. Novotný 17. října 2016 6 / 20 Úloha 2: Konjugace Která z uvedených sloučenin bude absorbovat při vyšší vlnové délce a proč? S délkou konjugovaného systému klesá H 0 M 0-L UMO gap a narůstá A Úloha 3: Vliv pH na absorpční spektrum Pokuste se přiřadit velikost extinkčního koeficientu a absorpčního maxima pro tyrosin při pH < pKa a pH > pKa. Své tvrzení zdůvodněte. >4i,£i = 270nm, 1450 A2,e2 = 287nm, 2600 J. Novotný 17. října 2016 7 / 20 Úloha 3: Vliv pH na absorpční spektrum Pokuste se přiřadit velikost extinkčního koeficientu a absorpčního maxima pro tyrosin při pH < pKa a pH > pKa. Své tvrzení zdůvodněte. AU£! = 270nm, 1450 -OH pH < pKa A2,e2 = 287nm, 2600 -0~ pH > pKa J. Novotný 17. října 2016 7 / 20 Úloha 4: Retinal Na obrázku je znázorněna struktura zrakového pigmentu retinalu. Identifikujte HOMO a LUMO orbitaly (levý sloupec). Pokuste se odhadnout jaky efekt má vazba kvartérního dusíku na hodnotu \max. Na základě analýzy diferenční elektronové hustoty (pravý sloupec) ukažte orientaci tranzitního dipólového momentu. Top view Side view M. Mohseni, Y. Omar, G. S. Engel, M. B. Plenio: Quantum effects in biology J. Novotný 17. října 2016 8 / 20 Úloha 5: Lambert-Beerův zákon Molární extinkční koeficient roztoku při 540 nm je 268 dm3mol-1cm-1. Při průchodu světla o uvedené vlnové délce roztokem o optické délce 7.5 mm došlo k absorpci 52.3% intenzity. Jaká byla koncentrace rozpuštěné látky? J. Novotný 17. října 2016 9 / 20 Úloha 5: Lambert-Beerův zákon Molární extinkční koeficient roztoku při 540 nm je 268 dm3mol-1cm-1. Při průchodu světla o uvedené vlnové délce roztokem o optické délce 7.5 mm došlo k absorpci 52.3% intenzity. Jaká byla koncentrace rozpuštěné látky? Řešení A = logj^, A = e.c.l log 'out 1 0.477 £.1 0.321 298,0.75 1.6 mM J. Novotný 17. října 2016 9 / 20 Úloha 6: Výpočet tranzitního momentu Uvažme konjugovaný systém 7r-elektronů popsaný vlnovou funkcí částice v jednorozměrné potenciálové jámě.A) Ukažte, jak se energie excitace mění s délkou jámy. B) Odvoďte analyticky i graficky, že pravděpodobnost přechodu n = 1 —>► 2 je nenulová na rozdíl od n = 1 —>► 3. Nápověda: Vlastní stacionární funkce elektronu v potenciálové jámě o délce L má tvar i/jn = Asin^x J. Novotný 17. října 2016 10 / 20 Úloha 6: Výpočet tranzitního momentu Uvažme konjugovaný systém 7r-elektronů popsaný vlnovou funkcí částice v jednorozměrné potenciálové jámě.A) Ukažte, jak se energie excitace mění s délkou jámy. B) Odvoďte analyticky i graficky, že pravděpodobnost přechodu n = 1 —>► 2 je nenulová na rozdíl od n = 1 —>► 3. Nápověda: Vlastní stacionární funkce elektronu v potenciálové jámě o délce L má tvar i/jn = Asin^x Řešení A=y/l/f0LSm^xáx=y/l So* ,0 sm^fx(-h2 d2 2 m dx2 sin 7r.n xdx = h2 ttV 2m L2 Ml^2 = eA2 J0L sin^xdx = L 2 m L2 7T.1 * 7T.2 q sinx.x.sin Ml 2 = eA2 J0L 0 Sm L l^xdx = 1 g*u*u=g x.x.sm^xdx = 0 g*u*g=u 7T.1 „ „ „:„ 7T.3 sina.sin/3 = ^[cos(a — f3) — cos(a + f3)] f x.cosax = -sinax + -^-cosax J. Novotný ŕ o ¥1 ¥2 ¥1>2 x - dipól moment / ______________ V x - dipól m ¥1 - ,¥3 - ¥1 ¥3 — oment ---------- 17. října 2016 10 / 20 Úloha 7 Ke strukturám uvedených fluorescenčních sond přiřaďte zkratky a biochemickou aplikaci DAPI, ddATP-Dye, DPH, TNS J. Novotný 17. října 2016 11 / 20 Úloha 7 Ke strukturám uvedených fluorescenčních sond přiřaďte zkratky a biochemickou aplikaci TNS ddATP-dye proteiny sekvencování DAPI, ddATP-Dye, DPH, TNS J. Novotný 17. října 2016 11 / 20 Úloha 8: Fluorescenční metody Přiřaďte vhodnou strategii využívající fluorescenční spektroskopie k následujícím úlohám: A) Měření hydrodynamického poloměru proteinu. B) DNA hybridizace. C) Lokalizace Trp residua (na povrchu či v nitru proteinu). D) Zastoupení nenasycených mastných kyselin v biomembráně. E) Určení asociační konstanty dimerizace eosinu. J. Novotný 17. října 2016 12 / 20 Úloha 8: Fluorescenční metody Přiřaďte vhodnou strategii využívající fluorescenční spektroskopie k následujícím úlohám: A) Měření hydrodynamického poloměru proteinu, anizotropie značky-korelační čas B) DNA hybridizace. FRET C) Lokalizace Trp residua (na povrchu či v nitru proteinu), zhášení, Stokesův posun D) Zastoupení nenasycených mastných kyselin v biomembráně. viskozita-anizotropie DPH E) Určení asociační konstanty dimerizace eosinu. emise excimeru J. Novotný 17. října 2016 12 / 20 Úloha 9: FREI Pokuste se interpretovat fluorescenční experiment provedený na komplexu proteinkinázy tvořené dvěma katalytickými (C) a dvěma receptorovými jednotkami (R). Obě jednotky jsou označeny fluorescenčními značkami: jednotka C fluoresceinem (Fl) a jednotka R rhodaminem (Rh). V nativní formě R2C2 lze detekovat FRET. Určete směr přenosu a vysvětlete vliv přídavku cAMP a inhibitoru PKI na podobu spektra. J. Novotný 17. října 2016 13 / 20 Úloha 9: FREI Pokuste se interpretovat fluorescenční experiment provedený na komplexu proteinkinázy tvořené dvěma katalytickými (C) a dvěma receptorovými jednotkami (R). Obě jednotky jsou označeny fluorescenčními značkami: jednotka C fluoresceinem (Fl) a jednotka R rhodaminem (Rh). V nativní formě R2C2 lze detekovat FRET. Určete směr prenosu a vysvětlete vliv přídavku cAMP a inhibitoru PKI na podobu spektra. J. Novotný 17. října 2016 13 / 20 Úloha 10: Kinetické parametry fluorescence Eosinový flourofor je charakterizován kvantovým výtěžkem 0.65 a dobou života fluorescence 3.1 ns. Vypočtěte rychlostní konstantu zářivého, nezářivého přechodu a vlastní dobu života fluorescence. J. Novotný 17. října 2016 14 / 20 Úloha 10: Kinetické parametry fluorescence Eosinový flourofor je charakterizován kvantovým výtěžkem 0.65 a dobou života fluorescence 3.1 ns. Vypočtěte rychlostní konstantu zářivého, nezářivého přechodu a vlastní dobu života fluorescence. Řešení 0 = T = r+/cnr' r+/cnr Rychlostní konstanty: ľ = %65 = 0.21 ns"1 3.1 r kru r 3.1 -0.21 = 0.11 ns -i J. Novotný 17. října 2016 14 / 20 Úloha 11: Perrinova rovnice Za předpokladu exponenciálního poklesu intenzity /(ŕ) a anizotropie r(t) fluorescenčního signálu odvoďte vztah mezi anizotropií r, dobou života r a rotačním korelačním časem 6. Při výpočtu vyjděte z definice časově váženého průměru anizotropie r: J0°° r(ŕ)/(ŕ)dŕ r - /~ /(t)dt J. Novotný 17. října 2016 15 / 20 Úloha 11: Perrinova rovnice Za předpokladu exponenciálního poklesu intenzity /(ŕ) a anizotropie r(r) fluorescenčního signálu odvoďte vztah mezi anizotropií r, dobou života r a rotačním korelačním časem 6. Při výpočtu vyjděte z definice časově váženého průměru anizotropie r: r = J0°° r(ŕ)/(ŕ)dŕ Jo°° '(*)dt / = /0e r = r0e 0 r = /pro/-e ŕ(' + ^)dŕ _ r0(l + l) 1 /o/0°°e rdt J. Novotný 17. října 2016 15 / 20 Úloha 12: FREI Lidský sérový albumin obsahuje jediné Trp residuum na pozici 214. Vzorek byl kovalentně označen na Cys 34 athranilovým fluoroforem. Forsterova vzdálenost Rq pro FRET přenos z Trp na anthranoyl je 30.3Ä. Za použití emisního spektra vypočtěte vzdálenost mezi oběma aminokyselinami v molekule. Pro rychlostní konstantu rezonančního přenosu platí 'RET 260 340 420 WAVELENGTH ( nm ) J. Novotný 17. října 2016 16 / 20 Úloha 12: FREI Lidský sérový albumin obsahuje jediné Trp residuum na pozici 214. Vzorek byl kovalentně označen na Cys 34 athranilovým fluoroforem. Forsterova vzdálenost Rq pro FRET přenos z Trp na anthranoyl je 30.3Ä. Za použití emisního spektra vypočtěte vzdálenost mezi oběma aminokyselinami v molekule. Pro rychlostní konstantu rezonančního přenosu platí kRET = r(*)6. Řešení Cb = _1_ = _1_ = r r+kRET r+r(^)6 Ro+r6 Kvantový výtěžek 0 pro vlnovou délku 340 nm: emise albuminu s akceptorem/emise volného albuminu=0.2/0.55 0 = 0.364 = r = -^4- = 28Á Úloha 14: Monitorování konverze pomocí UV-VIS spektra Na obrázku je záznam VIS-spektra bromthymolové modři v závislosti na měnícím se pH. a) Jak se nazývá bod ve spektru označený hvězdičkou a jakou vlastností se vyznačuje? b) K absorpčním maximům přiřaďte entity Hind a lnd~. c) Vyjádřete poměr konjugované kyseliny a báze pomocí aktuálních hodnot absorbancí A(Ai), A(A2) a jejich limitních hodnot A(Ai)max a A(A2)max- Úloha 14: Monitorování konverze pomocí UV-VIS spektra Na obrázku je záznam VIS-spektra bromthymolové modři v závislosti na měnícím se pH. a) Jak se nazývá bod ve spektru označený hvězdičkou a jakou vlastností se vyznačuje? b) K absorpčním maximům přiřaďte entity Hind a lnd~. c) Vyjádřete poměr konjugované kyseliny a báze pomocí aktuálních hodnot absorbancí A(Ai), A(A2) a jejich limitních hodnot A(Ai)max a A(A2)max- Řešení Ol u n O l/l 350 400 450 500 550 WaveTength.nm 600 650 700 J. Novotný a) isosbestický bod: e(Hlnd)x* b) Hind Ai = 430nm, lnd~ X2 e(lnd )x-620nm c) [Hind] = A(X1).A(X2)max [lnd~] A(X2).A(X1)max 17. října 2016 17 / 20 Úloha 13: Frank-Condonův faktor Základní stav hypotetické molekuly je popsán vibrační vlnovou funkcí A/o.e-a(x-x°) . Vypočítejte Franck-Condonův faktor pro přechod do stavu /Vi.e"a(x-X1)2. J. Novotný 17. října 2016 18 / 20 Použitá a doporučená literatura Franz-Xaver Schmid: Biological Macromolecules: UV-visible Spectrophotometry M. Mohseni, Y. Omar, G. S. Engel, M. B. Plenio: Quantum effects in biology Joseph R. Lakowicz: Principles of Fluorescence Spectroscopy P. Atkins, J. de Paula: Physical Chemistry http://www.cyut.edu.tw/wjchien/BiopolymerSpect/text/absorption.pdf J. Novotný 17. října 2016 19 / 20 Příště: M. Novák-NMR spektroskopie J. Novotný 17. října 2016 20 / 20