INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY DEN 1 VYBRANÉ METODY VYUŽÍVANÉ KE STUDIU GENOMU ARABIDOPSIS THALIANA A K PROVÁDĚNÍ CÍLENÝCH ZMĚN, SYNTÉZA A PURIFIKACE OLIGONUKLEOTIDŮ Úvod První den bude věnován úvodu do praktika, studiu interakcí proteinů in vivo pomocí bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC), analýze aktivity promotoru pomocí transkripční fůze a rychlé izolaci DNA pro genotypování pomocí PCR. Časový harmonogram1 7:45 Sraz v seminární místnosti (A2/1.21) 7:50 Zahájení semináře (Jan Hejátko), UKB, Kamenice 5, budova A2, místnost 1.21 8:00 ANALÝZA BUNĚČNÉ LOKALIZACE PROTEINŮ A PROTEIN-PROTEINOVÝCH INTERAKCÍ (Serge Dabravolski), laboratoř 334 a) Naočkování kultur Agrobakterií 9:00 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FŮZE (Jan Hej átko/Ivan Kaskan/Veronika Balakhonova) 10:05 Úvod k praktické části (Vojta Didi) 10:15 IZOLACE DNA (Vojta Didi) 12:45 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FŮZE (Jan Hejátko Ivan Kaskan/Veronika Balakhonova) 3. Kontrola GUS barvení/zahájení odbarvování 13:05-14:00 - OBĚD 14:00 ANALÝZA BUNĚČNÉ LOKALIZACE PROTEINŮ A PROTEIN-PROTEINOVÝCH INTERAKCÍ (Serge Dabravolski), laboratoř 334 b) Infiltrace listů tabáku 16:00 UKONČENÍ PROGRAMU 1. DNE 1 jednotlivé časy se mohou měnit podle potřeby a rychlosti zvládnutí jednotlivých metod INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Příprava materiálu Pro práci v laboratoři se seznámíme s organizací práce, přístroji a připravíme materiál a roztoky. Práce v laboratoři • Bezpečnost • Zdroje vody • Základní chemikálie • Odměřování a pipetování • Skladování • Odpady a použitý materiál • Sterilizace Přesvědčte se, že máte k dispozici následující chemikálie a materiály: • ddH20 (sterilní, 50ml) • 70% etanol /100% etanol • Špičky/zkumavky (sterilní) • Pinzetu • Barvící pufr a destičky • Tužky, fixy, popisovači nálepky Komponenty PCR reakce. V krabičce označené číslem vaší skupiny jsou uložené následující chemikálie: • Taq DNA polymeráza • 1 Ox koncentrovaný PCR pufr s MgCh • dNTP • primery Metoda 1A Analýza aktivity promotoru pomocí transkripční fůze s reportérovým genem uidA (GUS) 1) Rozpipetujte si připravený barvící roztok do barvící destičky (2 ml) 2) Vložte připravené semenáčky (cca 10-15 kusů) pomocí jemné pinzety do barvícího pufru 3) Proveďte infiltraci v exsikátoru (15 min.) 4) Vložte do termostatu (37 °C) . 5) V cca dvouhodinových intervalech provádějte kontrolu barvení pomocí stereomikroskopu. 6) Barvení zastavte pomocí 80 % etanolu, ve kterém ponechejte semenáčky odbarvovat při pokojové teplotě do druhého dne. 7) Vyměňte etanol a opět nechte odbarvovat (2. den, úterý). 8) Proveďte projasňování semenáčků (4. den, čtvrtek). 9) Opatrně přeneste projasněné semenáčky na sklíčka a připravte preparáty pro automatickou mikroskopii (4. den, čtvrtek). INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM ASTATEM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY 10) Spuštění automatického mikroskopu (přes noc;4. den, čtvrtek). 11) Vyhodnocení výsledků barvení (5. den, pátek). Použité transgenní linie: ProCYCBl:GUS (sk. 1+4) ProARR5:GUS (sk. 2+5) ProAHK4:GUS (sk. 3+6) Složení barvícího roztoku: X-Glc 0,01% (w/v) Triton X100 0,1% (v/v) Pipufr, pH6,9 0,1M K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] 0.5 mM X-Glc - navazuje se ráno před cvičením Triton XI00 - 200 ul 1% tritonu na jamku, nebo - 20 ul 10% tritonu na jamku Pi pufr - 2 ml 0,lMPi na jamku komponenta A - 6,899 g NaH2P04.H20 v 100 ml H20 komponenta B - 8,889 g Na2HP04.2H20 v 100 ml H2O 7,8 ml komponenty A + 12,2 ml komponenty B + 80 ml H2O = 100 ml Pi pufru (lednice) Fe soli - 20 ul zásobního roztoku na jamku 1,646 g K3[Fe(CN)6] + 2,112 g K4[Fe(CN)6] + 50 ml H2O =50 mM zásobní roztok INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOClALNlM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Schéma nej důležitějších morfologických a anatomických částí semenáčku Arabidopsis thaliana. pravé listy „ DĚLOZnI LÍSTKY (KOTYLEDONY) apikální meristém prýtu kořenovévlásky BOČNl (LATERÁLNÍ) KOŘENY kořenová Špička Q CÉVNÍ PLETIVA I PERICYKL Q ENDODERMIS M KORTEX O EPIDERMIS n POSTRANNÍ KOŘENOVÁ u ČEPIČKA *» KLIDOVÉ CENTRUM A INICIÁLY O KOLUMELA INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Šablona k protokolům: Analýza aktivity promotoru pomocí transkripční fůze2 Jméno: Datum: Úloha: Cíl: Postup a výsledky: Závěr: 2 Do protokolu zejména uveďte: název genu analyzovaného promotoru, stručný popis principu metody, zda se podařilo identifikovat místa specifické aktivity daného promotoru (uveďte stručný výčet barvených pletiv) a co lze z tohoto výsledku uzavřít, příp. pro co jej dále použít. INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM ASTATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Metoda 1B Infiltrace agrobakterií do listů tabáku Nicotiana benthamiana Listy tabáku Nicotina benthamiana jsou vhodným rostlinným systémem pro transientní expresi fúzních proteinů, u kterých chceme studovat jejich vzájemné interakce a lokalizaci uvnitř rostlinné buňky. K transformaci listu využijeme přenos T-DNA z Agrobacterium tumefaciens. Studované geny jsou nakloňovány do expresní kazety uvnitř T-DNA oblasti binárního plasmidu a takto připravené konstrukty pro expresi fúzních proteinů (GFP, RFP, YFP-N, YFP-C apod.) jsou transformovány do kmenu GV3101 pMP90. Vzniklé kmeny agrobakterií potom kultivujeme a ve formě suspenze je pomocí injekční stříkačky (bez jehly) vtlačíme skrze průduchy na spodní straně listu do mezofylového prostoru tak, že suspenze vyplní celý list. Následně dojde k přenosu mnoha kopí T-DNA do jádra buněk. Pro transkripci vnesených genů není nutné začlenění T-DNA do chromozomů. Pokud před infiltrací smícháme kmeny nesoucí různé konstrukty, dojde s velkou pravděpodobností k jejich koexpresi, protože jedna buňka je zpravidla transformována mnoha agrobakteriemi současně. Transientní exprese proteinů je velmi silná kvůli velkému počtu transkripčně aktivních kopií T-DNA v jádře, ale během několika dnů odezní. K udržení vysoké hladiny transientní exprese obvykle používáme koexpresi studovaných proteinů s virovými proteiny inhibujícími buněčné mechanismy posttranskripčního umlčování - například protein pl9 viru TBSV (Tomato Bushy Stunt Virus). 1. Každá skupina si vezme 4 zkumavky s narostlou agrobakteriální kulturou podle následujícího rozpisu. Skupina 1 a 4 Skupina 2 a 5 Skupina 3 a 6 kmen rezistence kmen rezistence kmen rezistence AHP2-YFPN Rif, Gent, Kan AHP2-YFPN Rif, Gent, Kan ERSl-RFP Rif, Gent, Spec AHP4-YFPN Rif, Gent, Kan AHP4-YFPN Rif, Gent, Kan ATM-ETR2-GFP Rif, Gent, Spec CKIl^-YFP0 Rif, Gent, Kan CKI1-YFPC Rif, Gent, Kan CKI1-GFP Rif, Gent, Spec pl9 Rif, Gent, Kan pl9 Rif, Gent, Kan pl9 Rif, Gent, Kan 2. Pro každý kmen připravte do plastové zkumavky 4 ml YEB média s odpovídajícím antibiotikem. Podle tabulky s koncentracemi antibiotik vypočítejte objem, který napipetujete do zkumavek a promíchejte. antibiotikum zásobní koncentrace roztok v YEB médiu Rifampicin 50 mg/ml 100 pg/ml Gentamycin 20 mg/ml 40 pg/ml Kanamycin 25 mg/ml 50 LTg/ml Spectinomycin 50 mg/ml 100 LTg/ml 3. Do každé zkumavky napipetujte 1 ml kultury. 4. Uzavřete zkumavky a inkubujte za stálého třepání při 28 °C / 200 rpm / 4 - 6 hodin. 5. Zcentriřůgujte narostlé kultury při 4000 rpm / 22 °C / 15 min. 6. Během centriřůgace si připravte 25 ml AS média. INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY AS médium (25 ml) 1 M MES pH 5,6 250 ul 3M MgCh 83 ul 150 mM Acetosyringon 25 ul destilovaná voda do 25 ml 7. Odlijte médium a zkumavky znovu krátce zcentrifugujte. 8. Pipetou odsajte ze zkumavek zbytky média. 9. Napipetujte do zkumavek 3,2 ml AS média a resuspendujte pelet. 10. Napipetujte 1 ml suspenze agrobakterií do kyvety a změřte ODôoo na spektrofotometru. 11. Přidáním vypočítaného objemu AS média ke zbývajícím 2,2 ml agrobakteriální suspenze upravte její hustotu na ODeoo = 0,7. 12. Do 2 ml zkumavek připravte směsi agrobakterií v odpovídajícím poměru podle následujícího rozpisu. Skupina 1 a 4 Skupina 2 a 5 Skupina 3 a 6 kombinace poměr kombinace poměr kombinace poměr AHP2-YFPN + CKI1RD-YFPC + pl9 1:1:1 AHP2-YFPN + CKI1-YFPC + pl9 1:1:1 ATM-ETR2-GFP + ERS1-RFP + pl9 1: 0,1 : 1 AHP4-YFPN + CKI1RD-YFPC + pl9 1:1:1 AHP4-YFPN + CKI1-YFPC + pl9 1:1:1 CKI1-GFP + pl9 1 : 1 13. Inkubujte 30 minut při laboratorní teplotě. 14. Infiltrujte suspenze pomocí 1 ml injekční stříkačky (bez jehly) skrze spodní stranu listu do připravených rostlin tabáku. 15. Odneste rostliny do skleníku. Konfokální mikroskopii epidermis na abaxiální straně listu provádíme za 2 - 3 dny (viz. Metoda 4A). 16. Do protokolu k metodě 4A uveďte stručný popis pracovního postupu infiltrace tabákových listů, ve kterém vysvětlete, proč infiltrační AS médium obsahuje acetosyringon a proč vždy koinfiltrujeme s kmenem p 19. Metoda 1C Rychlá izolace DNA pro PCR 1. Homogenizovat jeden střední list vychlazenou skleněnou tyčinkou v l,5ml zkumavce (eppendorfka) ve stojánku. 2. Přidat 400 ul extrakčního pufru, vortexovat 5 s a nechat stát při laboratorní teplotě 60 min. 3. Centrifugovat při 14000 otáčkách 30 min, 4°C. 4. Přenést 300 ul supernatantu do nové l,5ml zkumavky a přidat 300 ul izopropanolu, 4-6 krát INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY překlopit. Nechat stát 10 min při laboratorní teplotě. 5. Centrifugovat 20 min, 4°C. Odstranit supernatant, DNA vysrážená izopropanolem bude v peletu. 6. Přidat 500 ul 70% etanolu. Centrifugovat při 14000 otáčkách 2 min. Odstranit etanol. Nechat vysušit (SpeeďVac, cca 10-15 min). 7. Pelet rozpustit velOO ul sterilní ddfbO. Genomovou DNA uchovávat na ledu nebo v lednici. Extrakční pufr Tris/HCl (200mM, pH7.5) NaCl (250mM) EDTA (25mM) SDS (0.5%) INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM ASTATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY DEN 2 IZOLACE ROSTLINNÉ DNA, PCR, PRÁCE S DATABÁZEMI MOLEKULÁRNĚ-BIOLOGICKÝCH INFORMACÍ Úvod Jednou z metod studia genomu je amplifikace krátkých úseků DNA pomocí PCR. V laboratoři si osvojíte rychlou metodu izolace DNA z rostlinného materiálu (viz předchozí den) a založíte několik PCR reakcí. Amplifikovat budeme úsek DNA pro použití jako sondu v pozdější hybridizaci a oblast inzerce cizí DNA (transpozonu En-1, dSpm a T-DNA) v genech AHP4, ARR4 a ARR21. v Časový harmonogram 13:00 ZALOŽENÍ PCR (Vojta Didi, Ivan Kashkan/Veronika Balakhonova) 14:00 DATABÁZE (Vojta Didi) 16:00 Ukončení druhého dne Přehled Úvod k praktické části • Úvod do metodologie praktika o obecné zásady práce s DNA a sterilními roztoky o schéma experimentu o navržení postupu pro identifikaci inzerčního mutanta a zjištění jestli se jedná o homo-nebo heterozygotní stav, vlastní provedení Praktická část 1. Izolace DNA 2. Založení PCR Metoda 2A Odbarvování preparátů pro analýzu genové exprese pomocí transkripční fuze 1. Proveďte výměnu 80% etanolu a umístěte semenáčky na 4°C, kde je ponecháte do 4. dne (čtvrtek). L I MINISTERSTVO ŠKOLSTV EVROPSKÁ UNIE ■ mládeže a tělovýchovy INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM ASTATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Metoda 2B Založení PCR Do 0.2 ml zkumavek pro PCR napipetovat postupně vodu, pufr, dNTP, templát, primery a Taq polymerázu podle schématu: PCR směs: lOxpufr dNTP priml prim2 Taqpol. templ. DNA H20 celk. 50 ul 5ul 4 ul 1 ul 1 ul 2ul primery AHP4 spec: Sim612, Sim799 - 212 bp primery ARR21 spec. : 16kon, 16new - 340 bp primery ARR4 spec: ARR4N, ARR4S - 137 bp primer transpozon 8130, Sim 799- 250 bp 8130, 16new- 390 bp dll, ARR4N- 195 bp Navrhněte vhodnou kombinaci primerů a to tak, abyste byli pomocí výsledků PCR reakce schopni identifikovat inerčního mutanta ve vašem genu a zjistit, zda se jedná o jedince homozygotního nebo heterozygotního pro danou inzerční alelu. Kombinace primerů pro jednotlivé typy templátů (viz také schéma na následující straně): primery templátová DNA AHP4: la ..................... ................... 2a ..................... ................... 3a ..................... ................... 4a ..................... ................... ARR21: lb ..................... ................... 2b ..................... ................... 3b ..................... ................... 4b ..................... ................... ARR4: lc ..................... ................... 2c ..................... ................... 3c ..................... ................... 4c ..................... ................... Na základě přiložených výsledků analýzy použitých primerů pomocí programu Oligo navrhněte vhodné podmínky PCR pro dané reakce: INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Cvklus:94°C .... s 30 cyklů: 94°C ... s 58°C ... s 72°C ... s 72°C ... min 4°C oo INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY ARR4 AHP4 ARR21 dli ^dsp atg| r m ARR45 l óiilv; r Úkoly (příklad): 1. Vyhledejte jeden bakteriální a jeden rostlinný gen Glu-6-P izomerázy v databáze Genbank 2. Vyhledejte geny cheY a cheA u E. coli 3. Určete nejbližší homolog cheY(E. Coli) u Arabidopsis pomocí algoritmů BLAST a FASTA. 4. Najděte tři různé regulátory odezvy nebo histidin kinázy u Arabidopsis. 5. Určete u libovolného genu v úkolu 4 polohu v genomu Arabidopsis (chromosom, polohu v publikované sekvenci daného chromosomu). 6. Vyberte si jeden gen z úkolu 4 a určete oblast 1000 bazí v oblasti promotoru genu. Ukončete sekvenci na ATG. Analyzujte na přítomnost vazebních míst transkripčních faktorů pomocí hledání v databázi TRANSFAC. 7. Srovnejte libovolné sekvence z Arabidopsis s homologií větší než 30% a menší než 100% pomocí algoritmu CLUSTALW. 8. Vyhledejte nejméně jednu EST sekvenci Glu-6-P izomerázy (hledání homologie nebo podle klíčového slova). INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM ASTATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Šablona k protokolům: Izolace DNA a PCR Jméno: Datum: Úloha: Cíl: Postup a výsledky: Závěr3: 3 Uveďte zejména, zda jste identifikovali inzerčního mutanta a zda se jedná o homozygota nebo o heterozygota pro danou inzerční alelu a proč. INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT je SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM ASTATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY DEN 3 IDENTIFIKACE PCR PRODUKTU V GELU, ZNAČENÍ SONDY PRO HYBRIDIZACI, PŘENOS DNA Z GELU NA MEMBRÁNU Úvod Další způsob identifikace genů je hybridizace se značenou sondou. PCR produkty rozdělíme pomocí elektroforézy v agarózovém gelu. Z gelu přeneseme DNA na nylonovou membránu spontánním kapilárním sáním v alkalickém prostředí. Pokud se přenáší na membránu DNA, mluvíme o metodě Southern blotting. Přítomnost specifické DNA na membráně prokážeme hybridizací se sondou. Sonda bude připravena z DNA známé sekvence a značena alkalickou fosfatázou štěpící substrát ECF. Výsledný produkt generuje chemifluorescenční signál, který budeme detekovat. v Časový harmonogram 8:00 PŘÍPRAVA AGARÓZOVÉHO GELU, NAPIPETOVÁNÍ VZORKŮ, ELEKTROFORÉZA (Markéta Pernisová/ Ivan Kashkan/Veronika Balakhonova) 9:00 STRUČNÝ ÚVOD K IDENTIFIKACI FRAGMENTŮ HYBRIDIZACÍ SE ZNAČENOU SONDOU (Markéta Pernisová) 10:00 IDENTIFIKACE PCR PRODUKTŮ V AGARÓZOVÉM GELU (Markéta Pernisová) 11:00 KAPILÁRNÍ PŘENOS (Markéta Pernisová/ Ivan Kashkan/Veronika Balakhonova) 12:00 OBĚD 13:15 ZNAČENÍ SONDY A HYBRIDIZACE (Markéta Pernisová/ Ivan Kashkan/Veronika Balakhonova) 16:00 UKONČENÍ PROGRAMU DNE Přehled metod 1. Elektroforéza DNA v agarózovém gelu 2. Detekce fragmentů v UV světle 3. Kapilární přenos (Southern blotting) 4. Izolace DNA z gelu 5. Určení koncentrace DNA 6. Značení sondy 7. Hybridizace 8. Detekce signálu INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT je SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM ASTATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Metoda 3A Příprava agarózového gelu, elektroforéza PCR produktů a jejich detekce. 1. Připravit 400 ml 1,5% agarózy v lx TBE pufru a rozvařit. Po rozpuštění agarózy přidat MidoriGreen, která bude sloužit k vizualizaci DNA. 2. Připravit formu pro gel, vsadit hřeben a nalít do formy vrstvu tekuté agarózy 5-8 mm. Nechat ztuhnout. 3. Formu s gelem vložit do elektroforézové vany, zalít pufrem a vyjmout hřeben. 4. Napipetovat délkový a hmotnostní standard a vzorky: • délkový a hmotnostní standard (NEB): 0,5 ug • vzorky: 10 ul PCR (zbytek ponechat pro přípravu sondy) + 2 ul 6x konc. nanášecího pufru 5. Spustit elektroforézu při 80 V po dobu 60 min. 6. Pozorovat proužky DNA v procházejícím UV světle a výsledek elektroforézy dokumentovat; později bude porovnáván se signály na hybridizační membráně (fotografie gelu a membrány by měly být 1:1). Tento gel bude použit pro Southern blotting. Base Pairs Mass(ng) 45 35 vS 27 24 2 I 18 97 38 29 25 48 Délkový a hmotnostní standard: 100 bp DNA ladder (0,5 ug) Metoda 3B Kapilární přenos v alkalickém prostředí 1. Po fotodokumentaci odstranit část gelu nad starty a pravý horní a pravý spodní roh gelu. Dále změřit délku a šířku gelu. Gel umístit do vaničky s destilovanou vodou a krátce opláchnout. INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT je SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM ASTATNiM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY 2. Vylít destilovanou vodu, přidat až 10 objemů denaturačního/přenosového roztoku (1,5M NaCl/0,5M NaOH), umístit na kývací platformu a míchat 30 až 40 min. 3. Během této doby sestavit aparaturu pro přenos DNA: a. Přes čistou vaničku položit skleněnou desku. b. Ustřihnout obdélník filtračního papíru Whatman 3 MM takových rozměrů, aby po přiložení přes skleněnou desku nepřesáhl šířku vaničky a zasahoval oběma užšími konci až na dno vaničky. Toto je první vrstva knotu, který bude sát roztok. c. Ustřihnout 3 obdélníky filtračního papíru Whatman 3MM takové velikosti, aby přesahovaly délku i šířku gelu asi o 1 cm na každé straně a další 3 obdélníky velikosti gelu. d. Nastříhat jednotlivé vrstvy buničiny o rozměrech gelu. Mělo by jich být tolik, aby po zatížení byla jejich výška 7-8 cm. e. Ustřihnout nylonovou membránu Hybond N+ velikosti gelu. f. Naplnit vaničku přenosovým roztokem a část ponechat v petriho misce. g. Smočit nejdelší filtrační papír Whatman 3MM a umístit na skleněnou desku. Pomocí skleněné pipety nebo tyčinky se zbavíme všech případných bublin mezi sklem a papírem. h. Smočit 3 větší filtrační papíry Whatman 3MM a postupně vrstvit do středu aparatury tak, aby nevznikaly vzduchové bubliny. i. Vyjmout gel z přenosového roztoku a přiložit opatrně vrchní stranou do středu vrchního filtračního papíru; odstranit všechny vzduchové bubliny. j. Opatrně umístit suchou nylonovou membránu na gel (od středu ke krajům). Okamžitě vzniká těsný kontakt s gelem. Při chybné manipulaci se nesnažit o opětovné umístění membrány na gel - v takovém případě použít novou membránu. k. Smočit postupně poslední tři filtrační papíry Whatman 3MM a vrstvit je na membránu. Odstranit případné vzduchové bubliny. 1. Nakonec přiložit vrstvu buničiny, zatížit suchou petriho miskou, kterou dále zatížíme odměrnou baňkou naplněnou asi 200 ml vody. Nádobu zabezpečíme úchytkou na stojanu. Nedotahujeme úplně natěsno. Mezi hrdlem baňky a úchytkou by měl zůstat volný prostor. 4. Zkontrolovat kontakt jednotlivých vrstev a pomocí proužků parafilmu umístěných těsně kolem gelu zamezit nežádoucímu kontaktu vrstev nad membránou a pod gelem. Tak se veškerý přenosový roztok může do horních vrstev dostávat pouze přes gel a nebude „obtékat". V opačném případě by se účinnost a stejnoměrnost přenosu snižovala. 5. Přenos nechat probíhat 3 hodiny, potom aparaturu rozebrat, membránu opláchnout v roztoku 2 x SSC a nechat uschnout mezi dvěmi filtračními papíry. V alkalickém prostředí se mezi nylonovou membránou a DNA vytvořily kovalentní vazby, a není proto nutné fixovat DNA dalšími postupy. Metoda 3C Izolace PCR produktu z agarózového gelu pomocí komerční soupravy Qiagen 1. Do startu nového agarózového gelu nanést 35 ul PCR směsi + 7 ul nanášecího pufru. 2. Po elektroforéze z agarózového gelu vyříznout daný proužek, aby bloček agarózy byl co nej menší. 3. Určit jeho hmotnost. 4. Přidat 3x objem pufru QG (tj. např. na 100 mg vyříznutého agarózového bločku přidat 300 ul pufru). 5. Zahřívat při teplotě 50°C po dobu 10 min nebo dokud se agaróza nerozpustí. Průběžně 2-3x INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT je SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM ASTATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY promíchat. 6. Přidat lx objem (gelu) izopropanolu (tj. např. na 100 mg vyříznutého agarózového bločku přidat 100 ul izopropanolu), promíchat a napipetovat do kolonky. Na kolonku se dá napipetovat maximálně 750 ul roztoku. 7. Centrifugovat při 14000 otáčkách 30s, odstranit protečený roztok. 8. Do kolonky přidat 750 ul pufru PE a centrifugovat při 14000 otáčkách 3 Os, odstranit protečený roztok. Centrifugovat ještě jednou bez pufru. Kolonku umístit do 1,5 ml čisté zkumavky s víčkem. 9. Na střed kolonky napipetovat 30 jxl sterilní ddthO, nechat stát 5 min při laboratorní teplotě a centrifugovat 1 min. Metoda 3D Měření koncentrace DNA Změřit absorbanci a spočítat koncentraci DNA (OD260 = 1,0 => konc. DNA = 50ng/ul) nebo odhadnout koncentraci DNA z gelu podle intenzity fluorescence porovnáním se standardem. Metoda 3E Příprava značené sondy 1. Naředit DNA na koncentraci 10 ng/ul. 2. Umístit 10 ul ředěné DNA do nové zkumavky a denaturovat 5 min ve vroucí vodě. 3. Okamžitě umístit DNA na led a 5 min chladit (v průběhu chlazení - asi po 2 až 3 min. - rychle stočit, aby se zkondenzovaná kapalina dostala na dno) 4. Přidat: 10 ul reakčního pufru (RP) 2 ul značícího činidla (ZC) 10 ul pracovní koncentrace „cross-linkeru" (CL) (činidlo, které zprostředkovává kovalentní vazbu enzymu na DNA). 5. Vše promíchat, stočit a inkubovat 30 min/ 37°C. Sonda se může použít ihned nebo může být skladována na ledu 2 hodiny. Metoda 3F Hybridizace 1. Předehřát požadovaný objem hybridizačního roztoku na požadovanou teplotu (55°C); objem pufru: 0,25 ml pufru /cm2 membrány. 2. Umístit membránu do hybridizačního válce s pufirem a prehybridizovat nejméně 30 min/55°C. 3. Přidat značenou sondu a hybridizovat přes noc. Pokračování: metoda 4C. Literatura Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: A laboratory manuál. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT je SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1987, 1st Volume, Preparation and analysis of DNA. Šablona k protokolům: Kapilární přenos DNA a hybridizace se značenou sondou. Jméno: Datum: 1. Popiš svými slovy princip: a) elektroforézy DNA b) metody Southern blotting c) značení sondy d) hybridizace DNA e) vznik a detekce fluorescenčního signálu 2. Co je to tzv. stringence hybridizace nebo posthybridizačního promývání? Které dva faktory ji ovlivňují a jak ji nohou měnit? INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT je SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Popis výsledků: Přiložte fotografii membrány, označte starty a okomentujte výsledek hybridizace. Závěr: INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT je SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY DEN 4 ANALÝZA PROTEIN-PROTEINOVÝCH INTERAKCÍ A BUNĚČNÉ LOKALIZACE PROTEINŮ Úvod Schopnost interagovat s dalšími proteiny je jednou ze základních charakteristik bílkovin jakožto základního kamene živých organismů. Protein-proteinová interakce je nutným předpokladem i pro přenos informace v signálních drahách. Informace se obvykle předává v podobě fosfátové skupiny mezi kinázou a jejím proteinovým substrátem, který je specificky rozpoznáván, anebo je prostřednictvím protein-proteinové interakce přímo ovlivňována aktivita interakčního partnera. Jednou z prvních otázek, které si klademe při funkční analýze genů rostlinných signálních drah, je ta, se kterými dalšími signálními elementy studovaný protein interaguje. Dalším důležitou otázkou je, ve kterém buněčném kompartmentu je protein lokalizován, případně ve kterém buněčném kompartmentu spolu dva proteiny interagují. S použitím transientní exprese proteinů po infdtraci listů tabáku Nicotiana benthamiana suspenzí Agrobacterium tumefaciens a s pomocí skenovací laserové konfokální mikroskopie (viz. Metoda 1B), můžeme tyto otázky zodpovědět. v Časový harmonogram 8:00 KONFOKÁLNÍ MIKROSKOPIE I, skupiny 1-3 (Serge Dabravolski) / ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FŮZE I, skupiny 4-6 (Jan Hejátko/ Ivan Kashkan/Veronika Balakhonova) 10:30 PROMÝVÁNÍ MEMBRÁN PO HYBRIDIZACI (Markéta Pernisová/ Ivan Kashkan/Veronika Balakhonova) 11:30 OBĚD 12:30 DETEKCE HYBRIDIZACE (Markéta Pernisová/Ivan Kashkan/Veronika Balakhonova) 13:00 KONFOKÁLNÍ MIKROSKOPIE II, skupiny 4-6 (Serge Dabravolski) / ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FŮZE II, skupiny 1-3 (Jan Hejátko/ Ivan Kashkan/Veronika Balakhonova) 15:30 AUTOMATICKÁ MIKROSKOPIE (Jan Hejátko/Markéta Pernisová) 16:00 UKONČENÍ PROGRAMU 4. DNE Přehled metod Bimolekulární fluorescenční komplementace (Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC) INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM ASTATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Proteiny, jejichž interakci chceme studovat, transientně exprimujeme v listech tabáku. Fluorescenční protein YFP je rozdělen na dvě poloviny (YFPN a YFPC, tedy N- a C- terminálni část proteinu) a každá polovina je fúzována s jedním ze studovaných proteinů. Pokud spolu proteiny interagují, dojde k rekonstituci YFP, kterou sledujeme konfokálním mikroskopem jako obnovení fluorescence YFP. Protože metodu BiFC provádíme v rostlinných buňkách, je možné rozpoznat, ve kterém kompartmentu buňky k interakcím našich proteinů dochází. Test zprostředkované vazby na membránu (Membráne Recruitment Assay, MeRA) Pro analýzu interakcí mezi membránovým proteinem a cytosolickými proteiny můžeme použít testu zprostředkované vazby na membránu (Membráne Recruitment Assay, MeRA). Membránový protein je spojen s červeným fluorescenčním proteinem RFP, zatímco cytosolický protein je fúzován s GFP fluoreskujícím zeleně. Při interakci takovýchto fúzních proteinů dochází k asociaci GFP signálu s membránou, což je možno jednoznačně potvrdit analýzou fluorescence rostlinných buněk koexprimujících oba proteiny prostřednictvím konfokální mikroskopie, která umožňuje jasně rozlišit membránový a cytosolický kompartment. Rastrovací konfokální mikroskopie (Confocal laser-scanning microscopy, CLSM) Jedná se mikroskopickou metodu umožňující snímat fluorescenční signál s velmi vysokým rozlišením. Jako bodového zdroje excitačního světla používáme lasery o různé vlnové délce. Laserový paprsek prochází konfokální clonkou (pinhole) a prostřednictvím objektivu je fokusován do malého bodu na preparátu, kde dojde k excitaci fluorescenčních barviček, nebo proteinů. Emitovaná fluorescence prochází zpět objektivem a skrze další konfokální clonku na fotonásobič, kde je světelný signál převeden na elektrické impulsy. Konfokální clonka zajišťuje, že se na detektor dostane pouze světlo z excitovaného bodu. Světlo přicházející z oblastí nad a pod rovinou ostrosti je clonkou odfiltrováno. Posunu ohniska skrz celé zorné pole objektivu je dosaženo plynulým pohybem zrcátka skenovacího zařízení. Protože rychlost jeho pohybuje mnohem nižší než rychlost světla, jsme schopni pomocí softwaru zrekonstruovat obraz s vysokým rozlišením a zobrazit ho na monitoru počítače. Metoda 4A Analýza protein-proteinovych interakcí a buněčné lokalizace proteinů 1. Připravte si 100 pipetu, destilovanou vodu, krycí a podložní sklíčka, která popište. 2. Na střed krycího sklíčka kápněte 100 vody. 3. Z listu tabáku infiltrovaného v pondělí vystřihněte přibližně čtvercový tvar o ploše 1-2 cm2 a umístěte ho na kapku tak, aby spodní strana listu směřovala vzhůru. 4. Na spodní stranu listu naneste 100 kapku vody, přiklopte krycím sklíčkem. 5. Jemným poklepáváním zajistíte dosednutí krycího sklíčka a odstraníte vzduchové bubliny. 6. S připravenými preparáty se přesuňte ke konfokálnímu mikroskopu. 7. Pomocí rastrovací konfokální mikroskopie sledujte fluorescenční signál a jeho lokalizaci uvnitř buněk. 8. Vyhodnoťte výsledky pozorování a vypracujte protokol, ve kterém zpracujte všechny body uvedené v šabloně. INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT je SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM ASTATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Šablona k protokolům: Analýza protein-proteinových interakcí a buněčné lokalizace Jméno: (uveďte rovněž číslo své skupiny) Datum: Úloha: Cíl: Postup a výsledky4: Závěr5: 4 Uveďte stručný popis postupu při infiltraci tabákových listů (viz. Metoda 1b). Proč je součástí infiltračního AS média acetosyringon? Proč je infiltrační suspenze agrobakterií obsahuje vždy kmenpl9? Jaké jsou charakteristické rysy jádra, cytoplasmy, endoplasmatického retikula a plasmatické membrány, na jejichž základě byste byli schopni tyto kompartmenty jednoznačně rozpoznat pomocí rastrovací konfokální mikroskopie? Zpracujte do přehledné tabulky. 5 Vyhodnoťte podrobně interakce a lokalizace proteinů, které vaše skupina zkoumala a stručně shrňte výsledky kolegů z dalších dvou skupin. INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT je SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM ASTATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Metoda 4B Příprava preparátů pro automatickou mikroskopii Proveďte projasnění odbarvených semenáčků podle následujícího protokolu: 1) Opatrně odpipetujte 80% etanol a přidejte 1 ml 0,25M HC1 / 20% MetOH, inkubace 15min při 53 °C6. Roztok opatrně odsát pipetou. 2) 1 ml 7% NaOH / 60% EtOH, inkubace 15 min při rt7. Roztok opatrně odsát pipetou. 3) 1 ml 40% EtOH, 10 min, rt. 4) Přidejte 1 ml H20 = 20% EtOH, 10 min, rt. Roztok odsát. 5) 1 ml 10% EtOH, 10 min, rt. 6) +1 ml 50% glycerolu = 5% EtOH / 25% glycerol, 15-30min, rt (on, 4 °C). Roztok odsát. 7) 1 ml 50% glycerol. Metoda 4C Posthybridizační promývání 1. Předehřát primární promývací pufr na 60°C. Použitý objem: 2-5 ml/ cm2 membrány. 2. Opatrně přenést membránu do vyhřátého válce. 3. Promývat primárním promývacím pufrem 2x10 min při 60°C. 4. Promývat druhým promývacím pufrem 2x5 min při laboratorní teplotě. 5. Membránu vložit do misky s druhým promývacím roztokem a nechat stát 10-15 min. Vyvíjení chemifluorescenční signálu za použití ECF substrátu 1. Membránu umístit na čistý neabsorpční povrch a napipetovat rovnoměrně po celém jejím povrchu ECF substrát (25 ul/ cm2 membrány); inkubovat 1 min. 2. Přiložit vrchní část detekční fólie, odsát přebytek substrátu a zatavit. 3. Inkubovat ve tmě při laboratorní teplotě. Detekci provést přibližně po 1 hodině. Detekce chemifluorescenčního signálu 1. 10 minut před detekcí zapnout přístroj LAS, aby se vychladila kamera. 2. Na detekční plotnu přístroje položit fólii s membránou. 3. Použít nastavení pro detekci SYBR Green (vlnová délka: excitace 430 nm, emise 560 nm) 4. Skenovatpro chemifluorescenci. Metoda 4D Automatická mikroskopie (Markéta Pernisová) 1) Vložte preparáty do automatického mikroskopu a nechte snímat pře noc. 6 hybridizační pec 7 rt, pokojová teplota INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ TENTO PROJEKT je SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM ASTATNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY DEN 5 8:00 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FŮZE (Jan Hejátko, Markéta Pernisová, Ivan Kashkan/Veronika Balakhonova) 5. Vyhodnocení výsledků automatické mikroskopie 10:00 kolokvium (A2/1.21)