Úloha A - Analýza izoenzymů askorbát peroxidasy pomocí nativní PAGE
Jméno a UČO:
Datum:
ÚLOHA A
Analýza izoenzymů askorbát peroxidasy pomocí
nativní PAGE
TEORETICKÝ ÚVOD
Askorbát peroxidasa (APX) je enzym zodpovědný za detoxifikaci peroxidu vodíku u rostlin. U rostlin se vyskytují tři izoenyzmové formy lišící se lokalizací v buňce. Všechny askorbát peroxidasy katalyzují reakci:
Role askorbát peroxidasy při obranné reakci byla podpořena pozorováními, že její aktivita narůstá při aplikaci různých environmentálních stresů. V některých případech však můžeme po infekci rostliny patogenem pozorovat drastický pokles její aktivity, který poté potencuje nekrózu buněk způsobenou převážně oxidačním stresem.
Využití nativní polyalkrylamidové elektroforézy pro stanovování aktivit celé řady enzymů má převážně největší význam při studiu aktivace jednotlivých izoenzymových forem. Toto stanovení aktivity APX je založeno na schopnosti askorbátu redukovat nitro-blue tetrazolium (NBT) v přítomnosti N,N,N',N'-tetraethylendiaminu (TEMED) na nerozpustný barevný formazan. V přítomnosti H2O2 je APX schopna zabránit tvorbě formazanu díky velmi rychlé oxidaci askorbátu. Proto je aktivita APX pozorována na gelu jako achromatický proužek.
POSTUP PRÁCE
Jednotlivé skupiny si rozdělí izolaci z listů po aplikaci neznámých látek a kontrolních listů po aplikaci vody sesbíraných v časových intervalech Oh a 6h po aplikaci.
Izolace askorbát peroxidasy
1. 0,3 g dříve před drcené rostlinné tkáně smíchejte s 0,6 ml izolačního pufru (100 mM fosfátový pufr (pH=7.0), 5 mM askorbát, 1 mM EDTA) a dobře zvortexujte.
2. Homogenát centrifugujte při 12 000 x g 5 min při 4°C.
2 askorbát + H202
>  2 monodehydroaskorbát + 2 H2O
1
Úloha A - Analýza izoenzymů askorbát peroxidasy pomocí nativní PAGE
3. Supernatant přeneste do nové 1.5 ml zkumavky a opět centrifugujte při 20 000 x g 40 min při 4°C.
4. Odsajte supernatant a uchovávejte ho na ledu. Příprava polvakrylamidového gelu
1. Gel propláchněte vodou, vložte do elektroforetické vaničky a přilijte elektroforetický pufr obsahující 2 mM askorbát.
2. Spusťte elektroforézu na 30 minut při konstantním proudu 15 mA/gel. Elektroforézu provádějte při 4°C.
Příprava a nanesení vzorků
1. Smíchejte 60 u.1 enzymového izolátu s 12 u.1 nanášecího pufru.
2. Na gel nanášejte 15 u.1 jednotlivých izolátu
3. Elektroforézu provádějte při konstantním proudu 15 mA/gel po dobu 2 hodin při 4 °C. Detekce aktivity askorbát peroxidasy v gelu
Všechny následující kroky budou prováděny při pokojové teplotě.
1. Ekvilibrujte gel 5 minut v 20 ml ekvilibračního pufru I (50 mM fosfátový pufr (pH=7.0), 2mM askorbát).
2. Poté inkubujte gely 10 minut v 20 ml ekvilibračního pufru II, do kterého přidejte 6 u.1 peroxidu vodíku.
3. Poté gel promyjte 1 minutu v 20 ml promývacího pufru (50 mM fosfátový pufr (pH=7.0)) a ponořte ho do detekčního pufru (50 mM fosfátový pufr (pH=7.8), 28 mM TEMED, 2.45 mM NBT). Aktivita askorbát peroxidasy bude detekována jako achromatický proužek na tmavém pozadí.
VYHODNOCENÍ
Srovnejte změny aktivity askorbát peroxidasy po aplikaci jednotlivých látek v závislosti na čase. Výsledek zdůvodněte.
2