Anton Kočan, RECETOX, MU Brno: Analytická
chemie ŽP, podzimní semestr 2016/2017
1
Anton KočanAnton Kočan
Analytická chemie životního prostředíAnalytická chemie životního prostředí
podzimní semestr,podzimní semestr, 2016/20172016/2017
1.Úvod
Význam analytické chemie při kontrole znečištění životního prostředí. Zdroje a transport polutantů v
prostředí. Rozptyl, degradace a akumulace polutantů v prostředí, perzistence a biokoncentrace.
Specifické problémy environmentální analýzy, obecné schéma analytického postupu.
Učební osnova
2. Vzorkování
Kvalita vzorku, jeho velikost a počet, strategie odběru, vzorkovací plán, odběrový protokol, konzervace,
transport a skladování vzorků. Techniky odběru vzorků ovzduší, aktivní a pasivní vzorkovače, atmosférická
depozice, odběr srážkových, povrchových, podzemních vod, odběry tuhých vzorků, půd, odpadů, sedimentů,
bioty, krmiv, potravin, biologických materiálů.
3. Zpracování vzorků
Úprava vzorku před analýzou, extrakce tuhých vzorků pomocí rozpouštědel, extrakce vodných vzorků
(kapalinou, plynem, na tuhou fázi), analýza rovnovážné plynné fáze.
Čištění a frakcionace vzorku (kolonová kapalinová chromatografie, gelová permeační chromatografie)
4. Techniky analytického stanovení
Chromatografické techniky, jejich princip, instrumentace, využití, interpretace dat.
HPLC, GC, výběr kolon, fází, detektorů, GC-MS
5. Postupy stanovení významných polutantů ve složkách životního prostředí
Prioritní polutanty, nové typy sledovaných polutantů, vlastnosti PCBs, PCDDs/Fs, PAHs, pesticidů, fenolů a
chlorfenolů a jejich stanovení ve vzorcích ovzduší, vody, půd, sedimentů, bioty (homogenizace, extrakce,
rozklad kyselinou, odstranění lipidů a interferentů, frakcionace, zakoncentrování, GC-ECD, GC-MS, HPLC).
6. Kvalita dat, základy QA/QC a GLP
Kalibrace, její rozsah a linearita. Citlivost metody, mez detekce a mez stanovitelnosti. Přesnost, správnost,
shodnost analytických dat, reprodukovatelnost a opakovatelnost. Výtěžnost metody, referenční a
certifikované materiály, obohacené a slepé vzorky, regulační diagramy. Mezilaboratorní srovnávací testy.
Základy GLP, validace a verifikace metod, dokumentace, plány, standardní operační postupy, protokoly,
uchování dat, akreditace.
Doporučená literatura:
Reeve R.: Introduction to environmental analysis
Fifield F.W., Haines P.J.: Environmental analytical
chemistry
Skoog D.A., Leary J.J.: Principles of instrumental analysis
Hewitt C.N.: Instrumental analysis of pollutants
Keith L.H.: Environmental sampling and analysis
Popl M, Fahnrich J.: Analytická chemie životního prostředí
Janko J., Chýlková J., Rusek V., Vlček J.: Analýza
znečištěnin a technika jejich odběrů
?
•Začiatkom 60. rokov minulého storočia sa švédsky
výskumník, Dr. Jensen pokúšal študovať hladiny DDT v
ľudskej krvi a pri prezeraní plynovochromatografických
záznamov pozoroval záhadnú skupinu chemických látok.
História detekcie PCB v životnom prostredí (1)
•Tieto zlúčeniny boli vo všetkých vzorkách,
takže si nebol istý, či ide o prírodné alebo
syntetické látky.
•Po 2 rokoch skúmania zistil, že tieto látky
obsahujú chlór a chemicky sa podobajú DDT.
•Jensen zistil, že to nie sú pesticídy, pretože
ich pozoroval aj v múzejných vzorkách
pochádzajúcich z r. 1935, kedy sa ešte
organochlórové pesticídy nepoužívali.
História detekcie PCB v životnom prostredí (2)
•Zistil, že vzorky pochádzajúce zo Švédska a
okolitých morí obsahovali tieto látky.
Dokonca vzorky vlasov jeho ženy a 3 detí
obsahovali stopové množstvá. Najvyššie
hladiny však pozoroval u svojej dcéry, ktorá
bola ešte dojčená.
•V tomto momente Jensen nebol schopný sa
pohnúť ďalej. Bez použitia referenčných
štandardov, neumožňovala plynová
chromatografia s klasickými detektormi
identifikovať „nové“ zlúčeniny.
História detekcie PCB v životnom prostredí (3)
Anton Kočan, RECETOX, MU Brno: Analytická
chemie ŽP, podzimní semestr 2016/2017
2
•Pretože obsah DDT a neznámych zlúčenín
prítomných vo vzorke tuku z orla bol veľmi vysoký,
Jensen využil hmotnostnú spektrometriu na
identifikáciu, hoci v tom čase to nebol veľmi citlivý
detektor v plynovej chromatografii. Získané
hmotnostné spektrá ukázali, že ide o
polychlórované bifenyly (PCB).
ClyClx
História detekcie PCB v životnom prostredí (4)
O
O
ClyClx
PCDD
2,3,7,8-TCDD
yClCl
x
O
PCDF
ClCl
Cl
O
1
2
3
4 6
7
8
9
OCl
Polychlórované dibenzo-p-dioxíny
a dibenzofurány
Zovšeobecnený vzorec PCB
Clx Cly
para
meta
meta
ortho meta
meta
para4'
6' 5'
23 2' 3'
4
5 6
x = 1 až 5 y = 0 až 5
ortho
ortho
ortho
Cl
Cl
4'
6' 5'
23 2' 3'
4
5 6
Cl
Cl
Cl
3,3’,4,4’,5-pentachlórbifenyl (PCB-126)
(kongenér s najvyššou dioxínovoutoxicitou)
Čo sú to perzistentné organické polutanty (POPs-y)?
Organické látky kontaminujúce životné prostredie, krmivá, potraviny
a živé organizmy; Prenášajú sa vzduchom a vodnými tokmi aj do
veľmi vzdialených oblastí zemegule, napr. Arktídy.
Čo sú to perzistentné organické polutanty (POPs-y)?
OL, ktoré sa len pomaly odbúravajú v ŽP a živých organizmoch
(perzistencia).
OL, ktoré sa kumulujú v tkanivách a orgánoch živých organizmov, vr.
človeka.
Anton Kočan, RECETOX, MU Brno: Analytická
chemie ŽP, podzimní semestr 2016/2017
3
Čo sú to perzistentné organické polutanty (POPs-y)?
OL, ktoré sú toxické pre živé organizmy, vr. človeka aj pri veľmi
nízkych dávkach.
Chlórakné
vľavo:
4 mesiace po
havárii v Sevese
vpravo:
o 5 rokov neskôr
Čo je dioxínová toxicita (1)?
• Látky s dioxínovou toxicitou majú spoločnú vlastnosť, že sa viažu na
vnútrobunkový aryl-hydrokarbónový receptor (AhR) a aktivujú ho.
Čo je dioxínová toxicita (2)?
• Tento komplex sa pohybuje smerom k bunkovému jadru a viaže sa
na špecifickú sekvenciu DNA, tzv. dioxínový odozvový element
(DRE).
i
i
ii
i i
ii TEFPCBTEFPCDFTEFPCDDTEQ i ×+×+×= ∑∑ ∑ == =
12
1
7
1
10
1
][][][
Čo je dioxínová toxicita (3)?
• To spôsobí expresiu asociovaných génov, čo môže byť spúšťačom
toxických prejavov.
• Takto pôsobia najmä 2,3,7,8-chlórsubstituované dioxíny a tzv.
koplanárne PCB. Ich dioxínová toxicita sa však líši medzi
kongenérmi. Vyjadruje sa to k toxickej potencii 2,3,7,8-TCDD tzv.
faktorom ekvivalentnej toxicity (TEF).
• Celková dioxínová toxicita vyjadrená ako tzv. toxický ekvivalent
(TEQ) sa vypočíta:
i
i
ii
i i
ii TEFPCBTEFPCDFTEFPCDDTEQ i ×+×+×= ∑∑ ∑ == =
12
1
7
1
10
1
][][][
Štokholmský dohovor o POPs
(do konca r. 2016 k dohovoru pristúpilo 180 štátov a ratifikovalo 152 štátov)
Cieľom dohovoru je chrániť ľudské zdravie a
životné prostredie pred perzistentnými
organickými polutantmi s konečným cieľom ich
úplnej eliminácie.
Obvyklým spôsobom ako hodnotiť účinnosť
dohovoru je sledovať (monitorovať koncentrácie
POPs uvedených v dohovore vo vybraných
matriciach.
A. Kočan, Slovak Medical University
Pôvodných 12 POPs zahrnutých v ŠD:
1. Aldrin
7. Toxafén
2. Chlórdan
3. Dieldrin
4. Endrin
5. Heptachlór
6. Mirex
8. DDT
9. HCB
10. PCBs
11. Dioxíny
12. Furány
Anton Kočan, RECETOX, MU Brno: Analytická
chemie ŽP, podzimní semestr 2016/2017
4
Ďalšie POPs doplnené do Štokholmského dohovoru:
18. Hexabrómdifenyléter a heptaBDE (komerčný oktaBDE)
15. Chlórdekon
21. Pentachlórbenzén
13. αααα-Hexachlórcyklohexán (HCH)
14. ββββ-HCH
16. Hexabrómbifenyl
20. Lindan (γγγγ-HCH)
23. Perfluóroktánsulfónová kyselina (PFOA), jej soli a perfluóroktánsulfonylfluorid
(PFOS-F)
A. Kočan, Slovak Medical University
25. Technický endosulfan a príbuzné izoméry
17. Hexabrómcyklododekán (HBCD)
19. Hexabrómbutadién
24. Polychlórované naftalény
22. Pentachlórfenol, jeho soli a estery
26. Tetrabrómdifenyléter a pentaBDE (komerčný pentaBDE)
20
Zdroje znečistenia - bodové
- rozptýlené
Transport polutantov v prostredí
Polutanty sú často veľmi toxické a nepodliehajú rýchlej degradácii
(sú perzistentné)
Dochádza k ich transportu a v závislosti na rozdeľovacom
koeficiente n-oktanol/voda (Kow) k:
Biokoncentrácii – príjem a zadržanie látky v organizme výlučne
pobytom vodného živočícha vo vode (dýchanie, príp. prestup
cez kožu) a suchozemského živočícha dýchaním vzduchu
Bioobohacovanie – zvyšovanie koncentrácie látky cez príjem
potravy (predátory majú vyšší obsah polutantov než ich obete)
Bioakumulácia – príjem látky všetkými možnými spôsobmi, t.j.
dýchaním, prestupom cez pokožku a konzumáciou potravy
Prenos POPs-ov ovzduším 138 rokov DDT
1874 Otmar Zeidler publikuje metódu chemickej syntézy DDT.
1,1,1-trichlór-2,2-
-bis(4-chlórfenyl)etán
1939 Paul Herman Müller objavuje
insekticídne vlastnosti DDT.
1943-45 DDT sa využíva počas 2. svet.
vojny na ochranu vojakov a
civilistov proti malárii, týfusu a
ďalších chorôb prenášaných
hmyzom.
1948 Müller získava Nobelovu cenu za medicínu.
138 rokov DDT 1,1,1-trichlór-2,2-
-bis(4-chlórfenyl)etán
1962 Kniha Silent Spring od Rachel
Carsonovej varuje pred
negatívnym pôsobením DDT a
ďalších pesticídov na ŽP.
1967 Orol bielochvostý je vo Švédsku ohrozený vyhynutím v
dôsledku otravy s DDT.
138 rokov DDT
1970. roky Zákaz používania DDT v mnohých štátoch, vrátane
Československa.
1,1,1-trichlór-2,2-
-bis(4-chlórfenyl)etán
2004 Štokholmský dohovor o POPs zakazuje výrobu a
použitie DDT, okrem prípadov, keď je nevyhnutné
chrániť zdravie ľudí pred chorobami prenášanými
hmyzom (napr. malária komármi).
Anton Kočan, RECETOX, MU Brno: Analytická
chemie ŽP, podzimní semestr 2016/2017
5
Spaľovňa tuhého komunálneho odpadu
Bratislava
pred rekonštrukciou
emisie PCDD/F
okolo 70 ng/m3)
Bratislava
po rekonštrukcii v 2004
emisie PCDD/F < 0,1 ng TEQ/m3)
U.S.U.S. SteelSteel Košice (zdroj PCDD/F pri spekaní železnej rudy s koksom)Košice (zdroj PCDD/F pri spekaní železnej rudy s koksom)
Projekt „Štúdium vplyvu vybraných zdrojov dioxínov na kontamináciu
životného prostredia a prenosu do krmív a potravín“, 2006 – 2009
Štyri vybrané oblasti s potenciálnymi zdrojmi dioxínov:
Košice: Produkcia Fe, koksu, spekanie rudy; spaľovňa TKO
Krompachy: Spracovanie sekundárnej medi
Nemecká: Spaľovanie nebezpečného odpadu
Šaľa: Chemická továreň, spaľovanie nebezpečného odpadu
Okolie v. n. Starina bez významného bodového zdroja dioxínov
KovohutyKovohuty KrompachyKrompachy (zdroj PCDD/F pri výrobe medi z druhotných surovín)(zdroj PCDD/F pri výrobe medi z druhotných surovín)
Spaľovanie záhradného a domového odpaduSpaľovanie záhradného a domového odpadu
(zdroj PCDD/F a ďalších POPs)(zdroj PCDD/F a ďalších POPs)
Spaľovanie záhradnéhoSpaľovanie záhradného odpaduodpadu
(zdroj PCDD/F a ďalších POPs)(zdroj PCDD/F a ďalších POPs)
Vypaľovanie trávnychVypaľovanie trávnych porastovporastov
(zdroj PCDD/F a ďalších POPs)(zdroj PCDD/F a ďalších POPs)
Anton Kočan, RECETOX, MU Brno: Analytická
chemie ŽP, podzimní semestr 2016/2017
6
ElektrickéElektrické
transformátorytransformátory
(v minulosti plnené(v minulosti plnené
PCB)PCB)
Silový kondenzátorSilový kondenzátor
plnený PCB (náplň 5,2 kg Deloru 103)plnený PCB (náplň 5,2 kg Deloru 103)
TransformátorTransformátor
Prenos POPs z pôdy a popola do potravinového reťazcaPrenos POPs z pôdy a popola do potravinového reťazca
ObaľovačkaObaľovačka asfaltuasfaltu
KameňolomKameňolom
Príprava bitúmenových zmesí (obaľovanie štrku asfaltom)Príprava bitúmenových zmesí (obaľovanie štrku asfaltom)
(PCB sa používali vo výmenníkoch tepla na roztápanie asfaltu)(PCB sa používali vo výmenníkoch tepla na roztápanie asfaltu)
ChemkoChemko
LaborecLaborec
ChemkoChemko v Strážskom na východnom Slovenskuv Strážskom na východnom Slovensku
(výroba PCB v Československu v r. 1959(výroba PCB v Československu v r. 1959 –– 1984))1984))
NRC-Diox / IPCM
Kontaminované ŽP v okolíKontaminované ŽP v okolí ChemkaChemka
Anton Kočan, RECETOX, MU Brno: Analytická
chemie ŽP, podzimní semestr 2016/2017
7
• definice problému
Kroky kontroly chemického znečištění
životního prostředí
• monitorování s cílem určit rozsah problému
• nalezení optimálního postupu pro kontrolu znečištění
• vyhodnocení stavu a prognóza vývoje kontaminace
• odhad expozice a posouzení rizik pro člověka
• návrh opatření
• vytvoření legislativy pro účinnou kontrolu
• monitorování pro zjištění účinnosti opatření
• široký rozsah koncentrací a vlastností analytů
• monitorování na hladinách blízkých mezi detekce
(stopové a ultrastopové koncentrace analytů, riziko chyb)
• riziko sekundární kontaminace
• nehomogenita vzorků
• nutnost aplikace složitých metod pro izolaci analytů z
matrice
• omezená stabilita analytů a matric
• cena instrumentace, čistých chemikálií, standardů
Specifické problémy environmentální analýzy
• odběr vzorku ‒ konzervace
- transport
- skladování
Obecné schéma analytického postupu
• příprava vzorku ‒ extrakce
- přečištění, odstranění interferentů
- frakcionace
- zakoncentrování
- derivatizace
• analytické stanovení
• interpretace dat
Dlouhodobé pravidelné sledování přesně určených
ukazatelů, důsledně definovaných v prostoru a čase, v
bodech, tvořících síť reprezentující daný region.
Monitoring
Jeho cílem je sledování určitého jevu či parametru v
přesně definovaných časových a prostorových
podmínkách.
Skládá se z pozorování a měření, z hodnocení
existujícího stavu a prognózy do budoucnosti.
• předchází výběr ‒ sledovaných látek
- lokalit
- frekvence, počtu vzorků
- metod
Odběr vzorků
• důraz na kvalitu ‒ reprezentativnost
‒ velikost
‒ stabilitu
• optimální poměr mezi cenou a hodnotou dat
• Kvalitní dokumentace (číslo, jméno vzorku, lokalita,
datum, osoba, místní pozorování a měření,
metody).
Zásady odběru vzorků
• Zachování požadované kvality (inertní kontejner,
rychlý transport a analýza, zmražení vzorků).
Anton Kočan, RECETOX, MU Brno: Analytická
chemie ŽP, podzimní semestr 2016/2017
8
• volné ovzduší ‒ plynné látky (napr. SOx, NOx, COx)
- těkavé látky (např. freóny, benzén, CCl4)
- semitěkavé látky (napr. PAH, PCB, PCDD/F)
- pevné částice (PM10, PM2,5, PM1)
Odběry ovzduší
• ovzduší v místnostech
• pracovní ovzduší
• emise
• imise
odběr plynné fáze do vzorkovnice s pevným objemem – těkavé
(kanystr, vak, plynotěsná stříkačka)
Techniky odběru ovzduší
absorpce plynu v roztoku
(promývačka, filtr
impregnovaný absorpční
kapalinou) - je třeba
kalibrované zařízení na měření
objemu
Techniky odběru ovzduší
záchyt plynů na sorbentech (detekční trubičky s aktivním uhlím,
silikagelem, polymery, denudery - nezachycují aerosol)
Techniky odběru ovzduší
vzorkování pevných částic (vysokoobjemové vzorkovače, odběrové
filtry křemenné a polyuretanové, vzorkování inhalovatelné frakce
< 10 um (PM10), resp. respirabilní frakce < 2,5 um (PM2,5) a < 1 um
(PM1) - kaskádový a cyklónový impaktor, univerzální vzorkovač-
VAPS)
47
Vysokoobjemový vzorkovač
pre POPs-y prítomných v
ovzduší forme tuhých častíc
a v plynnej fáze
Anton Kočan, RECETOX, MU Brno: Analytická
chemie ŽP, podzimní semestr 2016/2017
9
Odber ovzdušia vo VeľkomOdber ovzdušia vo Veľkom GombošiGomboši pri U.S.pri U.S. SteelSteel
HiHi--Vol vzorkovačVol vzorkovač
GPSGPS--11
Meranie atmosferickéhoMeranie atmosferického
tlaku, teploty vzduchu atlaku, teploty vzduchu a
smeru a rýchlosti vetrasmeru a rýchlosti vetra
Techniky odběru ovzduší
pasivní vzorkovače (náplň PUF, XAD živice, semipermeabilní
membrána, extrakční disk EMPORE)
Semipermeabilná membrána
(vyrobená z polyetylénu o nízkej hustote, hrúbky 75 – 90 µµµµm
obvykle tvar vrecúška o dĺžke 91 cm a šírke 2,5 cm
plneného 1 ml trioleínu)
Pasívne
vzorkovače s
PUF pre POPs-y
mokrá (přenášená na zem srážkami, převládá v čistých oblastech)
Atmosférická depozice
mokrá (odběr pouze srážek do automatických jímačů)
Odběr atmosférické depozice
suchá (sedimentací velkých částic atmosférického prachu a vlivem
znečišťujících plynů, převládá ve městech)
suchá (funkce koncentrace složky v ovzduší a rychlosti depozice,
sběrné nádoby)
součet mokré a suché atmosférické depozice (sběrné nádoby,
nálevky)
Anton Kočan, RECETOX, MU Brno: Analytická
chemie ŽP, podzimní semestr 2016/2017
10
srážkové ‒ sběrné nádoby, nálevky
‒ pasivní jímače vody z ovzduší
Vzorkování vod
povrchové ‒ skleněné vzorkovnice
podpovrchové ‒ skleněné vzorkovnice plněné
čerpadlem
Vzorky vod jsou nestabilní, vytěkávají, precipitují,
fotochemicky se rozkládají, mikrobiálně degradují,
snadno se kontaminují.
Je třeba analyzovat co nejrychleji, konzervovat nebo
sorbovat (přenos analytů na tuhý sorbent).
Vzorkovanie sedimentu
nejtěžší matrice na vzorkování
Odběry vzorků půdy a tuhých odpadů
heterogenní materiál, omezená migrace látek
vliv biologické aktivity, srážek, hnojení
používají se rýče, vrtáky, trubkové vzorkovače
nejprve orientační vzorkování, údaje o
heterogenitě
pak odebíráme několik vzorků, které
promícháme
obvykle vzorkujeme do hloubky 15 ‒ 20 cm
(pokud se nezabýváme profilem)
Anton Kočan, RECETOX, MU Brno: Analytická
chemie ŽP, podzimní semestr 2016/2017
11
Čo je ľudský biomonitoring (HBM) ? (1)
HBM je hodnotenie ľudskej expozície chemikáliám prítomným v
ovzduší, vode, pôde, prachu, potravinách a/alebo ďalším
environmentálnym médiam cestou merania týchto chemikálií a
ich metabolitov prítomných v ľudských vzorkách ako sú krv,
mlieko, moč, vlasy, sliny, stolica, tkanivá. Výsledok týchto
meraní sa obvykle nazýva „zaťaženie organizmu“.
HBM je nástroj, ktorý pomáha k lepšiemu pochopeniu ľudskej
expozície k environmentálnym chemikáliám, tak prírodným ako
aj vyrobeným človekom.
Ak sa HBM vykonáva na reprezentatívnej vzorke populácie, napr.
detí alebo dospelých v určitej oblasti, HBM sa môže použiť na
dokumentovanie či takáto podskupina bola exponovaná
niektorým chemikáliám a v akom rozsahu.
A. Kočan, Slovak Medical University
HBM je vedecká technika na hodnotenie ľudskej expozície
environmentálnym polutantom a ich účinkov založená na
vzorkovaní a analýze jednotlivých tkanív a tekutín. Kým krv,
moč, materské mlieko a vydýchnutý vzduch sa analyzujú
najčastejšie, je možné sledovať aj vlasy, nechty, tuk, kosti a
ďalšie tkanivá.
HBM umožňuje zistiť, či environmentálne polutanty, ktoré
prenikli do ľudského organizmu zanechali markery
odzrkadľujúce túto expozíciu. Takýto marker môže byť
samotný polutant alebo jeho rozkladný/metabolický produkt
ale môže to tiež byť nejaká zmena v organizme spôsobená
interakciou polutantu alebo jeho degradačných produktov,
ako sú zmeny v hladinách určitých enzýmov alebo ďalších
proteínov, čo môže viesť k zmenám normálnych telesných
procesov. A. Kočan, Slovak Medical University
Čo je ľudský biomonitoring (HBM) ? (2) HBM je využiteľný na:
posilnenie regulačných opatrení poskytnutím aktuálnych
údajov o chemikáliách dostávajúcich sa do ľudskej
populácie a v akej miere.
zdokonalenie hodnotenia expozície.
určenie východiskových hladín alebo referenčných
rozsahov.
A. Kočan, Slovak Medical University
napomáhanie právu ľudí vedieť aké chemikálie sa
nachádzajú v ich telách.
určenie priorít na riešenie environmentálnych
problémov.
Niektoré faktory ovplyvňujúce HBM (1)
Tukovosť a zloženie materského mlieka sa dramaticky mení
počas prvých týždňov po pôrode, čo tiež vedie ku kolísaniu
hladín POPs. Aby sa potlačili tieto kolísania, odber vzoriek by
sa mal realizovať v určitom čase, napr. 3 – 8 týždňov po
pôrode a po dojčení, pretože obsah tuku je iný na začiatku
dojčenia a iný na jeho konci.
Ak sa odoberie iba málo vzoriek s úzkej skupiny populácie,
môže to viesť k falošným predpokladom, že výsledky sú
platné pre celú populáciu, napr. tak pre mužov ako aj ženy
alebo pre rôzne vekové skupiny.
A. Kočan, Slovak Medical University
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
PCBs HCB pp'-DDE pp'-DDT b-HCH
Men (Michalovce)
Women (Michalovce)
Men (Svidnik+Stropkov)
Women (Svidnik+Stropkov)
ppb, lipid adjusted
Porovnanie hladín niektorých POPs v ženách a mužoch
- Projekt PCBRISK (r. 2001) -
Anton Kočan, RECETOX, MU Brno: Analytická
chemie ŽP, podzimní semestr 2016/2017
12
Mediánové hladiny PCB-153, HCB a p,p’-DDE v krvnom
sére v rôznych vekových skupinách
(vzorky odobraté v r. 2001 v rámci projektu PCBRISK)
1665
1056
718
348
151
90
994
367
364
295
212
109
4262
2485
1967
1361
763
473
60 – 78
50 – 59
40 – 49
30 – 39
17 – 29
8 – 9
Vekovéskupiny
PCB-153
HCB
pp'-DDE
ppb, prepočítané na lipidy
N=434
N=369
N=198
N=708
N=683
N=89
Niektoré faktory ovplyvňujúce HBM (2)
Verí sa, že presnosť chemických analýz vplýva iba málo na celkový
rozptyl výsledkov v nejakom monitorovacom programe, keďže sa
predpokladá, že rozptyl vo vzorkách je oveľa väčší než laboratórna
presnosť.
To je pravda, ak tieto vzorky analyzuje to isté akreditované
laboratórium. Avšak, ak vzorky analyzujú rôzne laboratória, najmä
z rôznou analytickou kvalitou, môže to potlačiť alebo dokonca
znemožniť hodnotenie zmeny hladín, napr. POPs v počas rokov
kedy sa monitoring vykonáva.
To isté môže platiť, ak laboratórium zmenilo metodológiu. Napr. ak
vyriešilo separáciu analytu od rušiaceho kongenéru, čo spôsobilo
pokles stanovených hladín tohto kongenéru.
Rovnako, ak sa vylepší (zníži) medza stanovenia, čo spôsobí, že sa
stanovia analyty, ktoré sa predtým udávali ako nedetegované,
môže to viesť k podobným problémom v závislosti ako sa pracovalo
s výsledkami < LOD.
Odber vzoriek materského mlieka a krvi
Materské mlieko sa odoberá podľa WHO protokolu.
V každom štáte sa musí odobrať najmenej 50 vzoriek. Štáty, ktoré majú >
50 mil. obyvateľov by mali na každý milión nad 50 mil. odobrať najmenej
1 vzorku navyše.
A. Kočan, Slovak Medical University
Matka je prvorodička
Matky, ktoré mohli byť vystavené vysokej expozícii POPs-om (žijúce v okolí
spaľovní odpadu, celulózok, metalurgických závodov alebo kde sa vyrábali
organochlórové chemikálie sú vylúčené z monitoringu, pretože by mohli
skresľovať výsledky.
Krv od matky sa odoberá podľa AMAP protokolu.
Výberové kritériá pre matky:
Vek matky pod 30 rokov
Tak matka aj dieťa musia byť zdravé; tehotenstvo bez problémov.
Matka dojčí iba jedno dieťa (nie dvojičky).
Matka býva oblasti bez prerušenia najmenej 10 rokov.
Odber vzoriek
A. Kočan, Slovak Medical University
Vzorkovanie sa vykonáva medzi 3. až 8. týždňom po pôrode.
Odoberie sa najmenej 50 ml mlieka ručným vytláčaním po dojčení alebo, kým
dieťa pije z druhého prsníka, a tak využiť „let-down“ reflex. Môže sa tiež použiť
vyčistená odsávačka mlieka. Matka môže odoberať mlieko doma. Dostane
podrobné inštrukcie na odber, uskladnenie a transport vzorky a čistú sklenené
nádobu na vzorku s uzáverom.
Vzorka by sa mala odobrať priamo do dodanej sklenenej nádoby. Ak ju matka
odoberá doma, uskladní sa v mrazničke až do odoslania do laboratória. V
chladničke pri 4°C sa môže uskladňovať max. 3 dni. Ak nie je k dispozícii
chladnička pridá sa tabletka K2Cr2O7 na chemickú sterilizáciu mlieka.
• sušení volně na vzduchu nebo lyofilizací
Úprava vzorků půdy před extrakcí
• přesítí přes síto s oky 2 mm (odstranění hrubého písku);
(jíl je < 2 µµµµm)
• mletí nebo rozetření v misce
• subvzorkování pro zachování homogenity
• uchovávání v uzavřených prachovnicích
• chránit před světlem a teplem
Anton Kočan, RECETOX, MU Brno: Analytická
chemie ŽP, podzimní semestr 2016/2017
13
Drvenie, mletie, homogenizácia a preosievanie vzoriek
Čeľusťový drvič Rotačný mlyn Sekací mlyn
Nožový mixér Mažiarový mlyn
Diskový mlynGuľový mlyn
Laboratorné sitáUltrazvukový
homogenizátor
• vzorky s vysokým obsahem vody, nehomogenní,
vyžadují zvláštní úpravu
Odběry sedimentů a odpadních kalů
• odebírá se několik vzorků a promíchá se
• podle hloubky odběru se dá usuzovat na stáří
kontaminace
• používají se drapákové vzorkovače a bagry pro
vzorkování bez vertikální struktury
• tyčové vzorkovače pro vzorkování profilu
• odstranění kamenů a vody (dekantací)
Úprava vzorků sedimentů před extrakcí
• sušení volně na vzduchu nebo lyofilizací
• rozemletí a separace frakce vhodné zrnitosti (< 63 um)
• subvzorkování pro zachování homogenity
• uchovávání v uzavřených prachovnicích
• chránit před světlem a teplem
• pro odstranění síry se přidává prášková měď
• Flóra - sběr, trhání nadzemních částí aspoň 3 cm nad zemí
Odběr biotických vzorků
Vzorky jsou nestabilní, biologicky aktivní, s časem mění
své složení. Chráníme je před vyšší teplotou a světlem,
skladujeme ve vzduchotěsně uzavřených kontejnerech,
zpracujeme co nejdříve.
• Fauna - pasti, sítě, lov, vyhrabávání
• Rostlinné vzorky - usušíme (nejlépe lyofilizací)
- rozetřeme v třecí misce, rozmixujeme
Úprava biotických vzorku před extrakcí
• Živočišné vzorky - lyofilizujeme
- rozmixujeme, homogenizujeme
- vysušíme, např. s Na2SO4
• filtry z odběrových zařízení jsou extrahovány horkým
organickým rozpouštědlem (Soxhlet, Randall,
Twisselman), pomocí ultrazvukové, mikrovlnné,
superkritické, zrychlené tlakové extrakce
Příprava vzorků ovzduší
• čištění vzorků zahrnuje odstranění interferujících látek,
které se extrahují spolu s analytmi (např. působením
H2SO4, alkalického hydroxidu, pomocí gelové permeační
chromatografie)
• frakcionace jednotlivých analytů sloupcovou
kapalinovou chromatografií (silikagel, modifikovaný
silikagel, florisil, aktivní uhlí)
• zakoncentrování
Anton Kočan, RECETOX, MU Brno: Analytická
chemie ŽP, podzimní semestr 2016/2017
14
• Při vysoké koncentraci a čistotě je možná přímá analýza
Příprava vzorků vod
• Extrakce - plynem (statický head space)
- plynem se zkoncentrováním na sorbent
(dynamický head space, purge and trap)
- nemísitelnou kapalinou (LLE) v dělící
nálevce, např. hexanem
- extrakcí na tuhou fázi (SPE, SPME) –
klíčový je výběr extrakčního sorbentu a
elučního rozpouštědla
• Čištění a frakcionace
- jeli potřeba tak podobně jak při
zpracování půd nebo sedimentů
• extrakce horkým organickým rozpouštědlem (Soxhlet,
Randall, Twisselman), pomocí zrychlené tlakové,
ultrazvukové, mikrovlnné, nebo superkritické extrakce
Příprava vzorků půd a sedimentů
• u sedimentů je nezbytné odstranění síry, např.
aktivovanou práškovou mědí
• čištění vzorků od interferujících látek (např. na koloně
plněné silikagelem modifikovaným kyselinou sírovou,
alkalickým hydroxidem, AgNO3)
• frakcionace analytů sloupcovou kapalinovou
chromatografií (oxid hlinitý, florisil, aktivní uhlí)
• zakoncentrování
• extrakce horkým organickým rozpouštědlem (Soxhlet,
Randall, Twisselman), pomocí zrychlené tlakové,
ultrazvukové, mikrovlnné, superkritické extrakce, SPE
Příprava biotických vzorků
• čištění vzorků (např. na koloně plněné silikagelem
modifikovaným kyselinou sírovou, alkalickým
hydroxidem)
• odstranění vysokomolekulárních látek (lipidů) pomocí
gelové permeační chromatografie nebo kyselinou
sírovou
• zakoncentrování
• frakcionace analytů sloupcovou kapalinovou
chromatografií (oxid hlinitý, florisil, aktivní uhlí)
• extrakce horkým organickým rozpouštědlem (Soxhlet,
Randall, Twisselman), pomocí zrychlené tlakové,
ultrazvukové, mikrovlnné, superkritické extrakce, SPE
Příprava biotických vzorků
• čištění vzorků (např. na koloně plněné silikagelem
modifikovaným kyselinou sírovou, alkalickým
hydroxidem)
• odstranění vysokomolekulárních látek (lipidů) pomocí
gelové permeační chromatografie nebo kyselinou
sírovou
• zakoncentrování
• frakcionace analytů sloupcovou kapalinovou
chromatografií (oxid hlinitý, florisil, aktivní uhlí)
Extrakcia toluénom
(PLE/ASE, Soxhlet)
TOLUÉN reverzná
elúcia
PCDD, PCDFPCDD, PCDF
nonnon--ortoorto PCBPCB
13C-dávkov.
štandardy
Kolóna s
oxidom
hlinitým
Kolóna s
aktívnym
uhlím
HRHRGCGC // HRHRMSMS
monomono--
ortoorto PCBPCB
Sediment / pôda
Úprava vzorky
(drvenie, preosiatie, sušenie)
13C-extrakčné
štandardy
Schéma analýzy PCDD, PCDF, dl- a ndl-PCB v sedimente/pôde
DCM:HEX 2:98
DCM:HEX
1:1
ndlndl--PCBPCB
(multi(multi--ortoorto))
Prídavokaktívnej Cu
Silikagél
Silikagél
+
H2SO4
Silikagél
+
KOH
Silikagél
Silikagél
M
u
l
t
i
v
r
s
t
v
o
v
á
k
o
l
ó
n
a
SilikagélSilikagél
++
AgNOAgNO33
Kolóna s Al2O3
(dočistenie ndlPCB
frakcie)
HEXÁN
PowerPrepPowerPrep
Niektoré extrakčné metódy
Anton Kočan, RECETOX, MU Brno: Analytická
chemie ŽP, podzimní semestr 2016/2017
15
Extrakcia typu
kvapalina –
kvapalina (LLE)
mlieka
Vrchná fáza organického
rozpúšťadla (hexán-dietyléter)
obsahuje mliečny tuk a v ňom
rozpustené látky, napr. PCB,
dioxíny, pesticídy
Extrakčný prístroj
podľa
Soxhleta
Twisselmana
(opakovaná extrakcia horúcim
rozpúšťadlom)
Extrakčný prístroj na
zrýchlenú extrakciu podľa
Soxhleta
(extrakcia prebieha niekoľkonásobne
rýchlejšie než klasická extrakcia podľa
Soxhleta, pretože extrakčné patróny sú
vyhrievané)
Extraktor na zrýchlenú kvapalinovú extrakciu od fy Dionex
(ASE 300)
Schéma zrýchlenej kvapalinovej extrakcie (Dionex ASE 300)
Naplnenie patróny
Zaplnenie patróny
rozpúšťadlom (0,5 – 1 min)
Zahriatie a tlakovanie (5)
Statická extrakcia (5)
Výplach patróny novým
rozpúšťadlom (0,5)
Prefúknutie s N2 (1 – 2)
Koniec extrakcie
(celkový čas 17 – 22 min)
2-3x
Extrakčná cela:
• 100 ml
• 34 ml
• 10 ml
smertokurozpúšťadla
filtračný papier
filtračný papier
sediment + Cu
Hydromatrix®
Hydromatrix® :
• prečistená
a preosiata
rozsievková
zemina (kremelina)
• má vynikajúce
sušiace vlastnosti
1 diel Hydromatrixu
= 6 dielov bezv.
Na2SO4
Úprava vzorky
vysušeného sedimentu:
• preosiata cez 63 µm,
príp. 0,2 mm sito
• dosušená
premiešaním s
Hydromatrixom
• premiešaná s
medeným práškom na
odstránenie síry
Príklad zrýchlenej extrakcie zo sedimentu
Cu prášok
Anton Kočan, RECETOX, MU Brno: Analytická
chemie ŽP, podzimní semestr 2016/2017
16
Extraktor na tlakovú kvapalinovú extrakciu (PLE) od fy FMS Extraktor na tlakovú rozpúšťadlovú extrakciu
(PSE) od fy Büchi (SpeedExtractor E-914)
Izolácia PCB a ďalších POPs z krvného séra na tuhej fáze (C18-SPE) H2SO4/silikagélová kolóna používaná na
počiatočné čistenie extraktov
Kolóna plnená
aktívnym uhlím na
frakcionáciu
indikátorových PCB (1.
fr.), dioxínom
podobných PCB (2. fr.)
a PCDD/F (3. frakcia)
Silanizovaná sklená vata
0.5 g Celite 545
1 g AX-21 aktívne uhlie
na Celite 545 (1:19)
0.5 g Celite 545
Silanizovaná sklená vata
Gélová permeačná chromatografia (GLC)
(patrí do skupiny size exclusion chromatography)
kolónakolóna
plnenáplnená
BioBio--BeadsBeads
SS--X3X3
napučanomnapučanom
vv zmesizmesi
EtAcEtAc--hexánhexán
(1:1 v/v)(1:1 v/v)
čerpadločerpadlo
zberzber
frakciífrakcií
zásobníkzásobník
na vzorkyna vzorky
dávkovačdávkovač
Polystyrénový polymér kroslinkovaný prídavkom
divinylbenzénu – množstvo DVB určuje veľkosť pórov
Anton Kočan, RECETOX, MU Brno: Analytická
chemie ŽP, podzimní semestr 2016/2017
17
Automatizovaný systém spracovania vzoriek Power-PrepTM
(konfigurácia pre 2 vzorky)
HH22SOSO44/silikagél/silikagél
KOH/silikagélKOH/silikagél
AgNOAgNO33/silikagél/silikagél
AlAl22OO33 zásaditýzásaditý
Aktívne uhlieAktívne uhlie
Schéma automatizovaného zariadenia na čistenie vzoriek (Power-Prep)
Krok nanesenia
extraktu vzorky na
viacvrstvovú
silikagélovú kolónu
Krok čistenia na
viacvrstvovej
silikagélovej kolóne a
adsorpcii analytov na
kolóne s Al2O3
Schéma automatizovaného zariadenia na čistenie vzoriek (Power-Prep)
Krok elúcie analytov
z kolóny s Al2O3 a
adsorpcii
planárnych zlúčenín
na kolóne s
aktívnym uhlím;
Zachytávanie frakcie
obsahujúcej PCB
(okrem planárnych
non-orto
kongenérov)
Schéma automatizovaného zariadenia na čistenie vzoriek (Power-Prep)
Krok elúcie
planárnych nonorto
PCB a
PCDD/PCDF z
kolóny s aktívnym
uhlím
Schéma automatizovaného zariadenia na čistenie vzoriek (Power-Prep) Koncentrátor TurboVap LV na odfúkanie rozpúšťadla z extraktov
Anton Kočan, RECETOX, MU Brno: Analytická
chemie ŽP, podzimní semestr 2016/2017
18
Koncentrátor na
odfúkavanie
rozpúšťadiel z
eluátov vzoriek
Derivatizácia analytov
Je to proces, ktorým sa pôvodná zlúčenina mení na
zlúčeninu s vlastnosťami vhodnejšími na stanovenie.
V prípade, že sa na analýzu používa plynová chromatografia
tak dôvodom na derivatizáciu je nízka prchavosť analytu,
tepelná nestabilita, sorpcia v injektore, nekvalitná separácia
v kolóne, nízka odozva v detektore.
Ak sa používa GC, základné typy derivatizácie sú:
• Silanizácia – reakcia aktívneho vodíka so zlúčeninami s trialebo
dimetylsilyl skupinou, napr. trimetylchlórsilánom
• Acylácia – zavedenie acylovej skupiny
• Alkylácia – nahradenie kyslého vodíka s alkylovou (metylovou)
skupinou, napr. reakciou s diazometánom (CH2=N+
=N
-
)
pentafluórbenzylbromidom
reakciou, napr.
Kvalitatívna a kvantitatívna analýza organických
polutantov vo vzorkách zo životného prostredia
Rozdelenie podľa princípu merania:
• Bioanalytické metódy (CALUX, ELISA, RIA)
• Fyzikálnochemické metódy (GC/MS, GC/ECD, TLC)
Rozdelenie podľa kvality merania:
• Skríningové metódy (všetky bioanalytické metódy, TLC,
GC/ECD, GC/LRMS
• Konfirmačné metódy (GC/HRMS, GC/MS-MS) − ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), v ktorom sa do
extraktu vzorky pridá špecifická protilátka s už naviazaným značeným
antigénom imobilizovaná napr. na stenách skúmavky. Analyt, t.j.
antigén kompetuje so značeným antigénom. Po krátkej inkubácii sa
vzorka s neviazaným analytom vypláchne. Pridá sa chromogénny
substrát, ktorý vytvára farebný produkt s enzýmom na značenom
antigéne. Intenzita zafarbenia sa meria fotometricky. Platí, čím nižšia
intenzita zafarbenia tým vyššia koncentrácia analytu.
Kvalitatívna a kvantitatívna analýza organických polutantov
vo vzorkách zo životného prostredia (1)
Skríningové bioanalytické metódy
• Imunotesty – sú založené na vysoko špecifickom viazaní určitých
organických zlúčenín (antigénov) na protilátky (antibodies) – princíp
„zámok-kľúč“.
Príklady imunotestov:
− Rádioimmunoassay (RIA), v ktorom do extraktu vzorky pridá
špecifická protilátka s naviazaným rádioaktívnym ligandom. Analyt
kompetuje s týmto ligandom. Po separácii, napr. na filtri sa zmeria
rádioaktivita filtra. Platí, čím nižšia aktivita, tým vyššia koncentrácia
analytu, ktorý vytlačil ligand z protilátky.
Kvalitatívna a kvantitatívna analýza organických polutantov
vo vzorkách zo životného prostredia (2)
Skríningové bioanalytické metódy
− Ah-receptor immunoassay, v ktorom sa do extraktu vzorky na
špeciálnej platničke pridá reakčná zmes obsahujúca Ah-receptor a
nechá sa inkubovať. Zlúčeniny s dioxínovou aktivitou sa naviažu na
AhR a komplex za zachytí na platničke. Zvyšok vzorky sa vypláchne.
Pridá sa protilátka, ktorá zafarbí iba AhR s analytom. Platí, čím vyššia
intenzita zafarbenia, tým vyššia koncentrácia analytu.
• Imunotesty
2,3,7,8-tetrachlórdibenzo-p-dioxín
škodlivina s doteraz najvyššie známou afinitou k arylhydrokarbónovému receptoru
Kvalitatívna a kvantitatívna analýza organických polutantov
vo vzorkách zo životného prostredia (2)
Skríningové bioanalytické metódy
− DR CALUX (Chemical-Activated LUciferase gene eXpression)
Zlúčeniny s dioxínovou toxicitou prenikajú bunečnou membránou a
viažu sa na Ah-receptor, ktorý je spojený s proteínom hsp90. Tento
komplex sa uvoľní a migruje do bunečného jadra. Viaže sa na AhR
jadrový translokátorový proteín (Arnt), ktorý interaguje so
špecifickými sekvenciami DNA, tzv. dioxínovými odozvovými
elementami (DRE). Tým sa indukuje transkripcia určitých génov.
Následne sa produkuje niekoľko proteínov, vč. cytochromu P4501A1.
Výsledkom sú viaceré toxické účinky.
Tento princíp sa využíva v komerčne dostupných biotestoch CALUX.
Využívajú sa potkanie, myšie alebo ľudské rakovinové pečeňové
bunky, ktoré sú geneticky modifikované luciferázovým reportérovým
génom získaným zo svetlušky. Tieto bunky po expozícii dioxínovým
zlúčeninám emitujú svetlo, ktorého intenzita závisí od koncentrácie
týchto látok. Meria sa spektrofotometricky (luminometrom).
• Biotesty – sú založené na interakcii analytu so živou bunkou
Príklad biotestu pre zlúčeniny s dioxínovou toxicitou:
Anton Kočan, RECETOX, MU Brno: Analytická
chemie ŽP, podzimní semestr 2016/2017
19
Kvalitatívna a kvantitatívna analýza organických
polutantov vo vzorkách zo životného prostredia (3)
• Fyzikálno-chemické analytické metódy založené na
chromatografickej separácii zmesí zlúčenín v extrakte a
následnej detekcii a kvantifikácii niektorým z detektorov,
najčastejšie hmotnostnospektrometrickým detektorom.
• Na separáciu pri analýze organických látok v
environmentálnych vzorkách sa v súčasnosti používajú
takmer výhradne separačné metódy založené na
vysokoúčinnej plynovej chromatografii (HRGC) alebo
vysokoúčinnej (vysokotlakej) kvapalinovej
chromatografii (HPLC, UHPLC)
• Tenkovrstvová a papierová chromatografia – používajú
sa na skríningové stanovenie
Princíp chromatografie (1)
• Chromatografia je fyzikálna metóda separácie, pri ktorej sa
využíva rozdielna afinita zložiek v zmesi k dvom navzájom
nemiešateľným fázam.
• Ak sa zlúčeniny separujú podľa veľkosti svojich molekúl –
gélová chromatografia; ak sa na ionexe vymieňajú katióny
alebo anióny – ionexová chromatografia
• Aj je táto afinita daná rozdielnym adsorpčným (adsorpčná
chromatografia) alebo rozdeľovacím koeficientom
(rozdeľovacia chromatografia) separovaných látok medzi
dvoma nemiešateľnými fázami, tj. stacionárnou fázou
(adsorbent alebo viskózna kvapalina) a mobilnou fázou (plyn
alebo kvapalina).
112
Princíp chromatografie (2)
• Separačný proces v súčasných HRGC a UPLC/HPLC sa skladá
s veľkého množstva (až niekoľko stotisíc) jednotlivých
separačných rovnováh, čo znamená, že sú tieto typy
chromatografie najúčinnejšie, a preto najpoužívanejšie v
separácii zložitých zmesí environmentálnych polutantov.
HexaCDF
separované:
modernou kapilárnou kolónou
(SP-2331, 60 m, 0.25 mm vnútorný Ø)
zastaralou náplňovou kolónou
(3% Dexsil 300 on Supelcoport 100/120,
2.4 m, 2 mm vnútorný Ø
Chromatogram
• Je grafickým výstupom z chromatografu, konkrétne z jeho detektora.
• V prípade najčastejšie používanej plynovej chromatografie a
vysokotlakej kvapalinovej chromatografie je to chromatogram
skladajúci sa z elučných vĺn (píkov); Na osi x je retenčný čas a na osi
y intenzita nameraná niektorým z detektorov (FID, ECD, MS, DAD, a i.).
Chromatogram (2)
• Retenčný čas je kvalitatívnym údajom slúžiacim na výpočet retenčných
indexov (napr. Kovatsovho RI) charakterizujúcim separovanú zlúčeninu.
Spolu so šírkou píku sa používajú na výpočet rozlíšenia 2 píkov a počtu
pater pre danú kolónu. Ak sa použije hmotnostná spektrometria ďalším
údajom pre kvalitatívnu analýzu je hmotnostné spektrum alebo pomer
intenzít monitorovaných vybraných iónov zo spektra.
• Kvantitatívnym údajom
je plocha píku.
Kvantifikácia sa
vykonáva porovnaním
plochy s údajmi v
kalibračnej krivke alebo
interným štandardom
pridaným do vzorky
pred jej spracovaním.
tR
t'R = tR - tM
tM
Wh
Wh/2
tM mŕtvy retenčný čas
tR retenčný čas
t'R redukovaný retenčný čas
Anton Kočan, RECETOX, MU Brno: Analytická
chemie ŽP, podzimní semestr 2016/2017
20
A
B
C
D
EVzorka:
Zmes organických látok
rozpustených v rozpúšťadle
(vhodná pre látky, ktoré je
možné odpariť bez toho, aby
sa rozložili)
Plynový chromatogram
0 5 10 15 20
Čas (minúty)
Intenzita
A
B
C
DD
E
Plynový
chromatograf
Plynová chromatografia
GC separácia PCB produktu Aroclor 1242
Datasystém
Termostat
Separačná kolóna
Dávkovací priestor
Detektor
Nosný plyn
Plynový chromatograf
Nosný plyn: He, N2 alebo H2; Prietok: okolo 1 ml/min
Dávkovací priestor: S delením toku, bez delenia toku, s
programovateľnou teplotou, dávkovanie veľkých objemov,
a ďalšie.
Separačná kolóna: V súčasnosti takmer výhradne kapilárna
kolóna, tj. tenká kapilára s kremenného skla s vnút.
priemerom okolo 0,25 mm a dĺžky 30 až 60 m.
GC detektor: Hmotnostnospektrometrický detektor (MSD),
detektor elektrónového záchytu (ECD), plameňovo-ionizačný
detektor (FID), FID s alkalickým kovom (NP-FID), tepelnovodivostný
detektor (TCD). MS je najselektívnejší ale FID a
TCD patria medzi najmenej selektívne, tzv. univerzálne
detektory. ECD je selektívnejší ako FID ale menej selektívny
ako MS
Vhodná pre separáciu organických látok, napr. biologicky aktívnych
látok, liečiv, vitamínov, drog, bielkovín, metabolických produktov,
stereoizomérov, zmesí polárnych látok. Nenahraditeľná na stanovenie
tepelne labilných látok (nie je možné použiť GC).
Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia
(ultravysokoúčinná, vysokotlaková)
Mobilnou fázou je kvapalina, často zmes kvapalín (napr. voda,
metanol, acetonitril, rôzne pufre). Využíva sa gradientová elúcia, t.j.
plynulá zmena koncentrácie zložiek v mobilnej fáze.
Stacionárnou fázou je sorbent, napr. chemicky modifikovaný silikagél,
oxid hlinitý, rôzne polyméry, aktívne uhlie; Veľkosť častíc už od 1,7
um.
Detektory: Hmotnostnospektrometrické (LRMS,MS-MS, TOF), optické
(absorpčný UV/visible, fotometrický, fluorescenčný, refraktometrický,
odparovací detektor rozptylu svetla), elektrochemické (coulometrický,
ampérometrický), vodivostný; MS detektor je najselektívnejší.
Kvapalinový chromatograf
Vysokotlakové
čerpadlo
Analytická kolóna
Riadiaci a vyhodnocovací
počítač
Detektor
Zásobník
elučného
činidla
Filter
Filter
Predkolónový
filter
Viaccestný
ventil
na nástrek
vzorky
Predkolóna
Zásobník
odpadu
Proti-
tlakový
regulátor
− Analytická kolóna má vnútorný priemer
najčastejšie 2,1, 3,0 a 4,6 mm, dĺžku 20 až 250
mm, je umiestnená v termostate, tlak: až 120
MPa
− Semipreparatívna a preparatívna kolóna má
vnútorný priemer 20 až 50 mm, dĺžku 20 až 250
mm, veľkosť častíc 5 až 10 um.
− Predkolóna chráni analytickú kolónu tým, že
zachytáva častice, zlúčeniny viažuce sa
nevratne na stacionárnu fázu analytickej
kolóny, nasycuje mobilnú fázu sorbentom. Je
spravidla plnené rovnakým sorbentom ako
analytická kolóna. Dĺžka do 30 mm.
Kvapalinový chromatograf
v spojení s hmotnostným
spektrometrom
Hmotnostná spektrometria (MS)
Používa sa na identifikáciu tak jednoduchších ako aj zložitých organických
zlúčenín počínajúc prchavými zlúčeninami a končiac peptidmi pomocou
nameraných hmotnostných spektier.
V posledných 30 rokoch sa masovo využíva ako selektívny detektor v plynovej
a kvapalinovej chromatografii v oblasti environmentálnej analýzy, analýzy liečiv,
drog, dopingu, metabolických a degradačných produktov, toxických a
esenciálnych prvkov.
MS je deštruktívny detektor (ako FID), t.zn., zlúčeniny sa počas detekcie
chemicky menia. Medzi nedeštruktívne detektory patria, napr. TCD, UV/VIS
detektor, refraktometrický detektor. V praxi to znamená, že za nedeštruktívnym
detektorom môže byť umiestnený iný detektor.
MS sa najčastejšie používa v režime nízkeho rozlíšenia (LRMS) využívajúc
separáciu iónov napr. kvadrupólovým analyzátorom. Vysokej selektivity a
citlivosti sa dosahuje ak sa odseparovaný vybratý ión z 1. stupňa spektrometra
znova ionizuje a separuje – tento typ MS sa nazýva tandemová MS (MS-MS).
MS patrí medzi vysokocitlivé a selektívne detektory.
Medzi najselektívnejší MS detektor patrí vysokorozlišovací hmotnostný
spektrometer využívajúci separáciu iónov magnetom a fokusáciu elektrickým
poľom. Kvantifikovateľnú odozvu poskytuje už niekoľko fg (10-15 g) v GC píku.
Najmä pri identifikačných analýzach nachádza uplatnenie preletový MS (TimeOf-Flight
MS) a elektrostatické MS (Orbitrap, cyklotrónový rezonančný MS)
Anton Kočan, RECETOX, MU Brno: Analytická
chemie ŽP, podzimní semestr 2016/2017
21
Hmotnostné spektrum
m/z
(pomer hmotnosti a náboja)
Relatívna intenzita (%)
100
Fragmentový ión
Základný pík
Molekulový ión
M+.
[M-X]+.
[M-Y]+.
194
67 109
55
82
42
16513694
40 60 80 100 120 140 160 180 200
Hmotnosť/náboj (Da)
Hmotnostné spektrum
Hmotnostný
spektrometer
Hmotnostná spektrometria
Neznáma látka
Kofeín
M+.
[M+2]+.
[M+4]+.
[M+6]+.
320
[M-Cl]+.
[M-COCl]+.
Horný segment hmotnostného spektra 2378-TCDD
Zoskupenie iónov
vytvorených 4
chlórsubstituentami
4×35Cl
3×35Cl
1×37Cl
2×35Cl
2×37Cl
1×35Cl
3×37Cl
4×37Cl
Identifikácia zlúčenín v GC/MS zázname pôdneho extraktu
pomocou hmotnostných spektier
αααα-HCH
HCB
Porovnanie hmotnostných spektier izomérov hexachlórbifenylov
CCCC llllCCCC llll
CCCC llll
CCCC llll CCCC llll
CCCC llll
CCCC llll CCCC llll
CCCC llll CCCC llll
CCCC llll CCCC llll
Izoméry: Chemické zlúčeniny, ktoré majú rovnaký sumárny vzorec, ale rozdielny
štruktúrny vzorec.
Kongenéry: Chemické zlúčeniny, patria do skupiny látok so spoločnými znakmi. Napr.
2,3,7,8-TCDD je jedným z 210 kongenérov PCDD/PCDF.
Analýza 2,3,7,8-tetrachlórdibenzo-p-dioxínu vo vzorke sedimentu pomocou GC/HRMS
v režime vybraných iónov (SIM, MID) metódou izotopovej zrieďovacej analýzy
Anton Kočan, RECETOX, MU Brno: Analytická
chemie ŽP, podzimní semestr 2016/2017
22
Princíp hmotnostnej spektrometrie
• Na vzdialenej skale je váza, na ktorej je niečo namaľované, ale nedá za rozoznať, čo to je – paralela s neznámou
zlúčeninou vo vzorke
• Pozorovateľ má iba pušku; Úlomky z vázy zasiahnutej projektilom sa rozsypú po okolí – paralela s bombardovaním
molekuly elektrónmi v iónovom zdroji hmotnostného spektrometra
• Úlomky sa poskladajú, a tak sa zistí, čo bolo na váze namaľované – paralela s hmotnostným spektrom a jeho
vyhodnotením
•Elektrónová ionizácia (EI)
•Chemická ionizácia (CI)
•Elektrosprej (ESI)
•Bombardovanie rýchlymi atómmi (FAB)
•Laserová ionizácia (LIMS)
•Rezonančnáionizácia (RIMS)
•ˇTermická ionizácia (TIMS)
•Ionizácia plazmovou desorpciou (PD)
•Matrix-assistedlaser desorption ionization (MALDI)
Iónový
zdroj
Hmotnostný
analyzátor
Detektor
iónov
Vákuové čerpadlá
(rotačnévývevy
+ turbopumpy)
Vstup
Vstup vzorky
Datasystém
Výstup dát
Hmotnostný spektrometer
• Všetky MS systémy sa skladajú z týchto častí:
Ionizácia, separácia iónov
a ich detekcia
Prebiehajú vo vákuu
(~ 10-4 – 10-6 Pa)
•Elektrónový násobič
•Fotonásobič
•Magnetickýsektor
•Kvadrupól
•Iónová pasca
•Preletový
•Ión-cyklotrónová rezonanacia
•GC
•LC
•Priamy vstup
Schéma elektrónovej ionizácie
Iónový zdroj
Molekuly napr. vody
elektróny
Magnetický sektorový hmotnostný analyzátor
Detektor iónov
ElektromagnetyElektromagnety
Iónový zdroj
Dráha
nedetegovaných iónov
s nižšou hmotnosťou
(m/z)
Dráha
detegovaných
iónov
Dráha
nedetegovaných iónov
s vyššou hmotnosťou
(m/z)
Detektor iónov
Iónový zdroj
+
_
_
Prívody jednosmerného
a rádiofrekvenčného napätia
Rezonujúci ión
Nerezonujúci ión
+
Kvadrupólový hmotnostný analyzátor Hmotnostný spektrometer s iónovou pascou
Anton Kočan, RECETOX, MU Brno: Analytická
chemie ŽP, podzimní semestr 2016/2017
23
Preletový hmotnostný spektrometer (TOFMS)
Urýchľovanie iónov v pulzoch
Vstup
vzorky
Detektor iónov
Vákuum Meranie času
Ionizačná
komôrka
Preletová trubica
Ťažšie
ióny
Ľahšie
ióny
Lineárny TOFMS
Iónový zdroj s urýchľovaním
iónov v pulzoch
Detektor iónov
Reflektrón
Reflektrónový
TOFMS
Hmotnostný spektrograf podľa Astona z r. 1919/20 Vysokorozlišovací hmotnostný spektrometer z r. 2000
SektorovýSektorový vysokorozlišovacívysokorozlišovací
hmotnostný spektrometerhmotnostný spektrometer
(HRMS) s dvomi plynovými(HRMS) s dvomi plynovými
chromatografmichromatografmi
Tandemový hmotnostný spektrometer (MSTandemový hmotnostný spektrometer (MS--MS)MS)
s vysokoúčinným kvapalinovýms vysokoúčinným kvapalinovým chromatografomchromatografom
Tandemové hmotnostné spektrometre (MSTandemové hmotnostné spektrometre (MS--MS)MS)
s plynovýmis plynovými chromatografmichromatografmi
Hmotnostný spektrometer s indukčne viazanouHmotnostný spektrometer s indukčne viazanou
plazmou (ICPplazmou (ICP--MS) na analýzu kovov aMS) na analýzu kovov a polokovovpolokovov
Základy správnej laboratórnej praxe (GLP, QA/QC)
• Výsledky analýz môžu mať značné spoločenské a ekonomické
dôsledky, môžu ovplyvňovať závažné rozhodnutia.
• Môžu vznikať pochybnosti o vierohodnosti údajov.
• Laboratórium musí vedieť spätne preukázať, ako bola vzorka
analyzovaná, prípadne odobratá.
• Laboratórium musí v pravidelných intervaloch overovať kvalitu
vykonávaných analýz, a to analýzou vzoriek na slepý pokus
(blanks), certifikovaných referenčných materiálov (CRM) alebo
aspoň referenčných materiálov (RM), zúčastňovaním sa v testoch
spôsobilosti (proficiency tests, interlaboratory studies, round robin
tests).
• Analytické laboratórium by malo byť akreditované ako skúšobné
laboratórium podľa normy ISO/IEC 17025. To ho bude zaväzovať na
vedenie potrebnej laboratórnej dokumentácie, validovanie
analytických metód, overovanie kvality svojich výsledkov, správnu
manipuláciu zo vzorkami a odpadom z analýz, zvyšovanie
kvalifikácie personálu, atď. Akreditované laboratórium sa musí v
pravidelných intervaloch podrobiť interným a externým auditom.
Anton Kočan, RECETOX, MU Brno: Analytická
chemie ŽP, podzimní semestr 2016/2017
24
Výsledky testu způsobilosti pro stanovení PCDD/F, dioxínům podobných
PCB a indikátorových PCB ve vepřové klobáse a sádle
(organizované Referenční laboratoří EU pro dioxiny a PCB v potravinách a krmivech v r. 2012)
−0.2
(z-skóre pro RECETOX)
RECETOX value: 1.40 pg/g fat
• Maso vysušeno s bezvodým Na2SO4
• Soxhletova extrakce n-hexanem
• K tuku přidané13C12-lznačené kongenery
• Čištění s H2SO4/na silikagelu, KOH na
silikagelu, aktivním uhlí
• GC separace na 60m koloně DB5-MS
• Kvantifikace pomocí HRMS (rozlišení
10000)
Pojmy popisující nejistotný přístup k měření
v analytické chemii
Preciznost: Těsnost shody mezi naměřenými koncentracemi získanými
opakovanými měřeními na stejném vzorku(precission)
Pravdivost: Těsnost shody mezi aritmetickým průměrem nekonečného počtu
opakovaně naměřených koncentrací a referenční hodnotou(trueness)
Přesnost: Těsnost shody mezi naměřenou koncentrací a skutečnou
koncentrací(accuracy)
Zvyšovanie precíznosti
Systematická
chyba merania
Príklad realizácie systému kvality v analytickom
laboratóriu využívajúcom plynovú chromatografiu
• Údržba meracích zariadení sa vykonáva podľa plánu údržby.
• Kalibračné krivky sa tvoria najmenej z 5 koncentračných úrovní v
lineárnej oblasti detektora.
• Stabilita kalibračnej krivky sa kontroluje denne kalibračným
štandardom so strednou koncentráciou.
• V sade nie viac než 10 vzoriek sa analyzuje aj vzorka na slepý pokus
(SP) a vzorka referenčného materiálu.
• Koncentrácia analytu v slepom pokuse nesmie prekročiť hodnotu
predpísanú v štandardnom operačnom postupe (SOP) alebo v norme
(oficiálnej metóde) – spravidla je to < 1/10.
• Výsledky meraní najčastejšie CRM alebo RM sa vnášajú do
(Shewhartovho) regulačného diagramu; Musia spĺňať požiadavky
dané metódou, t.j. precíznosť (napr. relatívna smerodajná odchýlka <
15%) a pravdivosť (napr. v intervale ± 20% od referenčnej hodnoty)
• Dokumentácia týkajúca sa analýzy sa archivuje (napr. 5 rokov) –
protokoly z odberov a spracovania vzoriek, GC/MS chromatogramy
kalibračných roztokov, SP, RM a vzoriek, parametre GC/MS meraní
Shewhartove regulačné diagramy
a kvalita analytických meraní
• Snahou je udržať merací proces v štatisticky zvládnutom stave, aby sa
zabezpečila požadovaná zhoda výsledkov
• Konkrétne pri stanovení PCDD/PCDF a dioxínom podobných PCB v
potravinách a krmivách sa za účelom úradnej kontroly podľa nariadení
(ES) č. 1883/2006 a č. 152/2009 požaduje, aby v koncentračnej oblasti
maximálnych limitov bola relatívna chyba merania, ktorá vyjadruje
pravdivosť merania ≤ 20 % a relatívna smerodajná odchýlka (RSD),
ktorá vyjadruje precíznosť merania < 15 %.
• Regulačný diagram obsahuje centrálnu priamku (CL) rovnobežnú s
osou x; Hodnota y predstavuje referenčnú hodnotu, napr. priemer
meraní, koncentráciu v RM, atď.
• Hranice reg. diagramu môžu predstavovať priamky vzdialené od CL o
hodnotu 3s na každú stranu (je pravdepodobné, že 99,7 % hodnôt sa
bude nachádzať medzi dolnou [LCL] a hornou [URL] reg. medzou ); Je
vhodné zakresliť aj tzv. výstražné medze pri hodnote ± 2s (~ 68 %
hodnôt v intervale)
• Pre analytické stanovenia má vedenie reg. diagramov prínos v tom, že
manažér kvality dostáva rýchlu informáciu o stave kvality meraní
Regulačný diagram precíznosti stanovenia TEQPCDD/PCDF
v referenčnom materiáli
(slnečnicový olej s prídavkom 17-ich štandardov) za obdobie 2001–2009
2.3
2.4
2.5
2.6
2.7
2.8
2.9
3.0
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3.8
3.9
4.0
4.1
4.2
4.3
4.4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
Referenčná hodnota + 20 %
pg/g tuku
Referenčná hodnota – 20 %
Refer. hodnota
Rozšírená neistota Ue,k=2 = 18.9 %RSD = 9,5 % (podmienka: < 15 %)
Definice některých pojmů v analytické chemii
Analyt (Analyte)
Konkrétní sloučenina, prvek, ion, funkční skupina, nebo jejich kombinace ve
vzorku, jehož přítomnost nebo množství je určováno metodami analytické
chemie
Vzorek (Sample) Část materiálu vybraná z jeho většího množství
Vzorkování
(Sampling)
Činnosti související s přípravou a zpracováním plánu vzorkování, s vlastním
odběrem vzorku a dalším nakládáním se vzorkem a činnosti související se
zpracováním příslušné dokumentace
Plán vzorkování
(Sampling plan)
Předem stanovený postup pro výběr, odběr, úpravu na místě, dopravu a
přípravu dílčích vzorků nebo vzorků, které budou odebrány ze základního
souboru jako vzorek
Bod odběru
(Sampling point)
Pozice, ze které je vzorek odebrán, definovaná jednoznačně a nezaměnitelně
prostorovými a časovými souřadnicemi
Protokol o odběru
vzorku
(Sampling protocol)
Dokument obsahující všechny potřebné informace o
místě, způsobu provedení odběru vzorku a jeho
dalším zpracování
Mez detekce
(Limit of detection, LOD)
Naměřená hodnota analytu, který je přítomen ve vzorku s pravděpodobností
β, přičemž pravděpodobnost jeho nepřítomnosti je α
Mez stanovitelnosti
(Limit of quantification,
LOQ)
Nejnižší množství analytu ve vzorku, které jsme schopni stanovit jako exaktní
hodnotu se stanovenou nejistotou
Nejistota měření
(Measurement uncertainity)
Při výpočtu nejistoty se může vycházet ze statistické analýzy série
opakovaných měření např. CRM (nejistota typu A) a/nebo příspěvku
deklarovaných nebo odhadnutých nejistot z jednotlivých složek analýzy
(nejistota typu B)
Vytěžnost (Recovery)
Podíl stanoveného množství analytu nebo jeho ekvivalentu ve vzorku po jeho
zpracování (extrakce, čištění) k množství této látky přidané ke vzorku před
jeho zpracováním
Anton Kočan, RECETOX, MU Brno: Analytická
chemie ŽP, podzimní semestr 2016/2017
25
Štandardný operačný postup v analytickom laboratóriu
• SOP je súbor písomných inštrukcií, ktoré popisujú rutinnú alebo
opakujúcu sa činnosť v analytickom laboratóriu.
• Účelom SOP je, aby sa činnosti vykonávali správne a vždy
rovnakým spôsobom. SOP sú neoddeliteľnou súčasťou systému
kvality v analytickom laboratóriu.
• Technický SOP stručným a jasným spôsobom zrozumiteľným pre
pracovníka so znalosťami práce v laboratóriu popisuje ako
realizovať určitý analytický postup. SOP môže popisovať kompletný
analytický postup, t.j. od úpravy vzorky pred extrakciou, extrakciu,
čistenie, frakcionáciu, zakoncentrovanie, separáciu pomocou GC,
detekciu pomocou MS, vyhodnotenie GC/MS záznamov a výpočet
koncentrácií analytov. Pre každý z uvedených krokov však môže
existovať samostatný SOP a na výkon analýzy sa potom použije
súbor vybraných SOP.
• Technický SOP môže obsahovať tieto časti: (a) Názov, (b) účel a
oblasť použitia, (c) zhrnutie metódy, (d) rušenie analýzy, (e)
bezpečnostné opatrenia, (f) zariadenia a materiál, (g) chemikálie, (f)
odber vzoriek, manipulácia a uskladnenie, (g) kontrola kvality (SP,
RM), (h) postup spracovania vzorky, (i) postup stanovenia, napr.
GC/MS.