NMR Spektroskopie Metody biofyzikálni chemie - seminář (C5856) Martin Novák 323460@mail.muni.cz 24. října 2016 M. Novák 24. října 2016 1/17 Interakce jaderného spinového momentu - kontext Doplňte k zadaným interakčním mechanismům symbolické znázornění a příslušný Hamiltonián: Dipol-dipolová interakce Chemický posun Nepřímá spin-spinová interakce Hj = -fi.Bind oc 7//z.a.8o H u oc 7/7i(3cr°3S y 1]Uj H u oc 2irJ.tJj 24. října 2016 2 / 17 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Metodou NMR strukturní analýzy se rutinně studují biosystémy o velikosti do 10 kDa. M. Novák 24. října 2016 3 / 17 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Metodou NMR strukturní analýzy se rutinně studují biosystémy o velikosti do 10 kDa. O Nukleární Overhauserův efekt umožňuje korelovat NMR aktivní jádra pouze v rámci jednoho spinového systému. M. Novák 24. října 2016 3 / 17 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Metodou NMR strukturní analýzy se rutinně studují biosystémy o velikosti do 10 kDa. Q Nukleární Overhauserův efekt umožňuje korelovat NMR aktivní jádra pouze v rámci jednoho spinového systému. O V NMR pevné fáze jsou spektra ovlivněna anizotropií chemického stínění a přímou dipól-dipólovou interakcí I. Novák 24. října 2016 3 / 17 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Metodou NMR strukturní analýzy se rutinně studují biosystémy o velikosti do 10 kDa. O Nukleární Overhauserův efekt umožňuje korelovat NMR aktivní jádra pouze v rámci jednoho spinového systému. O V NMR pevné fáze jsou spektra ovlivněna anizotropií chemického stínění a přímou dipól-dipólovou interakcí O Rozlišení signálů v NMR spektru roste s velikostí externího magnetického pole, protože rezonanční frekvence je úměrná Bq. M. Novák 24. října 2016 3 / 17 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Metodou NMR strukturní analýzy se rutinně studují biosystémy o velikosti do 10 kDa. O Nukleární Overhauserův efekt umožňuje korelovat NMR aktivní jádra pouze v rámci jednoho spinového systému. O V NMR pevné fáze jsou spektra ovlivněna anizotropií chemického stínění a přímou dipól-dipólovou interakcí O Rozlišení signálů v NMR spektru roste s velikostí externího magnetického pole, protože rezonanční frekvence je úměrná 60. O Rezonanční signál ovlivněný pomalou výměnou vzhledem k NMR časové škále se projevuje ve spektru rozšírením a polohou rezonanční linie odpovídající váženému průměru chemických posunů limitních stavů. M. Novák 24. října 2016 3 / 17 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Metodou NMR strukturní analýzy se rutinně studují biosystémy o velikosti do 10 kDa. O Nukleární Overhauserův efekt umožňuje korelovat NMR aktivní jádra pouze v rámci jednoho spinového systému. O V NMR pevné fáze jsou spektra ovlivněna anizotropií chemického stínění a přímou dipól-dipólovou interakcí O Rozlišení signálů v NMR spektru roste s velikostí externího magnetického pole, protože rezonanční frekvence je úměrná 60. O Rezonanční signál ovlivněný pomalou výměnou vzhledem k NMR časové škále se projevuje ve spektru rozšírením a polohou rezonanční linie odpovídající váženému průměru chemických posunů limitních stavů. O NMR spektrum proteinu s malým stupněm strukturovanosti(foldu) se vyznačuje úzkými signály a malou disperzí. M. Novák 24. října 2016 3 / 17 Úlohy na rozjezd - rozhodněte o pravdivosti následujících tvrzení O Metodou NMR strukturní analýzy se rutinně studují biosystémy o velikosti do 10 kDa. O Nukleární Overhauserův efekt umožňuje korelovat NMR aktivní jádra pouze v rámci jednoho spinového systému. O V NMR pevné fáze jsou spektra ovlivněna anizotropií chemického stínění a přímou dipól-dipólovou interakcí O Rozlišení signálů v NMR spektru roste s velikostí externího magnetického pole, protože rezonanční frekvence je úměrná 60. O Rezonanční signál ovlivněný pomalou výměnou vzhledem k NMR časové škále se projevuje ve spektru rozšířením a polohou rezonanční linie odpovídající váženému průměru chemických posunů limitních stavů. O NMR spektrum proteinu s malým stupněm strukturovanosti(foldu) se vyznačuje úzkými signály a malou disperzí. O Počet signálů v uhlíkovém ID NMR spektru určité molekuly odpovídá počtu neekvivalentních atomů izotopu 13C. ■JIJMJ 24. října 2016 3 / 17 Úloha 1: Chemický posun - identifikace aminokyselin Pro daná 13 C N MR spektra určete, jaké aromatické aminokyselině náleží a HO H NHj H O CH2 \ / phenylalanine iso i go ' i4o ' 120 ' íóo 1 s'o e'o 40 20 ô PPM HO H NH2 O CH, OH tyrosine 1 éo 1 éo Uo 1 lio ' i óo S 1 ěí) 4b 1 PPM Úloha 2: Chemický posun - rozlišení Pro dané systémy, rozhodněte, který z dvojice označených atomů bude mít vyšší hodnotou chemického posunu: M. Novák 24. října 2016 5 / 17 Úloha 3: J-coupling a konformace vazby, Karplusova rovnice Pro určení torzního úhlu v kovalentních strukturách slouží analýza vicinálních spin-spinových konstant (tzv. 3J-coupling). • Kvalitativní pohleď. Na základě srovnání orbitálního překryvu rozhodněte, v jaké konfiguraci nabývá 3J větší hodnoty. /=J" Hw" H • Kvantitativní pohled: K určení konformace cukr-fosfátové páteře nukleových kyselin se používá Karplusova rovnice parametrizovaná mj. pro interakci H5' a P: Jhcop = 15.3cos cp — 6.2cos(/? + 1.5. Vypočtěte hodnotu konstanty pro znázorněné konformery a charakterizujte je pomocí velikosti standartního úhlu /3 : Úloha 3: J-coupling a konformace vazby, Karplusova rovnice Pro určení torzního úhlu v kovalentních strukturách slouží analýza vicinálních spin-spinových konstant (tzv. 3J-coupling). • Kvalitativní pohleď. Na základě srovnání orbitálního překryvu rozhodněte, v jaké konfiguraci nabývá 3J větší hodnoty. s s \/ 9 Kvantitativní pohled: K určení konformace cukr-fosfátové páteře nukleových kyselin se používá Karplusova rovnice parametrizovaná mj. pro interakci H5' a P: Jhcop = 15.3cos cp — 6.2cos(/? + 1.5. Vypočtěte hodnotu konstanty pro znázorněné konformery a charakterizujte je pomocí velikosti standartního úhlu /3 : C4' C4' 24. října 2016 6 / 17 Úloha 3: J-coupling a konformace vazby, Karplusova rovnice Pro určení torzního úhlu v kovalentních strukturách slouží analýza vicinálních spin-spinových konstant (tzv. 3J-coupling). • Kvalitativní pohled: Na základě srovnání orbitálního překryvu rozhodněte, v jaké konfiguraci nabývá 3J větší hodnoty. Kvantitativní pohled: K určení konformace cukr-fosfátové páteře nukleových kyselin se používá Karplusova rovnice parametrizovaná mj. pro interakci H5' a P: Jhcop = 15.3cos cp — 6.2cos(/? + 1.5. Vypočtěte hodnotu konstanty pro znázorněné konformery a charakterizujte je pomocí velikosti standartního úhlu /3 : H5" H5' cp = 180° H5" 3J - 23 Hz \J - 2 Hz I. Novák 24. října 2016 6 / 17 Úloha 3: J-coupling a konformace vazby Pomocí přiloženého ID H NMR spektra odhadněte poměr a a [3 izomeru v roztoku D-glukopyranozy naměřeném v D2O. Úloha 3: J-coupling a konformace vazby Pomocí přiloženého ID H NMR spektra odhadněte poměr a a [3 izomeru v roztoku D-glukopyranozy naměřeném v D2O. Z!Í " ' ' ' To ^ 3.5 ~' 3*0 6 Úloha 4: Relaxační mechanismy Návrat N M R signálu do rovnovážného stavu se děje dvěma ději: tzv. spin-mříž kovo u a spin-spinovou relaxací. Na základě přiloženého popisu přiřaďte odpovídající křivku závislosti relaxačního času Ti, T 2 na rychlosti pohybu. Spin-mřížková relaxace odpovídá konverzi 01 T± (3 stavu vlivem lokálních fluktuací magnetického pole o frekvenci blízké rezonanční frekvenci. Je charakterizovaná kinetickým parametrem T\. Spin-spinová relaxace odpovídá ztrátě koherence excitovaného signálu (rozfázovaní) vlivem lokálních fluktuací magnetického pole. Pomalý pohyb vystavuje spin v molekule nehomogenitám a vede ke změně precesní frekvence, zatímco rychlý pohyb průměruje lokální změny pole a spin-spinová relaxace je méně účinná. Je charakterizovaná kinetickým parametrem T2. Low temperature, high viscosity High temperature, low viscosity Rate of motion ■š ► -š -O O 24. října 2016 8 / 17 Úloha 4: Relaxační mechanismy Návrat N M R signálu do rovnovážného stavu se děje dvěma ději: tzv. spin-mříž kovo u a spin-spinovou relaxací. Na základě přiloženého popisu přiřaďte odpovídající křivku závislosti relaxačního času Ti, T 2 na rychlosti pohybu. Spin-mřížková relaxace odpovídá konverzi 01 T± (3 stavu vlivem lokálních fluktuací magnetického pole o frekvenci blízké rezonanční frekvenci. Je charakterizovaná kinetickým parametrem T\. Spin-spinová relaxace odpovídá ztrátě koherence excitovaného signálu (rozfázovaní) vlivem lokálních fluktuací magnetického pole. Pomalý pohyb vystavuje spin v molekule nehomogenitám a vede ke změně precesní frekvence, zatímco rychlý pohyb průměruje lokální změny pole a spin-spinová relaxace je méně účinná. Je charakterizovaná kinetickým parametrem T2. Low High temperature, temperature, high viscosity low viscosity Rate of motion M. Novák < rfP ► < ► < -ž ► š -OQ,O 24. října 2016 8 / 17 Úloha 5: Příklady strukturně-biologických aplikací K uvedeným problémům strukturní analýzy přiřaďte odpovídající techniku: Potlačení dipol-dipolové relaxace u proteinu Rozlišení intra- a intermolekulárních kontaktů v komplexu ligand-receptor Odstranění signálů labilních protonů v molekule nukleové kyseliny Přiřazení málo rozlišených signálů v nestrukturované části proteinu Mapování reziduí směřujících k povrchu proteinu Převedení vzorku do D2O 13C editované NOESY spektrum Exprese proteinu v deuterovaném médiu Aplikace paramagnetických sond Multidimenzionální inverzní experimenty (4D, 5D) M. Novák 24. října 2016 9 / 17 Úloha 5: Příklady strukturně-biologických aplikací K uvedeným problémům strukturní analýzy přiřaďte odpovídající techniku: Potlačení dipol-dipolové relaxace u proteinu Rozlišení intra- a intermolekulárních kontaktů v komplexu ligand-receptor Odstranění signálů labilních protonů v molekule nukleové kyseliny Přiřazení málo rozlišených signálů v nestrukturované části proteinu Mapování reziduí směřujících k povrchu proteinu exprese proteinu v deuterovaném médiu 13 C editované NOESY spektrum převedení vzorku do D2O multidimenzionální inverzní experimenty (4D, 5D) aplikace paramagnetických sond M. Novák 24. října 2016 9 / 17 Úloha 6: Protein vs. Nukleové kyseliny: NMR aspekty Diskutujte o následujících praktických okolnostech NMR experimentů při srovnání protein vs. DNA/RNA: Syntéza vzorku Izotopické značení Hustota 1H Sekvenční přiřazení Restrainy pro určení struktury Proteiny NA 24. října 2016 10 / 17 Úloha 6: Protein vs. Nukleové kyseliny: NMR aspekty Diskutujte o následujících praktických okolnostech NMR experimentů při srovnání protein vs. DNA/RNA: Proteiny NA Syntéza vzorku in vivo chemickou cestou Izotopické značení snadné nákladné Hustota 1H rel. vysoká nizsi Sekvenční přiřazení přes vazby: J-coupling dipól-dopólová interakce: NOE Restrainy pro určení struktury 5: alfa vs. beta, NOE, RDC mj. NOE, RDC, J-coupling(riboza), P M. Novák 24. října 2016 10 / 17 Úloha 7: Sekvenční přirazení peptidu Pomocí fiktivních výsledků (strip-plotu) 3D NMR experimentů (HNCA, HN(CO)CA) určete N—sekvenci hypotetického peptidu. Dbejte na správné pořadí od N-konce k C-konci peptidu. S L N Q T M. Novák 24. října 2016 11 / 17 Úloha 7: Sekvenční přirazení peptidu Pomocí fiktivních výsledků (strip-plotu) 3D NMR experimentů (HNCA, HN(CO)CA) určete N—sekvenci hypotetického peptidu. Dbejte na správné pořadí od N-konce k C-konci peptidu. N T S Q L M. Novák 24. října 2016 11 / 17 Úloha 8: Časová škála interakce ligand-receptor Charakterizujte přiložená 1H-15N HSQC spektra zobrazující titrační experiment pomoci pojmů: rychlá, střední a pomalá výměna: 200 |i,M protein +100 (xM ligand (1:2) +300 |i,M ligand (3:2) +900 |i,M ligand (9:2) L0.7 10.2 9.7 9.2 8.7 8.2 7,7 7,2 200 |i,M protein +100 (xM ligand (1:2) +300 |i,M ligand (3:2) +900 |i,M ligand (9:2) +2700 (xM ligand (27:2) M. Novák 24. října 2016 12 / 17 Úloha 9: Populace jaderného spinu Vypočtěte rozdíl v populaci izolovaných jaderných spinu a - f3 pro atom 1H (magnetogyrická konstanta 7 = 2.68.1087_1s_1) v magnetickém poli 11.7 T a teplotě 298 K. I. Novák 24. října 2016 13 / 17 Úloha 9: Populace jaderného spinu Vypočtěte rozdíl v populaci izolovaných jaderných spinu a - (3 pro atom 1H (magnetogyrická konstanta 7 = 2.68.1087~_1s_1) v magnetickém poli 11.7 T a teplotě 298 K. Řešení AE = Ep - Ea = huj = ^760 = e"^ = 0 999919 ^ 100000 C ~ 10000g M. Novák 24. října 2016 13 / 17 Úloha 10: Nukleární Overhauserův efekt Uvažujme zjednodušený NOE experiment provedený na malém proteinu. Krátkým ozařováním o délce 25 ms saturujeme populaci spinu H/3 a okamžitě měříme signál blízkého spinu H7 v leucinu - za podmínky aproximace počátečního stavu (ŕ —>* 0). Ukažte, jak se za těchto podmínek zjednoduší kinetická rovnice prvního řádu popisující časový vývoj magnetizace spinu H7 v závislosti na auto-relaxaci (rychlostní konstanta p) a cross-relaxaci (rychlostní konstanta a): ^ = -p[/7-/7(0)]-a[//3-//3(0)] Jaká je přibližná vzdálenost atomů H/3 a H7, jestliže jsme při tomto experimentu pozorovali změnu signálu v důsledku NOE o velikosti -0.04 a pro referenční vzdálenost atomů H/3i - H/32 1.75Ä bylo naměřeno NOE -0.3? M. Novák 24. října 2016 14 / 17 Úloha 10: Nukleární Overhauserův efekt Uvažujme zjednodušený NOE experiment provedený na malém proteinu. Krátkým ozařováním o délce 25 ms saturujeme populaci spinu H/3 a okamžitě měříme signál blízkého spinu H7 v leucinu - za podmínky aproximace počátečního stavu (ŕ —>* 0). Ukažte, jak se za těchto podmínek zjednoduší kinetická rovnice prvního řádu popisující časový vývoj magnetizace spinu H7 v závislosti na auto-relaxaci (rychlostní konstanta p) a cross-relaxaci (rychlostní konstanta a): dl. 7 dt -^[/7-/7(0)]-<7[/r-/^(0)] Jaká je přibližná vzdálenost atomů H/3 a H7, jestliže jsme při tomto experimentu pozorovali změnu signálu v důsledku NOE o velikosti -0.04 a pro referenční vzdálenost atomů H/3i - H/32 1.75Ä bylo naměřeno NOE -0.3? Řešení dl. 7 dř ř^o = -p[/7(0) - /7(0)] + • směrnice: Eq(Sei —Si), průsečík s osou y: —Kd M. Novák 24. října 2016 15 / 17 Použitá a doporučená literatura http: //bouma n.chem.georgetown.edu/nmr/dipolar/dipolar. html http://groups.chem.ubc.ca/stra us/12, pdf http://www.col umbia.edu/itc/chemistry/chem-cl403/lectures/Fal 12005/ http: //otter. biochem.ubc.ca/publications/BcX_Tyrosine_J BNMR_2011.pdf P. Atkins, J. de Paula: Physical Chemistry M. Novák 24. října 2016 16 / 17 Příště: M. Novák: Molekulové modelování I. Novák 24. října 20