Využití kapilární elektroforézy při studiu enzymů Zdeněk Glatz Ústav biochemie př.f. MU Frederic Reuss (1807) Katoforéza Elektroforéza (1909) Leonor Michaelis Volná elektroforéza (1925) + +- - A+B C B+C A+B+CA+B+C A µA > µB >µC Volná elektroforéza Arne Tiselius (1902 –1971) Volná elektroforéza Arne Tiselius (1902 –1971) Nobelova cena1948 Zónová elektroforéza (1939) + + A+B+C A B C - -µA > µB >µC Skylab Skylab Stabilizace Porézní media Kapilára Porézní media 1939 Papír 1950 Agarový gel 1955 Škrobový gel 1957 Acetát celulosy 1959 Polyakrylamidový gel 1979 Agarosový gel Kapilární elektroforéza 1967 - Hjerten 3 mm kapilára Kapilární elektroforéza 1981 - Jorgenson Lukacsová 75 µm kapilára Beckman 1987 2003 - Projekt lidského genomu Paralelní sekvencováni Automatizace 2003 - Projekt lidského genomu 1 DNA – 1 vzorek 300 sekvenátorů Proč enzymy ? Enzymy – molekulární stroje Enzymy – molekulární stroje 2 H2O2 O2 + 2H2O Rychlostní konstanta :  Bez katalýzy - 0,23 s-1  Pt - 1,3 . 103 s-1  Enzym - katalasa - 3,7 . 107 s-1 Enzymy – molekulární stroje 0 Pt Katalasa Enzymy – molekulární stroje Katalasa 2 H2O2 O2 + 2H2O Číslo přeměny 40 000 000 1 molekula enzymu přemění 40 000 000 molekul substrátu za 1 s Escherichia coli Homo sapiens 3 000 bílkovin 25 000 bílkovin Enzymy – stanovení koncentrace Koncentrace ↔ Katalytická aktivita Substrát ↔ Produkt  Biochemie  Molekulární biologie  Klinická diagnostika  Farmakologie – vývoj léčiv  Biotechnologické procesy  Bioanalytická chemie Stanovení aktivity enzymů Metody používané pro stanovení aktivity enzymů  Spektrofotometrické  Spektrofluorimetrické  Elektrochemické  Radiochemické  Separační – HPLC, GC, CE Enzyme Assays R.Eisenthal and M.J. Danson HPLC in Enzymatic Analysis E.F. Rossomando Proč enzymy a CE ? Výhody CE  Aplikační diverzita nabité i neutrální látky nízkomolekulární i vysokomolekulární látky chirální i achirální látky bakterie i viry Výhody CE  Aplikační diverzita  Jednoduchá instrumentace CZE, MEKC, CIEF, CITP NACE, MEEKC, CGE, ChCE CEC Výhody CE  Aplikační diverzita  Jednoduchá instrumentace  Vysoké rozlišení a účinnost separací  Malá spotřeba vzorku  Rychlost analýzy  Malá spotřeba chemikálií a malé množství odpadů Kapilára jako reakční prostor Výhody CE  „Pre-capillary“  „On-capillary“  „Post-capillary“ Studium enzymových reakcí pomocí CE HOMOGENNÍ Studium enzymových reakcí pomocí CE  „Pre-capillary“ provedení : - kapilára je používána pouze pro separaci a detekci - nutná manipulace mezi enzymovou reakcí a separací Kinetické stanovení glutathion S-transferasa Šišková, Z. et al. J. Sep. Sci., 2005, 28, 1357. „End point“ stanovení cytochrom P450 2C9 Konečný, J. et al. Electrophoresis, 2007. 28, 1229. Studium enzymových reakcí pomocí CE  „On-capillary“ provedení : - kapilára je navíc využita i jako reakční prostředí - stanovení je automatizováno – dávkování, smísení, inkubace, separace, detekce ⇒ CE Elektroforeticky zprostředkovaná mikroanalýza Electrophoretically Mediated MicroAnalysis EMMA rozdílná elektroforetická mobilita enzymu a jeho substrátu(ů) pro vyvolání reakce přímo v kapiláře J. Bao, F.E. Regnier, J. Chromatogr. 608, 217 (1992). EMMA - kontinuální mód E P Detection window A Substrate filled capillary + + - - EMMA – zonální mód S E P B Detection window - + + - EMMA – zonální mód Výhody :  Menší spotřeba vzorků – enzym, substráty, inhibitory  Vyhodnocování EMMA – vyhodnocení E.S .Kwak et al., Anal. Chim. Acta 397, 183 (1999). G6PDH Glu-6P + NAD+ 6P-Glu + NADH Kontinuální mód Zonální mód B.J. Harmon et al.,J. Chromatogr. A 726, 193 (1996). t0 ∆ ϖ1 ϖ2 δ tcontact tmerge A B C 1 2 EP reactiont E ϖ ϖ µ∆ + = merge EP t E δ µ∆ = vypnutí el. napětí: “zero potential amplification” EMMA – zonální mód Studium enzymových reakcí pomocí CE  „Post-capillary“ provedení : - vzorek je nejprve separován pomocí CE, na konci kapiláry je reaktor, kde probíhá enzymová reakce - uvedenou variantu nelze použít u komerčních CE zařízení A. Emmer, J. Roeraade, Chromatographia 39 (1994) 271. Studium enzymů pomocí CE ? (pre-capillary versus on-capillary) Off-line – pre-capillary On-line – on-capillary Thermomixer CE System Inkubace Analýza Inkubace + analýza CE System µl nl Rhodanasa (EC 2.8.1.1) CN- + S2O3 2- → SCN- + SO3 2Homo sapiens Detoxikace kyanidu - otravy - cigaretový kouř - glykosinoláty Brassicacceae Acidithiobacillus ferrooxidans Biohydrometalurgie Životní prostředí Volba separačních podmínek rhodanasa – pre-capillary stanovení aktivity CN- + S2O3 2- → SCN- + SO3 2- 0.1 mM TTAB - 15 mM borát pH 9.0 blízká mobilita CN-, SCNvysoká koncentrace CN- v reakční směsi Glatz, Z. et al J. Chromatogr A, 1999, 838, 139. rhodanasa – pre-capillary stanovení aktivity 100 mM β-alanin - HCl, pH 3.5 nízký EOF CN- = HCN ,Volba separačních podmínek CN- + S2O3 2- → SCN- + SO3 2- Analýza standardů rhodanasa – pre-capillary stanovení aktivity min1 2 3 4 5 6 mAU 0 20 40 60 80 100 120 140 SO2 3 2_ SCN _ "LONG END INJECTION" Kapilára: křemenná, vnitřní průměr 75 µm, celková délka 64.5 cm, efektivní délka 56 cm Dávkování : 50 mbar/6s Separační napětí: 18 kV (negativní polarita) Teplota kapiláry: 25 ± 0,1 °C Detekce: λ = 200 nm (šířka pásu 20 nm) Vzorek : 1 mM S2O3 2-, 1 mM SCN-, 25 mM CNv 25 mM HEPES pufru (pH 8.5) Stanovení aktivity rhodanasa – pre-capillary stanovení aktivity 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 5 10 15 20 25 30 TIME [min] PEAKAREA Dávkování rhodanasa – pre-capillary stanovení aktivity Long-endShort-end „Short end“ versus „Long end injection“ rhodanasa – pre-capillary stanovení aktivity min1 2 3 4 5 6 mAU 0 20 40 60 80 100 120 140 min1 2 3 4 5 6 mAU 0 20 40 60 80 100 120 140 S O2 3 2_ SCN_ SCN_ S O2 3 2_ "LONG END INJECTION" "SHORT END INJECTION" CALIBRATION CURVES 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 0 1 2 3 4 5 6 SCN- [mM] PEAKAREA A B A - "short end" injection B - "long end" injection Short-end injection Long-end injection Doba analýzy 1.5 min 7 min Přesnost migračních časů (n=10) 0.11 % 0.04 % Přesnost plochy píků (n=10) 0.33 % 0.82 % Linearita 50 - 5000 µM 50 - 5000 µM Korelační koeficient 0.9993 0.9998 Limit detekce 2.5 µM 5 µM rhodanasa – pre-capillary stanovení aktivity „Short end“ versus „Long end injection“ Stanovení aktivity rhodanasa – pre-capillary stanovení aktivity min0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 mAU 0 50 100 150 200 12 min 0 min 3 min 9 min 6 min 15 min 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 5 10 15 20 25 30 TIME [min] PEAKAREA S2O3 2- SCN- Volba separačních parametrů Stejný pufr použit jak pro enzymovou reakci, tak pro separaci produktů pH optimum rhodanasy: 8.5 rhodanasa – EMMA stanovení kinet. parametrů BGE pH 8.5 – (nepokrytá kapilára, PVA – pokrytá kapilára) Nováková, S. et al. Electrophoresis,, 2002, 23, 1063. Volba separačních parametrů Separace anorganických aniontů (S2O3 2- , SCN-) probíhá nejlépe při nízkém pH základního elektrolytu ⇒ eliminace EOF pH optimum rhodanasy: 8.5 rhodanasa – EMMA stanovení kinet. parametrů Kombinace metody EMMA s "partial filling technique" 25 mM HEPES (pH 8,5) Základní elektrolyt 100 mM β-alanin – HCl (pH 3.5) Dávkování 1. 25 mM HEPES pufr (pH 8.5) : 50 mbar/4s 25 mM HEPES (pH 8,5) Substráty v 25 mM HEPES (pH 8,5) Rhodanasa v 25 mM HEPES (pH 8,5) +- Detekce 200 nm nástřik vzorku rhodanasa – EMMA stanovení kinet. parametrů Dávkovací a separační parametry 4. 25 mM HEPES pufr (pH 8.5) : 50 mbar/4s 3. Substráty ve 25 mM HEPES pufru (pH 8.5) : 50 mbar/4s 2. Rhodanasa ve 25 mM HEPES pufru (pH 8.5) : 50 mbar/4s Parametr Hodnota Přesnost migračních časů (n=10) 0,23 % Přesnost ploch píků (n=10) 3,88 % Separační napětí 18 kV (negativní polarita) rhodanasa – EMMA stanovení kinet. parametrů Stanovení Michaelisových konstant Km -0,006 -0,004 -0,002 0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 -1 -0,75 -0,5 -0,25 0 0,25 0,5 0,75 1 1,25 1/ [Na2S2O3] (l/mmol) 1/plochapíku(mAU*s) 1 mM KCN 2 mM KCN 5 mM KCN 10 mM KCN y = 0,5839x + 0,0768 -0,2 -0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1/ [KCN] (l/mmol) úseknaosex 1/KM(S2O3 2-) 1/KM(CN-) Stanovení Michaelisových konstant Km KM (CN-) = 7.60 mM KM (S2O3 2-) = 13.02 mM rhodanasa – EMMA stanovení kinet. parametrů E•S2O3 2- S2O3 2- SO3 2- E ES CN - SCN - rhodanasa – EMMA stanovení kinet. parametrů Br - S2O3 2- SCN bez inhibitoru s inhibitorem Inhibice rhodanasy 2-oxoglutarátem (inhibitor přidán do zóny substrátů) Nováková, S. et al J. Chromatogr. A, 2003, 990, 189. rhodanasa – EMMA stanovení kinet. parametrů E•S2O3 2- S2O3 2- SO3 2- E ES CN - SCN - 2-OGES • 2-OG cyanohydrin 2-OG KI (mM) inhibice S2O3 2 1.40 akompetitivní CN - 3.62 x 10 -1 kompetitivní Diagnostika typu inhibice Haloalkandehalogenasa (EC 3.8.1.5) RX + H2O → ROH + X- + H+ • Odbourávání halogenovaných derivátů uhlovodíků • Enantioselektivní organické syntézy Volba separačních podmínek haloalkandehalogenasa – pre-capillary stanovení 100 mM β-alanin - HCl, pH 3.5 UV 200 nm Separační napětí 18 kV (hegativní polarita) RBr + H2O → ROH + Br- + H+ Glatz, Z., et al. J. Chromatogr. A, 2000, 895, 219. Volba separačních podmínek haloalkandehalogenasa – pre-capillary stanovení Nepřímá detekce RCl + H2O → ROH + Cl- + H+ ? Nepřímá detekce haloalkandehalogenasa – pre-capillary stanovení 5 mM chroman 0.5 mM TTAB pH 8.5 Nepřímá detekce – 315 nm / 375 nm Separační napětí 15 kV (negativní polarita) Stanovení aktivity substrát 1-brombutan haloalkandehalogenasa – pre-capillary stanovení Přímá detekce Nepřímá detekce Základní elektrolyt 20 mM β-alanin - HCl, pH 3.5 - přímá detekce separační napětí 29,9 kV (negativní polarita) nebo 10 mM chroman 0.1 mM CTAB pH 9.2 - nepřímá detekce separační napětí 18 kV (negativní polarita) haloalkandehalogenasa – EMMA Dávkovací a separační parametry Dávkování 1. 20 mM glycinátový pufr (pH 8.6) : 50 mbar/4s 4. 20 mM glycinátový pufr (pH 8.6) : 50 mbar/4s 3. Substrát ve 20 mM glycinátovém pufru pufru (pH 8.6) : 50 mbar/4s 2. Enzym ve 20 mM glycinátovém pufru (pH 8.6) : 50 mbar/4s Telnarová, M. et al. Electrophoresis, 2004, 25, 290. Stanovení Michaelisovy konstanty Km substrát 1-brombutan haloalkandehalogenasa – EMMA Přímá detekce Nepřímá detekce Stanovení Michaelisovy konstanty Km substrát 1-brombutan haloalkandehalogenasa – EMMA Přímá detekce Nepřímá detekce KM = 0,17 mMKM = 0,59 mM Stanovení inhibiční konstanty Ki substrát 1-brombutan; inhibitor 1,2-dichloethan haloalkandehalogenasa – EMMA Telnarová, M. et al. Electrophoresis, 2004, 25, 1028. haloalkandehalogenasa – EMMA Přímá detekce Nepřímá detekce KI = 0,63 mM KI = 0,44 mM Stanovení inhibiční konstanty Ki substrát 1-brombutan; inhibitor 1,2-dichloethan „Pre-capillary“ enzymové stanovení stanovení aktivity  Vysoká účinnost  Vysoké rozlišení  Rychlost analýzy Studium kinetiky dvousubstrátové enzymové reakce (60 experimentů) * spotřeba vzorku enzymu – 20 µl !! * doba studie – 3 hodiny SE !! (10 hodin LE) „On-capillary“ enzymové stanovení studium kinetiky  Vysoká účinnost  Vysoké rozlišení  Rychlost analýzy  Automatizace  Malá množství vzorku EMMA současně jako předseparační metoda ? Sulfotransferasa (EC 2.8.2.1) cytosolická - biotransformace/detoxikace xenobiotik (II fáze) membránově vázaná - sulfatace glykoproteinů O OHO P HO -O O N N N N NH2 CH2O P O S O- O O- O O + O OHO P HO -O O N N N N NH2 CH2O P HO O- O + PAPS PAP OH NO2 O NO2 S O- OO 4-Nitrophenol 4-Nitrophenyl sulfate SULT1A1 Reakce Velmi silný inhibitor reakce KI = 0.4 µM Velmi nestabilní 80 % (20 % PAP) sulfotransferasa – EMMA stanovení aktivity a kinetických parametrů 274 nm ~1 mg 5400 Kč Vytisková, S. et al. J. Chromatogr. A, 2004, 1032, 319. sulfotransferasa – EMMA stanovení aktivity a kinetických parametrů Předseparace PAP od PAPS – MEKC (cholát) Standard Migrační čas (s) Mobilita (cm2V-1s-1) Rychlost (cm s-1) PAP 246 -3.90 x 10-4 -0.106 PAPS 339 -4.03 x 10-4 -0.130 Separační odmínky: BGE: 150 mM HEPES, pH 6.5 + 20 mM kyselina cholová Kapilára: LT=31.2 cm (LE = 21cm), 75µm I.D. Napětí: + 10 kV Teplota kapiláry: 37 °C Detekce: 260 nm Dávkování: 0.3 psi/ 5 s 1mM PAP nebo 115 mM PAPS PAPS Krok Zóna Tlak pi (psi) Čas (s) Napětí (kV) 1. Dávkování PAPS PAPS 0.5 5 / 2. Předseparace od PAPS / / 60 15 3. Dávkování S 4-NP 0.3 5 / 4. Dávkování E SULT1A1 0.3 5 / 5. Smísení a enzymová reakce / / 60 5 6. Inkubace / / 120 0 7. Separace / / 300 10 sulfotransferasa – EMMA stanovení aktivity a kinetických parametrů Dávkování a inkubace PAP +- detekce nástřik vzorku P Stanovení Michaelisovy konstanty pro 4-nitrofenol sulfotransferasa – EMMA stanovení aktivity a kinetických parametrů 0.1 µM pNP 0.2 µM pNP 0.3 µM pNP 0.5 µM pNP 1 µM pNP 1.5 µM pNP 2.5 µM pNP KM = 0.8 µM Stanovení substrátů metodou EMMA ? stanovení kyanidu metodou EMMA po enzymatické konverzi na thiokyanatan CN- + S2O3 2- → SCN- + SO3 2- 20 mM S2O3 v 25 mM HEPES (pH 8,5) 20 mM S2O3 v 25 mM HEPES (pH 8,5) Vzorek CN- Rhodanasa a 20 mM S2O3 v 25 mMHEPES (pH 8,5) detekcenástřik vzorku Papežová, K. et al. J. Chromatogr. A, 2006, 1120, 268. Dávkování a inkubace Krok Tlak (mbar) Čas (s) Napětí (kV) 1. Dávkování HEPES pufru 50 4 0 2. Dávkování rhodanasy 50 4 0 3. Dávkování vzorku 50 4 0 4. Dávkování HEPES pufru 50 4 0 5. Smíchání vzorku a rhodanasy 0 3 18 6. Inkubace 0 21 0 7. Separace 0 420 18 stanovení kyanidu metodou EMMA po enzymatické konverzi na thiokyanatan Vzorek lysatu erythrocytů (LOD 3 µM) stanovení kyanidu metodou EMMA po enzymatické konverzi na thiokyanatan Využití metody EMMA v proteomice ? Vzorek 2D Elfo1D, 2D HPLC, CE, HPLC-CE, CE-HPLC Tryptické štěpení MS/MS Zeisbergerová, M. et al. Electrophoresis, 2009, 30, 2378. integrace „on-line“ tryptického štěpení do CE Separační napětí 18 kV (negativní polarita) 25 mM Tris-HCl (pH 8,5) Trypsin ve 25 mM Tris HCl (pH 8,5) Protein ve 25 mM Tris HCl (pH 8,5) Detekce 200 nm nástřik vzorku 25 mM Tris-HCl (pH 8,5) Trypsin ve 25 mM Tris HCl (pH 8,5) Dávkovací a separační parametry Základní elektrolyt 0,1 M fosfátový pufr pH 2,5 nebo 0,1 M mravenčanový pufr pH 2,5 integrace „on-line“ tryptického štěpení do CE Optimalizace β-kasein, cytochrom c Teplota kapiláry 35 oC Množství trypsinu 0,1 mg/ml „Zero potential amplification“ 0 s integrace „on-line“ tryptického štěpení do CE cytochrom c off-line štěpení – 12 hodin + 1 hodina analýzy on-line štěpení – 1 hodina včetně analýzy EMMA – využití  Enzymové systémy • Aktivita enzymů • Koncentrace substrátů a inhibitorů • Kinetika enzymové reakce  Neenzymové systémy • GSH, HCys, Cys, DTT • Ca(II) • Gentamycin a kanamycin • Kreatin • Cr(VI) a Co(II) Využití metody CE při vývoji nových léčiv Vývoj nového léčiva Vývoj nového léčiva ~ 500 mil $ Alzheimer Alzheimer β-sekretasa FRET assay  β-Secretase = aspartic-acid protease  SEVNLDAEFR = model substrate β-sekretasa FRET assay 2–6 nm off-line CE-MS metoda y = 0.2997x R² = 0.9961 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 0 5 10 15 20 25 SEVNLpeakarea/AtIIpeakarea[A.U.] c SEVNL (uM) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Tim e [m in ] 0 1 2 3 5x1 0 In te n s. At II SEVNL 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Time [min] 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 7x10 Intens. Total ion electropherogram Base peak electropherogram Kinetická a inhibiční studie β-sekretasy Substrate µM[ ] 0 200 400 600 800 1000 1200 0 1 2 3 4 5 6 7 SEVNLpeakarea/AtIIpeakarea[A.U.] KM = 706.4 ± 80.6 Mμ 0 1 2 3 4 5 6 -2 0 2 4 log c (LY2886721) SEVNLpeakarea/AtIIpeakarea[A.U.] SEVNLpeakarea/AtIIpeakarea[A.U.] log c (KTEEISEVN[Statin(3S,4S)]VAEF) -2 0 2 4 0 1 2 3 4 5 6 -2 -1 0 1 2 3 4 5 0 2 4 6 log c (donepezil) SEVNLpeakarea/AtIIpeakarea[A.U.] On-line CE-UV metody Vývoj nového léčiva - LADME Cytochromy P450 (CYP) RH + O2 + NADPH → ROH + NADP+ + H2O Homo sapiens 50 různých CYP izoforem podíl na metabolismu 80 % známých léčiv Jaterní plátky, hepatocyty, mikrosomy, rekombinantní enzymy BGE DetektorRoztok enzymu Roztok substrátu Reakční směs Produkt reakce 1 0,5 x c=C/C0 EMMA – CYP3A4 + dextrometorfan HLM CYP3A4 EMMA – CYP3A4 + dextrometorfan Zeisbergerová, M. et al. Electrophoresis, 2009, 30, 2378. Míchání difuzí V. Okhonin, X. Liu, S.N. Krylov, Anal. Chem. 77 (2005) 5925. TDLFP = Transverse diffusion of laminar flow profiles1 Míchání difuzí TDLFP = Transverse diffusion of laminar flow profiles1 R. Řemínek, M. Zeisbergerová, M. Langmajerová, Z. Glatz, Electrophoresis, 34 (2013) 2705. Míchání difuzí – CYP2C9 + diclofenac BGE DetektorRoztok enzymu Roztok substrátu Reakční směs Produkt reakce 1 0,5 x c=C/C0 R. Řemínek, M. Zeisbergerová, M. Langmajerová, Z. Glatz, Electrophoresis, 34 (2013) 2705. Míchání difuzí – CYP2C9 + diclofenac Km = 2,66 ± 0,18 μM; Vmax = 7,91 ± 0,22 nmol/min/nmol; n = 1,59 ± 0,16; IC50 = 0,94 ± 0,04 μM ; Ki = 0,39 ± 0,07 μM Míchání difuzí – CYP2C9 + diclofenac Kombinace TDLFP s MS detekcí Langmajerová, et al. Electrophoresis, 36 (2015) 1365. Chiralita – chirální separace ? pomocí CE Thalidomid Thalidomid Chirální separace Cyklodextriny Ketamin anestetikum a analgetikum v humánní a veterinární medicíně CYP3A4, CYP2B6, CYP2C9 TDLFP ketaminu 50 mM TRIS-fosfátový pufr (pH 2.5) obsahující 3 % (w/v) vysoce sulfatovaný γ-cyclodextrin KM (µM) Vmax (nmol/min/n mol) 74.22 ± 5.75 15.66 ± 0.52 79.54 ± 8.49 10.13 ± 0.48 62.91 ± 8.02 8.18 ± 0.40 66.45 ± 6.62 7.47 ± 0.31 Kinetická studie Řemínek, R. et al. Electrophoresis, 36 (2015) 1349. Inhibiční studie Počítačové simulace EMMA versus TDLFP  EMMA + homogenní reakční směs - nutné optimalizovat  TDLFP + universálnost - homogenita ??? Enzymový reaktor IMER Studium enzymových reakcí pomocí CE HETEROGENNÍ IMER  Vyšší stabilita enzymu  Možnost kombinace se separačními metodami – HPLC, CE  Výhodnější poměr substrát/enzym → vyšší citlivost, selektivita, reprodukovatelnost atd.  Možnost opakovaného použití CYP2CD IMER Schejbal, J. et al. J. Chromatogr., 1437 (2016) 234. Studium enzymových reakcí CE EMMA EMMA EMMA TDLFP IMER Příspěvek Čechů k separačním metodám Příspěvek Čechů k separačním metodám Vám děkuji za pozornost!