1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif Luděk Bláha, PřF MU, RECETOX www.recetox.cz Správná laboratorní praxe - poznámky biologické/toxikologické - Část 2 – modely, testy, studie, GMO OPVK_MU_stred_2 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif http://navier.engr.colostate.edu/whatische/images/ChEL02t01f01big.jpg • Průmyslové látky, produkty • • Kosmetická chemie •Potraviny / krmiva + kontakt s potravinami • •POR (pesticidy) •Biocidy •Léčiva humánní • •Léčiva veterinární • Chemické látky („bulk“) REACH (ECHA) PPP (EFSA) MPs (EMA) §§ §§ WFD – povrch.voda GWD – podzemní v. WWTP – odpadní v. Sedimenty Půda (SD) Ovzduší Odpady SOIL AIR WATER Negativní vlivy à vliv na zdraví člověka à vliv na prostředí Stresory - Chemické - Biologické (patogeny, GMO) - Fyzikální (záření, hluk...) Dva mechanismy “řízení” (§§) 1. před uvolněním – registrace 2. v prostředí Část 2 přednášek: Jak otestovat? 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Správná laboratorní praxe modely – testy - studie 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif GLP v biologii - úvod •BIOLOGIE Experimentální věda a Praktická biologie/biochemie/mikrobiologie atd. • •Nutnost dodržovat správnou praxi tam, kde jsou výsledky využity při rozhodování • •Praktická biologie a biochemie –Léčiva (registrace/povolení, výroba, kontrola, přípravy…) –Lékařská biologie a biochemie –Mikrobiologická kvalita (potraviny, pitná voda) –Průmyslové chemické látky, potravní aditiva, potenciálně nebezpečné agens (geneticky modifikované organismy) .. a jejich bezpečnost = toxikologie, ekotoxikologie, biodegradabilita apod –Další zákonem dané oblasti ve vztahu k biologii – dodržení etických požadavků (např. práce se zvířaty/obratlovci, GMO) • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif GLP v biologii – základní principy a příkladová STUDIE •V Biologii platí stejné principy jako v oblasti chemické –detaily a principy - viz přednášky dr. Vrany – (QA/QC, detailní SOPs, dokumentace …) • •Příklad - „jednoduchá“ STUDIE v režimu GLP • à viz ukázka na přednášce – utajený materiál – nemůže být fyzicky předán • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad studie v režimu GLP •Cíl studie –Podkladový materiál pro registraci (povolení) využití aspirinu u prasat • •Jeden z dílčích podkladových materiálů (tento příklad) –farmakokinetik aspirinu prasat po jednorázovém podání prasatům • •Experimentální design –8 zvířat (prasat), jednorázová aplikace aspirinu –odběry krve v definovaných časech (0-144 h) –sledování hladin metabolitů K. AcSal a vyhodnocení • •Realizace: –1) Plán projektu (100 stran + přílohy SOPs) –2) Výstup – Zpráva z realizace (detailní dokumentace vč. odchylek) – –Přímá jmenovitá odpovědnost konkrétních osob • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Existuje mnoho testovacích systémů …jaké testy se ale využívají v praxi? Jak vypadají návody? Standardizace v biologickém testování 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •V odborné literatuře - velké množství experimentálních metod •Méně metod je standardizovaných a validovaných • •STANDARDIZACE metod –Standardizace je potřebná a žádoucí i uvnitř laboratoře (viz příklady à SOP ELISA) –Vyšší úrovně standardizace (akceptovatelné mezinárodně) – snižování nákladů / omezení opakovaných hodnocení –Přejímání standardizovaných metod do legislativ –např. ČR – Vyhl. 433/2004 Sb. •Metody testování toxicity : vychází z OECD guidelines •(viz příklad: zákon ! - Příklad - PDF str. 16 – Akutní toxicita) • •Standardizační agentury • OECD.org (! Velký význam – viz úvod do GLP/chemie) • ISO.org (spíše Evropský dopad) • ASTM.org (USA) Metody - standardizace 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Standardní operační postup - příklad 1 •Ukázka SOP – ELISA stanovení toxinu microcystinu • à viz příklad ve studijních materiálech 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Struktura SOP –Název –Autor –Určení a cíl –Princip –Rušivé vlivy a omezení metody –Bezpečnost při práci a toxikologické údaje –Odpady a jejich likvidace –Normativní odkazy –Chemikálie a spotřební materiál –Vzorky –Přístroje –Kalibrace před zkouškou –Vlastní postup –Kontrola kvality –Výstup – protokol / výpočet –Poznámky doplňky • Standardní operační postup - příklad 2 Cvičení: V laboratoři SZÚ pravidelně vyšetřují obsah toxických kovů v černém čaji. Připravte SOP č. 1 pro přípravu černého čaje, ve kterém budou následně analyzovány těžké kovy ... 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif www.oecd.org 5 hlavních sekcí OECD GUIDELINES v rámci každé „standardizované postupy“ Section 1: Physical Chemical Properties Section 2: Effects on Biotic Systems (> 30 postupů) Section 3: Degradation and Accumulation (cca 10 postupů) Section 4: Health Effects (> 80 postupů) Section 5: Special Activities OECD GUIDELINES – Testing of chemicals 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif http://www.oecd.org 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklady – OECD Guidelines – sekce „2“ Effects on biotic systems (> 30 návodů) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklady – OECD Guidelines – sekce „3“ 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklady – OECD Guidelines – sekce „4“ – Toxicita pro člověka (> 90 postupů - příklady dole) - Standardní postupy - akutní, chronická, reprod. toxicita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Chemické látky (průmyslové) –legislativa REACH –v ČR zákon o chemických látkách –při registracích je třeba předložit •informace (např. o toxicitě) získané s využitím předepsaných zkoušek –Viz vyhláška 443 / 2004 Sb. (studijní materiály) •zkoušky musí být provedeny v režimu SLP Zákony a testování toxicity v ČR 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Biologické modely 1 - Využití obratlovců in vivo 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Existuje mnoho přístupů v biologii (některé jsou předepsány při hodnocení „bezpečnosti“ – viz předchozí diskuze – léčiva, bezpečnost chemických látek …) • •Biologické modely –Obratlovci •in vivo (zvířata) •ex vivo (orgány zvířat) •in vitro (buňky, buněčné linie) –Bezobratlí –Rostliny, řasy … –Bakterie MODELY v biologii http://images.mentalfloss.com/sites/default/files/styles/insert_main_wide_image/public/biology_cell _cake_by_nicolewilliam-d32y0sa.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Význam využití zvířat (obratlovců, savců / pokusných zvířat) •Unikátní 3D prostorové uspořádání •Fyziologické a Farmako(Toxo)kinetické procesy (podobné s člověkem) •Lze pozorovat komplexní účinky (podobné s člověkem) •Mnoho látek má více mechanismů toxického efektu • •Z těchto (a dalších) důvodů je stále třeba provádět zkoušky in vivo –Účinnost léčiv (vč. Vedlejších účinků) –Bezpečnost kosmetických přípravků –Toxicita chemických látek pro člověka 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Užívání pokusných zvířat v EU (2011) reporting členských států (viz také studijní materiály) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Využití zvířat (=obratlovců): etické aspekty •Nutnost regulace – zákonný rámec –Zákon na ochranu zvířat proti týrání 246/1992 –Vyhláška 311/1997 (o využití pokusných zvířat) • •Odpovědný úřad –Ministerstvo zemědělství a jeho Ústřední komise pro ochranu zvířat • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif www.eAGRI.cz (také www.mze.cz) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Zákon 246/1992 a Vyhláška 311/1997 –CO je zvíře z hlediska zákona? • OBRATLOVEC kromě embryí a plodů • –Typy zvířat: laboratorní / pokusné (další) – –KDO smí zvířata využívat •Vyžaduje se registrace na ÚKOZ (MZe) •Další důležité potřeby –Školení osob –Etické komise jednotlivých pracovišť – –JAK lze experimenty realizovat (dodržování pravidel GLP) •Zdůvodnění využití zvířat (musí být schváleno etickou komisí) •Projekt pokusu, protokol pokusu, evidence Využití zvířat =obratlovců 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Kdy lze využít pokusná zvířata? –výroba, vývoj, kontrola kvality, nezávadnosti a účinnosti léčiv, biopreparátů, potravin a event. jiných výrobků –studium nemocí, prevence, diagnostika, léčení –studium fyziologických procesů –ochrana životního prostředí –výuka na SŠ a VŠ • •Zákon také stanoví - kdy se zkoušení vyžaduje –OCHRANA ČLOVĚKA a HOSP. ZVÍŘAT –Potraviny, zemědělské látky –Kontrola léčiv –Výroba léčiv - farmakologické preklinické studie –Farmakokinetika –Nežádoucí účinky • • Využití zvířat =obratlovců 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Bezpečnost chemických látek pro člověka Testování toxicity in vivo 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Každá látka je toxická, záleží jen na DÁVCE a DOBĚ PODÁNÍ (expozice) –Krátkodobá (akutní) expozice •-> akutní rychlé účinky (smrt) –Dlouhodobá (chronická) expozice •-> subletální efekty (nemoci, nádory, imunotoxicita, reprodukční toxicita …) •Hodnocení a srovnání toxicity: –nejč. LD50 (letální dávka 50) – dávka (zpravidla akutní), která s největší pravděpodobností způsobí smrt 50% exponovaných jedinců (vyjádření jako koncentrace – např. mg/kg živé váhy) LD50 je hodnota odvozená (modelovaná) z testování křivky více dávek vs toxicita (ve skutečnosti není možné otestovat právě dávku, která způsobí smrt právě 50% zvířat) –NOEL – No Observed Effect Level – nejvyšší dávka (hladina), která byla použita v konkrétním testu toxicity a při které nebyly pozorovány (škodlivé) účinky Pro stanovení limitů (např. TDI/ADI) se využívá NOEL z testů chronické toxicity –další parametry „bezpečnosti“ – např. TDI –tolerovatelný denní příjem (např. mg/kg živé váhy/den) • Které látky jsou toxické? 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Velice častý test test - Přesné dávkování - Sledování letality a akutních projevů 24-48h AKUTNÍ TOXICITA perorální aplikace - potkan Srovnej - příklady – studijní materiály • OECD STANDARD (TG 423) •Vyhl. 443/2004 – metoda B.1 (str. 16-31) • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Třídy akutní toxicity (podle zákona o chemických látkách) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Vyšetření specifických efektů při dlouhodobém (opakovaném) podávání • •Dávky pro testování se odvozují z akutní toxicity nebo podle obvyklého podávání (např. léčiva) • •Délka studie závisí na „předpokládaném“ schématu podávání látky •př. Léčivo předpokládané podávání délka studie •1-2 d/wk 2 wks •1,2,3 ...7 d 4 wks •Opak 1-30 d 4 months •Opak > 30 d 6 months • •Složitý design a řada požadavků –Zvířata (více druhů, stáří, pohlaví…), počty ve skupině –Vyhodnocení - pitva (definované úkony), statistika … • •Ekonomická náročnost , etické problémy à potřeba GLP • Chronická a reprodukční toxicita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Zjišťuje se vliv na –sexuální chování zvířat –prenatální mortalitu –fetální abnormality & poškození během života – • Experimenty –změny fertility, vliv na F a M gamety (poměry narozených F a M); toxicita pro embrya a féty, změny gravidity ovlivňující fety, vliv na růst a vývoj dělohy a placenty, porod, postnatální vývoj a laktaci matky, vliv na potomstvo (schopnost učení) • •Složitý design a náročné vyhodnocení –Viz příklad – OECD 416 “Two-Generation Reproduction Toxicity Study” Chronická a reprodukční toxicita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad OECD 416 http://image.slidesharecdn.com/norcalsot2007holson-140211153943-phpapp01/95/current-regulatory-requ irements-in-developmental-and-reproductive-toxicity-assessments-segmental-study-designs-vs-the-biol ogic-continuum-12-638.jpg?cb=1392133414 Viz další strana 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad OECD 416 – zoom F0 generace/expozice http://pharmaceuticalintelligence.files.wordpress.com/2012/11/slide2.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad OECD 416 – sbírané výsledky •- food consumption, and water consumption if available, food efficiency (body weight gain per •gram of food consumed), and test material consumption for P and F1 animals, except for the •period of cohabitation •and for at least the last third of lactation. •- absorption data (if available); •- body weight data for P and F1 animals selected for mating; •- litter and pup weight data; •- body weight at sacrifice and absolute and relative organ weight data for the parental animals; •- nature, severity and duration of clinical observations (whether reversible or not); •- time of death during the study or whether animals survived to termination; •- toxic response data by sex and dose, including indices of mating, fertility, gestation, birth, •viability, and lactation; the report should indicate the numbers used in calculating these •indices. •- toxic or other effects on reproduction, offspring, postnatal growth, etc.; •- necropsy findings; •detailed description of all histopathological findings; •number of P and F1 females cycling normally and cycle length; •- total cauda epididymal sperm number, percent progressively motile sperm, percent •morphologically normal sperm, and percent of sperm with each identified abnormality; •- time-to-mating, including the number of days until mating •- gestation length; •- number of implantations, corpora lutea, litter size •- number of live births and post-implantation loss; •- number of pups with grossly visible abnormalities, if determined the number of runts should •be reported; •- data on physical landmarks in pups and other postnatal developmental data; physical •landmarks evaluated should be justified; •- data on functional observations in pups and adults, as applicable; •- statistical treatment of results, where appropriate. • •Discussion of results. • •Conclusions, including NOAEL values for maternal and offspring effects • • • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Mutagenní a genotoxické látky – zpravidla považovány za karcinogenní –Rakovina – velký problém pro západní civilizaci –Oproti jiným toxickým látkám - karcinogeny jsou považovány za „bezprahově působící“ •Neexistuje bezpečná dávka (i jedna molekula může vyvolat efekt) • •Experimentální průkaz karcinogenity – nejnáročnější studie (celoživotní expozice, stovky zvířat v experimentu …) –POZOR - ne vždy však existují korelace výsledků - zvíře vs. člověk (!) • •Řada klasifikačních schémat chemických látek –Pro karcinogeny WHO (Světová zdravotnická organizace) a její IARC - International Agency for Research of Cancer • Hodnocení KARCINOGENITY 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif http://www.iarc.fr 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Group 1: The agent (mixture) is carcinogenic to humans. –(2015 – přidány “uzeniny”) – •Group 2 –Group 2A: The agent (mixture) is probably carcinogenic to humans. –Group 2B: The agent (mixture) is possibly carcinogenic to humans. –(2015 – přidáno “červené maso”) • •Group 3: The agent (mixture or exposure circumstance) is not classifiable as to its carcinogenicity to humans. • •Group 4: The agent (mixture) is probably not carcinogenic to humans. • IARC klasifikace 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Group 1 (Carcinogenic to humans) Group 2A (Probably carcinogenic) Příklad Karcinogenita cytostatických (protinádorových) léčiv Risk / Benefit analýza à i přes vysoká rizika: využití carcinogenů jako léčiva 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Biologické modely 2 – Alternativy k in vivo testům s obratlovci 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Alternativy k testům s obratlovci •Obratlovci in vivo (celá zvířata) –Řada etických a praktických (finančních) limitací • •Náhrada in vivo experimentů koncept "3R" –Reduction (Snižování), –Refinement (Zmírňování), –Replacement (Nahrazování) – •à Alternativní metody –ex vivo (orgány zvířat) –in vitro (buňky, buněčné linie, enzymy …) • •Výhody alternativních metod •snižování počtů zvířat •mechanistické metody (poznání biochemických principů – např. "dioxinová" toxicita, „inhibice acetylcholinesterázy“ u pesticidů) •rychlejší, levnější, možnost hodnocení více vzorků • http://cms.uni-konstanz.de/fileadmin/_migrated/RTE/RTEmagicC_Bild1_06.jpg.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Testování toxicity – alternativy k in vivo experimentům s obratlovci •Snaha o snižování počtů zvířat (nahrazování testů in vivo) àAlternativní přístupy v toxikologii •ex vivo (orgány zvířat) •in vitro (buňky, buněčné linie, enzymy …) •in silico •Cílem je naplnění principu 3R •Reduction – Refinement – Replacement •Dosažení 3R: nové přístupy v legislativě a v praxi –Omezování počtů zvířat v in vivo testování –Zlepšování vypovídací hodnoty testů podle nových poznatků –Nahrazování in vivo testů alternativami (in vitro, QSAR) •Uplatňování 3R je obecnou politikou •Musí být reflektováno při tvorbě nových zákonů –Je zohledněno např. v REACH –EU financuje aktivity validací alternativních metod pro regulační toxikologii atd. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad – „Reduction“ Pro málo toxické látky - není třeba testovat a hledat LD50 (min 30 zvířat) Nově se uplatňuje „Stupňový“ (Tiered) přístup http://eur-lex.europa.eu/resource.html?uri=celex:02008R0440-20140824.ENG.xhtml.L_2008142EN.01015701 .tif.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Mezinárodní agentury pro validaci alternativních postupů •Sledují principy „3R“ –ICVAM (USA) –EU: https://eurl-ecvam.jrc.ec.europa.eu/ •The European Union Reference Laboratory for alternatives to animal testing (EURL-ECVAM) •Časopis ATLA (Alternatives to Laboratory Animals) • •Poskytují (zdarma ke stažení) kompletní návody na validované postupy (ověřené), které splňují 3R. • •Jejich využití standardizačními agenturami (OECD) je jen částečné –proto nejsou často užívány v praxi průmyslem Alternativní metody testování toxicity 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/beta/ 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif http://iccvam.niehs.nih.gov/ 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Seriozní projekty podpory alternativních metod TOXIKOLOGIE - http://alttox.org 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Seriozní projekty podpory alternativních metod EKOTOXIKOLOGIE - http://www.euroecotox.eu 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Seriozní projekty podpory alternativních metod EKOTOXIKOLOGIE – databáze testů http://projects.cba.muni.cz/euroecotox/ 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif ____1 ____2 ____3 ____4 Alternativy 1 – in vitro metody 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif _1 Př: ECVAM - validovaná in vitro technika hodnocení embryotoxicity 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Alternativy 2 – EMBRYONÁLNÍ testy(není považováno za in vivo) CHEST test (Chick Embryotoxicity Screening Test) - Injekce testované látky do vyvíjejícího se vajíčka à Hodnocení malformací http://www.iem.cas.cz/miranda2/export/sitesavcr/data.avcr.cz/lifesci/uem/research/departments/img/t eratology/teratology-1.jpg 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Alternativy 3 – in silico modely a QSAR •Využití informací o biologické aktivitě (toxicitě) u existujících látek à predikce pro neprostudované chemikálie •Mnoho různých přístupů (matematické, statistické …) •Příklad: OECD QSAR Toolbox www.qsartoolbox.org 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Bezpečnost chemických látek pro prostředí EKOTOXIKOLOGIE 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Věda s řadou aplikací, jejímž cílem je racionálně chránit EKOSYSTÉM, populace a společenstva organismů (na rozdíl o toxikologie – předmětem je ochrana jednoho druhu = člověk) • •Ekosystém – složitá struktura a funkce bioty • •Nutná je ochrana všech stupňů (trofické úrovně) –Producenti (řasy, rostliny …) –Konzumenti různých řádů (bezobratlí, obratlovci) –Destruenti (mikroorganismy) – •Nelze otestovat účinky na všechny druhy –– existují „modely“ = zástupci významných skupin (trofických stupňů) • •Hodnocení ekotoxicity – podobné principy jako toxikologie –– LC50 (letální koncentrace 50), EC50 (efektivní koncentrace 50 – např. reprodukční toxicita) –- NOEC – bezpečná hladina („no observed effect concentration“) EKOTOXIKOLOGIE - úvod 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Rovnováha ekosystému a význam potravních sítí http://maggiesscienceconnection.weebly.com/uploads/5/1/0/5/5105330/203571573_orig.gif?424 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif STANDARDIZOVANÉ TESTY (např. Vyžadované pro REACH) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Řasové testy toxicity Řasy Selenastrum capricornutum Scenendesmus subcapitatus Sc. quadricauda Chlorella vulgaris Příklady modelů hodnocení – Ekotoxikologické biotesty Producenti - ve vodě - v půdním prostředí figure4 figure4 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Toxicita pro rostliny (terestrický ekosystém) Využívají se zástupci dvou velkých skupin: •jednoděložných (např. ječmen) •dvouděložných (např. salát, hořčice, bob) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif figure4 Daphnia magna figure4 Artemia salina Ceriodaphnia dubia 1 Gammarus figure4 Chironomus riparius Konzumenti – bezobratlí – vodní prostředí 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif figure4 Živorodka duhová (Paví očko) Poecilia reticulata figure4 Zebřička - Danio rerio (syn. Brachydanio rerio) figure4 Karas (zlatá forma) 1 Střevle - Pimephales promelas figure4 Pstruh Konzumenti – obratlovci – vodní prostředí (ryby) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif figure4 figure4 Experimentální uspořádání testování ekotoxicity ve vodním prostředí 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Alternativní testy (k testům s obratlovci) v ekotoxikologii EMBRYONÁLNÍ testy -Také v ekotoxikologii se aplikují principy 3R – snaha o nahrazování testů s dospělými obratlovci (ryby, obojživelníci). - -Alternativní testy v ekotoxikologii: - -ZFET Zebrafish Embryo Toxicity Test (validace dle OECD a ISO) – –FETAX Frog Embryo Teratogenesis Assay Xenopus (alternativa testů teratogenity, validace v USA - ASTM ) – 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif ZFET - Zebřička, zebrafish (Danio rerio) -Obecně velmi významný modelový biologický organismus (!) - Indukce páření rozsvícením (fotoperioda) - Experimenty s vajíčky až embryi - vyhodnocení kulení, přežívání, malformací - do 4 dnů: ryby se vyživují z vaječného vaku 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1 kontrola krivak FETAX test - Hormonální stimulace žab X. laevis à vajíčka - Expozice oplozených vajíček - 96 hodin kompletní vývoj embrya - Příklad – vliv herbicidu – paraquat Kontrolní embryo Malformace páteře 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Snadná kultivace, krátký generační čas, jednoduché uspořádání (jediná membrána), jednoduchý genetický aparát • •Využití při testování „bezpečnosti“ látek (i jiných vzorků – extrakty z potravin …) –rychlé (skreeningové) testy akutní toxicity •MICROTOX –Testy na genotoxicitu - sledování poškození DNA •Amesův test BAKTERIE – významný model v hodnocení chemikálií 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif TEST AKUTNÍ TOXICITY – MICROTOX - mořská luminiscenční bakteri Vibrio fisheri - krátkodobá expozice testované látce (5-30 min) - sledování změn přirozené luminiscence – odpovídá toxicitě - - uspořádání: * kyvety (zkumavky), stanovení v luminometru * mikrodestičkové - figure4 1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif ____1 ames Amesův test Test na reverzní mutace se Salmonella typhimurium - Původní kmen neroste na živném médiu - Látka vyvolá (reverzní) mutaci -> bakterie rostou 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Využití ekotoxikologických modelů 1 (v praxi nejdůležitější) Prospektivní testování látek à odvozování limitů (průmyslové chemikálie, POR, léčiva…) 2 (méně časté) Testování kontaminovaných vzorků Např. vytěžené sedimenty z rybníků Významná toxicita à nelze použít na půdu jako hnojivo Příklad toxicita sedimentů pro klíčení hořčice 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Regulace Geneticky Modifikovaných Organismů (GMO) http://www.mindfully.org/GE/GE4/Frankenfish-Spawn-Controversy29apr02.GIF 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Zákon 153/2000 •Vyhlášky 372, 373, 374/2000 MŽP • •Definice: –Organismus •biologická jednotka (buněčná nebo nebuněčná) schopná rozmnožování nebo přenosu dědič. materiálu včetně virů –GMO •organismus (kromě člověka) změněný gen. modifikací • GMO v ČR 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Co je Genetická modifikace: ? –rekombinantní techniky vytvářející nové kombinace DNA - vložení nového úseku jakýmkoliv způsobem do NK, plazmidu, vektoru ... –techniky zavádějící dědičný materiál připravený mimo organismus do organismu (mikroinjekce, mikroenkapsulace ...) –techniky buněčné fúze, hybridizace buněk (!produkce monoklonálních protilátek) • •Co není Genetická modifikace? –oplození in vitro –bakteriální konjugace a všechny podobné přirozené procesy –indukce polyploidie a haploidie –mutageneze –křížení • Zákon o GMO 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Předběžná opatrnost –stále málo prostudováno –neznáme možné důsledky vnášení do prostředí, například: •přímé nebo nepřímé škodlivé působení na člověka, zvířata, rostliny »onemocnění (GM bakterie) »alergizace, toxicita •vliv na dynamiku populací a genetickou rozmanitost •omezení možnosti léčby (rezistence vůči ATB) •účinky na biogeochemické procesy (fixace dusíku, koloběh uhlíku ...) • Proč regulovat GMO? 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Příklad – GM kukuřice s geny pro „Bt“ toxin z Bacillus thuringiensis - Toxiny působí proti škůdcům ? NEGATIVNÍ působení Bt z opadaných listů na biotu v půdě/vodě ? 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Hlavní orgán: Ministerstvo ŽP, které registruje: –seznamy uživatelů (právnické osoby) –seznamy GMO •pro uzavřené nakládání •pro vnášení do prostředí (experimentální hodnocení v prostředí) •pro vnášení do oběhu (povoleno pro obchodování) • •Další orgány –ČIŽP, celní orgány, orgány veterinární správy, ÚKZÚZ, SZÚ, ÚSKVBL, ČZPI Regulace GMO v ČR 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •REGISTRACE –Registrovaný uživatel je v seznamu vedeném MŽP –Složitá forma žádosti - řada požadavků •př. přesná definice genetické změny pro účely identifikace... •popis pracoviště, havarijní plány –Pověřené osoby (vzdělání, praxe ...) –Odborný poradce – •Před zápisem do seznamu je nutné provedení analýzy rizika a kategorizace konkrétního GMO –popis náležitostí je ve vyhlášce – Povinnosti uživatele GMO 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Po provedení analýzy rizika se GMO zařadí do kategorie –A - bez rizika nebo s min. rizikem škodlivého působení –B - riziko, které může být odstraněno obecně známými opatřeními –C - riziko, které může být odstraněno jen zvláštními náročnými zásahy –D - riziko, které zanechává trvalé následky a nemůže být zcela odstraněno • •Podle kategorie rizika je nutno zabezpečit provoz zařízení –vybavení –provozní řád (režim SLP) •identifikace, osoby, seznam a popis pracovních postupů, výčet GMO a jejich počet, zásady vedení evidence o provádění sanitace, hygiena, vedení dokumentace ... •opatření pro případ havárie - speciální havarijní plán • Hodnocení rizik GMO 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •PLÁN ETAPY –účel, údaje o organismu, osoby, specifikace materiálu, postupy nakládání, likvidace, odpady –schválení odborným poradcem – •Provozní deník (každý zápis s podpisem) –plán etapy, průběh etapy –primární údaje (!) –zápisy o kontrolách – •Závěrečná zpráva etapy • •Průběžná archivace a reporting à MŽP Nakládání s GMO (dokumentace, principy GLP) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Závěrem 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif http://www.iraqa.in/images/k.jpg GLP: Good Laboratory Practice; GCP: Good Clinical Practice; GMP: Good Manufacturing Practice; GQP: Good Quality Practice; GVP: Good Vigilance Practice; VP: Pharmacovigilance PHARMACEUTICAL PRODUCT LIFE CYCLE AND REGULATIONS QUALITY ASSURANCE SPANNING THE ENTIRE PRODUCT LIFE CYCLE http://farm4.staticflickr.com/3230/2883487332_19fdf37e15_o.jpg