Souhrn 4. přednášky
• Genetické metody
– Plasmidy (kvasinkové elementy)
– Integrace (plasmidy, PCR, kazety)
– Teplotně-sensitivní mutanty (esenciálních genů)
– Tetrádová analýza
– Syntetická letalita, epistase, suprese
Pomocí těchto genetických metod byly analyzovány metabolické dráhy, proteinové
komplexy, evoluce biologických systémů … připravovány nové kmeny pro
biotechnologie … řešeny otázky týkající se zdraví člověka
Osnova 5. přednášky
• Genetické metody
– tetrádová analýza
– syntetická letalita, epistase, suprese
– mutageneze/“screen“
• Buněčný cyklus
– průběh a regulace BC
– synchronizace buněk
– mechanismy regulace párování
– homothalické kmeny
Životní cyklus kvasinek
- Deleci či mutaci lze provést v
haploidní či diploidní buňce
- v haploidní buňce hrozí suprese
defektu proto je lépe používat
diploidní buňky (druhá kopie zůstává
nezměněná)
- lze připravit dvojitého mutanta
křížením haploidních mutant a poté
sporulací diploida
- pouzdro spory je třeba rozrušit a
pomocí mikromanipulátoru získat
jednotlivé haploidní buňky (lze
provést i tzv. random sporulation)
- u S.pombe jsou diploidní buňky
nestálé a okamžitě sporulují
(pouzdro se rozpadá samo)
S. cerevisiae
neesenciálnígen
Tetrádová analýza
YPD
Selektivní médium
(SD-ura ... testy)
segregace 2:2
Mendlovy zákony
AAaa
AaAa
AaAa
.
.
+
A a
esenciální gen
A a a A
a A a A
A A a a
integrace
křížení
haploidní buňky
1 gen
vřecko
4 spory
Tetrádová analýza
YPD
Selektivní médium
(SD-ura ... testy)
segregace 2:2
Mendlovy zákony
AAaa
AaAa
AaAa
.
.
.
+
A a
aB Ab AB ab
ab Ab aB AB
Ab aB ab AB
+
Ab aB
AB
Ab
aB
ab
kombinace těchto
mutací je synteticky
letální
křížení
haploidní buňky
1 gen
křížení
haploidní buňky
2 geny
Analýza genetických interakcí
(funkčních vztahů)
Dvojité mutanty – funkční příbuznost
haploid x haploid => diploid – stejný fenotyp - identický gen
- bez fenotypu – díky wt alele (různé geny)
sporulace => haploid – stejný fenotyp – epistatický (funkčně příbuzné geny)
- aditivní až letální (paralelní dráha, redundance, rozpad
komplexu)
A
b
C
D
e
F
A
B E
A
b
c
D
E
F
Mutageneze pomocí hydroxylaminu … hledání (screening) letálního mutanta –
mutageneze kmene s vypínatelným plasmidem (promotor nebo FOA – viz
plasmid shuffling)
Epistatický Letální
D
C
F
Proteinový
komplex
nádorové buňky mají často mutované geny pro opravu DNA – inhibitor vyřadí další dráhu
Syntetická letalita
Supresory
Supresory potlačují původní fenotyp – mutace téhož genu „napraví“ původní mutaci
- mutace sousedního (protein) zesílí oslabenou
interakci
- nadprodukce proteinu z paralelní dráhy
- nadprodukce proteinu z téže dráhy
A
b
C
D
E
A
b
C
D
E
F
F
A
E
D
C
FF
B E
Proteinový
komplex
Forsburg, NRG, 2001
Supresory
Pomocí těchto genetických metod (SL, suprese) byly analyzovány metabolické dráhy,
proteinové komplexy, evoluce biologických systémů … připravovány nové kmeny pro
biotechnologie … řešeny otázky týkající se zdraví člověka
• Studium metabolických drah (URA, GAL …)
• … flokulace, aglutinace (FLO, AGA …)
• … sekrece, endocytózy, morfogeneze (SEC, END … ORB)
• … mechanismu párování (STE …)
• … vlivu záření na buňky … rad mutanty (např. RAD21,
RAD50, RAD51)
• … buněčného cyklu (CDC …)
ředící řada
WT
Mut1
Mut2
rad51
mut
γ-záření
(budova A3)
sec
mutanty
• Studium metabolických drah (URA, GAL …)
• … flokulace, aglutinace (FLO, AGA …)
• … sekrece, endocytózy, morfogeneze (SEC, END … ORB)
• … mechanismu párování (STE …)
• … vlivu záření na buňky … rad mutanty (např. RAD21,
RAD50, RAD51)
• … buněčného cyklu (CDC …)
Allele Reverts? Notes Molecular descriptiona Reference
ade2-101 yes
ochre mutation, red
colonies
G to T transversion at nucleotide
190, changing amino acid 64 from
a Glu to a STOP
Gai and Voytas, 2005
his3-200 no
Cold sensitive; high
frequency of petite
formation, especially
during transformation.
1 kb deletion, (-205 to 835)
Struhl 1985; Fasullo and Davis
1988
leu2-3,112 no double mutant
GTT-to-GCT missense change at
codon 69,
G insertion at nucleotide 249,
G insertion at nucleotide 792,
GAC-to-AAC missense change at
codon 300.
Hinnen et al. 1978;
Gaber and Culbertson 1982;
trp1-1 yes amber mutation
GAG-to-TAG amber (STOP)
nonsense change at codon 83
McDonald, et al. 1997
Křížení – ověření - jedna mutace, meioticky defekt
- rozdělení do komplementačních skupin (allelická kompl.)
Kontrola závislosti
na plasmidu na
FOA plotnách
Ověření pravosti (mutant+delece)
X supresor na plasmidu
Izolace mutant
Počet mutací
dnes - NGS
ura, ade, rad …
PCR genom
sekvenace
Verde, Mata, Nurse, JCB, 1995
- mutagenese S. pombe – hledání ts mutant (55 000 kolonii) s defektní morfologií –
našli 64 kmenů (3 druhy defektu: 51 kulatých=orb, 8 tip elongation aberrant=tea, 5
banana=ban)
- z 51 orb mutant křížených s WT segregovalo 43 v poměru 2:2 tj. jeden gen (8
sterilních), „linkage analysis“ mezi mutantami ukázala 12 orb genů (skupin – Tab.I)
... aktinový cytoskelet (polarizovaný růstu)
Nobelova cena za výzkum
buněčného cyklu v roce 2001
Leland Hartwell začal studovat buněčný cyklus v 60.letech na S. cerevisiae.
Podařilo se mu izolovat kvasinky, které měly mutovaný gen kontrolující buněčný
cyklus (BC). V následujících letech identifikoval podobným způsobem více než 100
genů kontrolujících buněčný cyklus (např. CDC28). Také sledoval citlivost kvasinek
na poškození DNA radiací. Zjistil, že BC je při poškození DNA zastaven – aby získal
čas na opravu DNA
Paul Nurse studoval buněčný cyklus na S. pombe. V 70. letech objevil gen cdc2,
který je zodpovědný za regulaci většiny fází BC. V roce 1987 izoloval homologní
lidský gen a nazval jej CDK1 (cyclin dependent kinase).
Tim Hunt na začátku 80. let objevil první cyklin – cykliny jsou proteiny, které jsou
syntetizovány a odbourávány (ubikvitinace) během určité části buněčného cyklu.
Cykliny se váží na CDK a regulují jejich aktivitu.
Nobelova cena za výzkum
buněčného cyklu v roce 2001
Leland Hartwell začal studovat buněčný cyklus v 60.letech na S. cerevisiae.
Podařilo se mu izolovat kvasinky, které měly mutovaný gen kontrolující buněčný
cyklus (BC). V následujících letech identifikoval podobným způsobem více než 100
genů kontrolujících buněčný cyklus (např. CDC28). Také sledoval citlivost kvasinek
na poškození DNA radiací. Zjistil, že BC je při poškození DNA zastaven – aby získal
čas na opravu DNA
Paul Nurse studoval buněčný cyklus na S. pombe. V 70. letech objevil gen cdc2,
který je zodpovědný za regulaci většiny fází BC. V roce 1987 izoloval homologní
lidský gen a nazval jej CDK1 (cyclin dependent kinase).
Tim Hunt na začátku 80. let objevil první cyklin – cykliny jsou proteiny, které jsou
syntetizovány a odbourávány (ubikvitinace) během určité části buněčného cyklu.
Cykliny se váží na CDK a regulují jejich aktivitu.
Nurse et al, MGG, 1976
Buněčný cyklus S. pombe
- nestálé diploidní buňky vstupují do meiosy hned po konjugaci (ade6-M210xade6-M216)
- pro konjugaci je kritická G1 fáze jako u S. cerevisiae
S.pombe má rovnocenné dělení - vznikají buňky stejné velikosti – hned
vstupují do S fáze (jsou dostatečně velké) – pro vstup do mitozy musí být
dvojnásobná velikost (kontrola v G2 fázi => nejdelší je G2 fáze)
Buněčný cyklus S. cerevisiae
- zahájení tvorby pupene a duplikace SPB – začátek S fáze
- rozchod jaderných plaků na opačné póly – přechod z S do G2 fáze
- jádro se protahuje – začátek M fáze (mitózy) - mikrotubuly
- oddělení pupene – cytokineze – přechod z M do G1
- Oddělená dceřinná buňka je menší než mateřská – nerovnocenné dělení–
pro další dělení musí dosáhnout určité velikosti => dlouhá G1 fáze
Curr Opin Gen Dev 5 (1995)
• Generovali teplotně-citlivé mutanty, z kterých vybírali kmeny
zastavující v určité fázi buněčného cyklu (cdc = „cell division
cycle“ mutanty)
• Výběr dle morfologických (diagnostických) znaků
charakteristických pro určitou fázi buněčného cyklu
Mikrotubuly
(nocodazol)
Klíčovým mezníkem BC u S. cerevisiae je START, kdy se rozhoduje o přechodu z
G1 do S fáze:
- pro další dělení musí buňka v G1 fázi dosáhnout určité velikosti
- při nedostatku živin arestuje v G1 nebo posléze přechází do stacionární fáze
(vyčerpání živin)
- nedostatek dusíku – růst pseudohyf
- při nedostatku N a C (diploidní buňky) zastavují v G1 a zahajují sporulaci
- haploidní buňky v přítomnosti partnera zastavují v G1 fázi a konjugují
Shlukování
- párování
- morfologie kolonii
Granek and Magwene, PLoS Genet (2010)
Klíčovým mezníkem BC u S. cerevisiae je START, kdy se rozhoduje o přechodu z
G1 do S fáze:
- STARTovní interval lze rozdělit na úsek A a B
- v úseku A se rozhoduje o přechodu do stacionární fáze (mutanty zastavené v této
fázi nemohou konjugovat)
- v úseku A hrají roli CDC25 a CDC35 (komponenty RAS dráhy - živiny)
- v úseku B se rozhoduje o konjugaci či sporulaci (zastavení pomocí alfa-faktoru,
nemůže být zvolena alternativa přechodu do stacionární fáze)
-pro úsek B (a další „checkpoints“) je klíčový CDC28 (tj. CDK1) a příslušné cykliny
A B
CDC28 a cykliny u S. cerevisiae
Interakce fosforylované Cdc28p s cyklinem vzniká aktivní komplex:
- v G1 fázi Cln1p a Cln2p (CLN3 mRNA je konstantní)
- pro vstup do S fáze jsou nutné Clb5p a Clb6p (transkripce stimulovaná CLN)
- zahájení mitózy se účastní Clb3p a Clb4p
- mitózu ukončují Clb1p a Clb2p a jejich degradace
Nasmyth, Trends in Gen, 1998
Buněčný cyklus S. cerevisiae - detail
- další CDC
- fosforylace
- ubiquitylace
Checkpoints slouží buňce ke kontrole úplnosti či správnosti průběhu určité části
buněčného cyklu či procesu – např. buňka nemůže nechat neopravené
dvouřetězcové zlomy DNA nebo jiná poškození DNA (podle fáze buněčného cyklu
opravuje různými mechanismy)
Kolodner et al, Science (2002)
Synchronizace S. cerevisiae buněk
- v úseku A jsou buňky „nedorostlé“ – elutriace (centrifugace dle velikosti buněk) –
tzv. G0 synchronizace
- v úseku B se rozhoduje o konjugaci - za přítomnosti alfa-faktoru (krátký syntetický
peptid) dochází k zastavení buněčného cyklu – G1 synchronizace
- HU inhibuje syntézu nukleotidů potřebných pro replikaci – synchronizace v S fázi
- nocodazol blokuje polymeraci tubulinu – schází mikrotubuly pro mitózu – G2
synchronizace
- ts mutanty různých CDC genů – různé fáze buněčného cyklu
G1-A
G1-B G1
Párování S. cerevisiae
Diploid
Fůze
jader
konjugace
Chant, Curr Opin in Cell Biol, 1996
Vybudování buněčné stěny přemosťující „shmoo“ výběžky
Funkce jednotlivých proteinů v průběhu párování/matingu
Ren et al., Science, 2000
KAR1
STE = sterile
Signální dráha – α faktor
Wang et al., Nature, 2004
Cdc28
Zastavení buněčného cyklu
Aktivace transkripce
Morfologické změny (aktin)
Ren et al., Science, 2000
ChIP on CHIP - Ste12p transkripční
faktor (indukované geny)
Regulace transkripce v haploidních buňkách
(konstitutivní)
a1, a2 + α1, α2 - transkripční faktory, které ovlivňují transkripci 3 skupin genů
a-spec.= MFA1,2 (a-feromon), STE2 (α-receptor), STE6, 14 (úprava a sekrece feromonu)
α-spec.= MFα1,2 (α-feromon), STE3 (a-receptor), STE13, KEX2 (proteasy)
haploid spec.= STE4,18 (podjednotky G-proteinu), RME1 (inhibitor meiosy), HO, NEJ1, LIF1
aSG ON
αSG OFF
haploid SG ON
MAT lokus Typ buňky Geny kontrolované MAT lokusem
a haploida1, a2
α haploidα1, α2 aSG OFF
αSG ON
haploid SG ON
α2
α1
diploidα1, α2
a1, a2
aSG OFF
αSG OFF
haploid SG OFF
α2
α1
α2a1
Lee a Haber, Microbiol Spect, 2015
Chromosom III obsahuje:
- MAT lokus
- MAT a (HMR) kazeta
- MAT α (HML) kazeta
HML a HMR jsou tiché
alely (heterochromatin)
Co a1, a2 + α1, α2
kódují? (transkripční
faktory)
HO endonukleasa –
výměna kazet v MAT
lokusu (rozeznává
specifické sekvence)
Heterothalické – stabilní
Homothalické – přepínají
párovací typ
Chromosom III
Přepínaní párovacího typu
HMLα HMRa
MAT
CEN
Chromosom III
umlčená kopie umlčená kopie
HO endonukleasa rozeznává a štípe specifické sekvence
Používá se pro vygenerování DSB a studium mechanismů opravy poškozené DNA
LeeaHaber,MicrobiolSpect,2015
Přepínání párovacího typu
DNA z MAT lokusu je HO endonukleasou vystřižena a na její místo se překopíruje
sekvence z kazety opačného páru
- HO endonukleasa je exprimována pouze v mateřské buňce v G1 fázi (dceřinná si
uchová původní typ)
Current Opinion in Cell Biol 8 (1996)
homotalické
Asymetrická lokalizace Ash1p
Current Opinion in Cell Biol 8 (1996)
-Ash1p represor je
asymetricky lokalizován do
dceřiné buňky, kde blokuje
transkripci HO-
endonukleasy
- Není do ní sekretován,
ale dochází k expresi
(translaci) asymetricky
lokalizované mRNA
- (translace RNA na
specializovaných
ribozomech asociovaných
s cytoskeletem