Osnova 4. přednášky • Genetické metody - Plasmidy - Integrace - Teplotně-sensitivní mutanty - Tetrádová analýza - Syntetická letalita, suprese Výhody kvasinkového modelu Rychle se množící EUKARYOTNÍ mikroorganismy (90 min/dělení, 25-30°C) Vytváří kolonie na plotnách - mikrobiologické metody (otiskování ploten, kapkovací test =>toxiny v plotnách - HU, MMS ...) Stabilní haploidní i diploidní formy Haploidní buňky lze křížit na diploidní (heterozygotní mutanty) Diploidní buňky lze sporulovat a využít pro genetickou analýzu (tetrádová analýza) Lze transformovat DNA (plasmidy i lineární) Centromerické a multicopy plasmidy Vysoká frekvence homologní rekombinace (lineární DNA) Lze připravovat deleční a mutantní kmeny Vydrží v >15% glycerolu na -70°C „indefinitely" Techniky barvení (např. aktinový cytoskelet = phaloidin, buněčná stěna =\ + GFP in vivo) Techniky synchronizace buněk S.c. má kompaktní genom - knihovny s genomovou DNA (ne cDNA) Kompletně osekvenovaný genom (genomové aplikace) EuroFan projekt - delece všech S.c. genů (+GFP, +2-hybrid) Mikročipy - expresní profily za různých podmínek Řada životních dějů má analogii v procesech v savčích buňkách (lidské geny testovány v kvasinkách - nemoci, metabolismus, regulační mechanismy) Nevýhoda - malé buňky, malé organely (např. nejsou vidět chromosomy - SMC) Chromosom III (nejmenší) CEN, ARS, TEL, Ty1-5 obsahuje MAT lokus Nomenklatura pro S.c. YCRXXw: Y=yeast C= 3. Chromosom R= pravé raménko XX=pořadové číslo w/c=Watson/Crick LEU2-gen Leu2p - protein leu2A - delece Ieu2-1 - mutace (identifikační číslo alely) LEU2-HIS3- inzerce HIS3 genu v lokusu LEU2 Forsburg: NRG, 2001 Baudat a Nicolas, PNAS, 75 w 74\v TSw TyS-1 i i ^O'c S9w 68c i j?vf HMLaS i tt/tLct 1 S5w CH AI 62\v 61c 60c 59c PROT SSw 63\v 58c 56c 5ÍW f 52c 51 w APA i 49c 48w 47c *Scf 44c PDI1 53c * 4Sw ARS305 4GLK3 3Sjtf 38c 37c36jlt 34WSTE50 HIS4 BIK128W FUSI XBc 2.5c \ 24w % 2!wiALEU2 ĚPLÍ i Sc BUD3 GBP2 tOc 9c I 35C 3SC 31C A — I-1 i 41c 42«/ SSK22 EflSt SOLZ 7Sc Tabk Nomenclature in the two yeast species S. cerevisiae S. pombe yfgV 98c ™ Wild-type gene Deletion (null) mutant Recessive mutant Dominant mutant Protein 99c i 1Ú0 YFGl Ayfgl yfg1& yfg1-l YFG1-2 Yfg1 YFG1p Áyfgl yfglA yfg1-1 yfg1-2 Yfg1yfg1p 1997 YTg typically Tieans your favourite gone*. The 'p' designation for proteins {for oxampte. Yfglp) e occasjonaly used. S. cerevcáe. Saccharomyces cerawaae or budding yeast; S. pombo. Scheosaccharomyces pombo or fission yeast. IN PARTNERSHIP WITH LGC STANDARDS Laboratorní kvasinkové kmeny S. pombe-,,501" Genotype: h- ura4-A18 leu 1-32 ade6-704 ATCC S. Cerevisiae - „S288C" - 1. osekvenovaný kmen Genotype: MATa SUC2gal2 malmel flol flo8-1 hapl Notes: Strain used in the systematic sequencing project, the sequence stored in SGD. S288C does not form pseudohyphae. In addition, since it has a mutated copy of HAP1, it is not a good strain for mitochondrial studies. S288C strains are gafZ- and they do not use galactose anaerobically. References: Mortimer and Johnston (1986) Genetics 113:35-43. Sources: ATCC:204508 „W303" - nejčastěji používaný laboratorní kmen Genotype: |flM7a/MATa]eu2-3,112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15 Notes: W303 also contains a ouů4 mutation that causes haploids to bud with a mixture of axial and bipolar budding patterns. In addition, the original W303 strain contains the rad5-535 allele. References: W303 constructed by Rodney Rothstein Sources: Biosvstems:YSC1058 Dvojhybridni systém: Strain AH109 Y187 CG-1945 Genotype References MATa, trpí-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4A, gal80A. LYS2 GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2, GAL1UAS-GALITATA-HIS3, U RA 3 : MEL lUAS-MEL 1 TATA lacZ MATa, ura3-52, his3-200, ade2-10l, trp 1-901, leu2-3, 112, gal4A, met-, gal80A, URA3:: GAL1UAS-GALITAJA-lacZ MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, Iys2-801, trp 1-901, leu2-3, 112, gal4-542, gal80-538, cyhr2. L YS2 GAL 1ÜAS-GAL 7TATA-H/S3, URA3 GAL4 ^.^^-CYdj^-lacZ James etat, 1996; A. Holtz, unpublished Harper etat, 1993 Feilotter etat., 1994; C. Giroux, pers. comm. Allele Reverts? Notes Molecular description3 Reference ade2-101 yes ochre mutation, red colonies G to T transversion at nucleotide 190, changing amino acid 64 from a Glu to a STOP Gai and Vovtas, 2005 his3-200 no Cold sensitive; high frequency of petite formation, especially during transformation. 1 kb deletion, (-205 to 835) Strahl 1985; Fasullo and Davis 1988 leu2-3,112 no double mutant GTT-to-GCT missense change at codon 69, G insertion at nucleotide 249, G insertion at nucleotide 792, GAC-to-AAC missense change at codon 300. Hinnen et al. 1978; Gaber and Culbertson 1982; trvl-1 yes amber mutation GAG-to-TAG amber (STOP) nonsense change at codon 83 McDonald, etat. 1997 uraS-52 no - Tyl insertion Rose and Winston 1984 Genotype References MATa, trp 1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200. James et al, 1996; ga!4A. gal80A. L YS2:: GAL 1UAS-GAL1TATA-HIS3, A. Holtz, unpublished GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2, URA3 : . MEL lUAS-MEL 1 tata-\bcZ MATa, ura3-52, his3-200. ade2-101, trp1-901, Harper et al., 1993 leu2-3, 112, ga!4A, met, galSOA, URA3:: GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ MA Ta, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801, Feilotter ef at., 1994; trp1-901, leu2-3, 112, gal4-542. gal80-538. cyhr2. C. Giroux, pers. comm. LYS2: : GAL1UA5-GAL1lkTA-HIS3, URA3 GAL4,7Mafn-CYC1TATIk-lacZ Table 2 | Corresponding tools in the two yeast species S. cerevtsiae S. pombe GAL (galactose regulated) nmt (thiamine regulated) Selekce Forsburg: NRG, 2001 Regulated promoter Pfasmid replication origins Auxotrophic markers Uracil, orotidine 5'-phosphate decarboxylase Setect against wrth 5-FOA Leucine, p-isopropyimalate dehydrogenase Adenine, phosphonbosyl-aminoimidazole carboxylase Accumulates red colour ARS1 or 2p URA3 LEU2 ADE2 ars1 ura4' leuV ade6' 2\i (2 micron), an endogenous plasm id DNA molecule found h some yeast cols, v/ith a arcumferonce of 2\i, 5'Huoro-orot»c acid. & carevrsoe, Sacctwom/ces oarevrsjoe or budding yeast; 2. pombo. Scheosaccharomyces pomba or fission yeast - geneticin (G418) - podobný kanamycinu (mistranslace) - nourseothricin (NAT) - inhibitor ribosomalní proteosyntézy = miskodování {Streptomyces noursei), rezistence pomocí nati genu (N-acetyltransferasa -monoacetyluje NAT) - hygromycin B - inhibuje translokaci v průběhu translace (aminoglykosid z Streptomyces hygroscopicus), rezistence kódována hph genem z Klebsiella pneumoniae - phleomycin - interkaluje se do DNA a způsobuje DSB (zlomy, glycopeptid z Streptomyces verticulus), rezistence kódována ble genem z S. hindustanus Shuttle vektory vychází z 2jim plasmidů nebo centromer (S.c; 2jim přítomné také v Zygosaccharomyces bailii, Z rouxii a Kluyveromyces drosophilarum) Kvasinková část - marker (URA3, NAT ...), CEN-ARS (1 kopie) nebo 2jim (-50 kopii na haploidní buňku) začátek replikace Bakteriální část - Kan resistence, replikace Promotor, tag, MCS - Kondicionální mutanty (fenotyp-funkce) - Nadprodukce (suprese mutací nebo toxicita) Promoter Regulation/ Relative Protein Expression Level Signal Strength on Western blot b Kpnl EcoRI BaiiiH 1 URA3 ADH1 (full-length) ^Dhrf (410 bp+)c ADH1 (410 bp) ADH1 (700 bp) GAĹ1 (full-length) MET1 CUP1 MFA1 Eth a n ol -rep resse di H i g h Constitutive/medium Constitutive/low Constitutive/ very low Consitutive/high +++ +,'- (weak) (not detectable) +++ ARSH4 CEN6 Repressed by glucose; {not detectable)d induced (high-level) by galactose +++d Methionin repressed Indukovány mědí MATa specifický (haploid specifický) Kan Table 1. Summary of pFA6 derivatives for genomic FLAG- and PK-tagging and geue deleliou useful iu ,S. pombe. Vector name Comments Markers Sources pFA6a-6xGLY-V5tagging kanMXÖ natMXÖ (2) (163 kanMXÖ (103 pFA6a-mRFP-(maker) C-terminal mKFP-Tagging hphMXÖ natMXÖ uraMXÖ (10) (103 This study kanMXÖ Q) hphMXÖ (9,103 natMXÖ (9.103 Disruption pin 7 muh pFA6a-(rnaker3 For gene deletion bleMXÖ ura4MXÖ hüiMXÖ LEU2MXÖ (9.103 This study This study This study ^Expressed under the control of the nmll promoter: PSmnrl and its weaker derivatives P41mntl and PSlnnnl are available. "^Expressed under the control of the urgl promoter. YAC (yeast artificial chromosome) Bakteriální část - Amp resistence, počátek replikace Kvasinková část - marker, CEN-ARS, TEL 50-500kbp insert např. lidská genová banka pro HuGO 80000 klonů YAC (270kbp) Klonování, množení, uchování dlouhých fragmentů DNA Výzkum savčích telomer a centromer Pomocí transfekce, lipofekce nebo elektroporace lze dostat YAC i do savčích buněk -náhodně se integrují do genomu - výzkum nesestřihnutých genů (dlouhé regulační úseky) Transformační protokol • Exponenciální kultura • Opláchnout vodou a TE/LiAc roztokem • Rozsuspendovat v TE/LiAc roztoku a přidat DNA (plasmidová/cirkulární i lineární DNA) • Přidat TE/LiAc/PEG4000 roztok • 30 minut na 30°C a poté teplotní šok při 42°C (15min) • Stočit a pelet rozsuspendovat v TE roztoku • Rozetřít na selektivní plotnu aglutinin Yeast surface display ■ B 2am GPMM6/pMCGl GPMH6/pMCCil (100 uM CuS04) (without CuSQ4) - využití i pro biotechnologie - vychytávání těžkých kovů (dekontaminace) - 6xHis-Aga2 (vychytání Cu) integrován v genomu - CUP1-GTS1 (indukce aglutinace) na plasmidu i i GAPDH \ ) %iFír.i s.s. ff promoter / on TRPJ GTSI CUP1 promoč r Kuroda et al, Appl Microbiol Biotechnol (2002) Integrativní plasmidy nemají CEN ani 2jim části Not I oř ßg/li Transcription Termination (TT) Not I or BglU - integrativní plasmid pro P. pastoris (GS1115, genotype: his4) - exprese z AOX1 promotoru v Rpastoris Fe.itu re Description Benefit 5'AOXl An -1000 bp fragment containing the AOX1 promoter Allows methanol-inducible high level expression in riclna Targets plasmid integration to the AOX1 locus. Sig DNA sequence coding for an N-terminal protein secretion signal Targets desired protein for secretion MC5 Multiple Cloning Site Allows insertion of your gene into the expression vector TT Native transcription termination and polyadenylation signal from AOX1 gene (-260 bp) Permits efficient transcription termination and polvadenvlation of the mRNA H1S4 Pichia wild-type gene coding for histidinol dehydrogenase (-2.4 kb) and used to complement Pichia Iiis4 strains Provides a selectable marker to isolate Pichia recombinant strains TAOX1 Sequences from the AOX1 gene that are further 3' to the TT sequences (-650 bp) Targets plasmid integration at the AOXJ gene Amp PBR322 origin Ampicillin resistance gene E. coli origin of replication Allows selection, replication, and maintenance in E. coli fl origin Bacteriophage fl origin of replication (458 bp) Permits generation of single-stranded DNA for mutagenesis Noll Bgl II Sac I Sail Stu I Unique restriction sites Permits linearization of vector for efficient integration into the Pichia genome Not I or Sg/II Not I or BglU Transcription Termination (TT) Integrace AOX1 Gene of Interest - integrativni plasmid pro P. pastoris (GS1115, genotype: his4) - exprese z AOX1 promotoru - integrace do AOX1 lokusu - mechanismus homologní rekombinace 2AOX1 X Linearized plasmid Pichia genome (his4) HIS4 3 AOX1 Plasmid integrated into genome Transcription Termination (TT) Integrace integrace do his4 lokusu mechanismus homologní rekombinace his4 Pichia Genome {his4) * mutation HIS4 TT Gene of Interest TS'Paoxi S3' AOX1 A V His+ h/s4„ His" Not I or eg/11 MCS Transcription Termination (TT) Integrace Not I or ßg/li AOX1 or aox1::ARG4 mechanismus homologní rekombinace integrace do AOX1 lokusu Pichia Genome {his4) 5' AOX1 or aox1::ARG4 TT 5* Paoxi^Z Gene of Interest TT HIS4 I 3' A 0X1 Expression Cassette 2nd Insertion Event 5* AQXf or aojrf sAAStf TT 3* Expression Cassette 2 3rci Insertion Event, etc. u P/c/?/a pastoris dochází u 1-10% transformantů k vícenásobné integraci - vyšší exprese Pomocí jiného markeru lze integrovat další kazetu Disrupce/delece genu Studium funkce genu - fenotyp (1. delece, 2. mutace) - nezbytný/esenciální gen => buňky potřebují gen např. na plasmidu (plasmid shuffling) - životaschopné - mutace lze přímo integrovat do genomu - mutantní kmeny se testují na citlivost k různým „toxinům" - dále je lze křížit s funkčně podobnými geny-mutantami a hledat jejich funkční vztahy (synthetic lethal x epistatic x supreseU, 1. krok o krok f rrai 1 Ura jl UP A 3 FOA Selection (Una") 1 FOA Selection (Ura ) 1 specifická mutace IT neesenciální gen Využití inhibitoru FOA pro „odléčení" URA3 markeru (FOA je přeměňována Ura3p dekarboxylázou na toxický 5-fluorouracil => URA3+ buňky nerostou, zatímco ura3- buňky jsou rezistentní) Buňky se stávají ura-, takže URA3 marker lze využít několikrát Delece genu - PCR pro rekombinaci stačí pouze krátká homologie (50-1 OOnt pro S.c.) oligonukleotidy ~ 70nt dlouhé postačí (při 2 krokové PCR se kromě dlouhé homologie vnesou ještě specifické sekvence pro pozdější manipulace ...) kanMX 4 kanMX 4 kanMX 1.PCR (barcode) 2.PCR (homologie) Kvasinkový ORF systematicky provedeno na >6000 genech v rámci projektu EuroFan kmeny lze získat z archivu EUROSCARF http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/index.html EUROPEAN SACCHAROMYCES CEREVISL^E ARCHIVE FOR FUNCTIONAL ANALYSIS Deleční knihovna - S. pombe Rozdíly S.cerevisiae x S. pombe: Organizace buněčného cyklu, intronů, heterochromatinu, centromer a replikačních počátků (S. pombe = „mikrosavec") UPTAG primer (70-mer) |U1 I UPTAG |U2^ U2 KanMX4 D2 I RHG-1 I uA D2| DNTAG |D1| DNTAG primer (70-mer) U1 UPTAG U2 KanMX4 D2 DNTAG D1 D1 I RHG-1 .4 RHG' U1 UPTAG U2 KanMXA D2 DNTAG D1 RHG* RHG" Ü1 D1 RHG" Joining by overlapping block PCR U Gene synthesis Not made (78) RHG U1 UPTAG U2 KanMX4 D2 DNTAG D1 RHG S. pombe potřebuje delší homologii (seriál PCR = 40-80bp; block PCR = 80-350bp) deleční knihovna od Bioneer (Korea, 25 000$) Kim et a| Nat Biotecn (2010) MX6 kazety - nourseothricin (NAT) - inhibitor ribosomalní proteosyntézy = miskodování {Streptomyces noursei), rezistence pomocí nati genu (N-acetyltransferasa -monoacetyluje NAT) - hygromycin B - inhibuje translokaci v průběhu translace (aminoglykosid z Streptomyces hygroscopicus), rezistence kódována hph genem z Klebsiella pneumoniae - phleomycin - interkaluje se do DNA a způsobuje DSB (zlomy, glycopeptid z Streptomyces verticulus), rezistence kódována ble genem z S. hindustanus) Společná struktura kazety - možnost záměny kazet (pro genetické studie - křížení) Pme\ F2 Pac\ Bgl —► ßamH I tef f2 Pac\ ^— —► Bgl\ BamH I F2 tef Pac\ BanM Bfl/j! tef nat ' tef EcofíV pFA6a-natMX6 1.2kb R1 Pme\ hph Ttef V pFA6a-hphMX6 i.7kb R1 Pme\ ble T tef EcofíV R1 pFA6a-bleMX6 1kb Hentges et al.: Yeast, 2005 Goldstein et al.: Yeast, 1999 Delece genu pomocí transposonů Library of mTn insertions in yeast DNA. generated In E. coli Xa 3xHA IR lox lad URA3 tet res lox \ IR Prepare DNA from individual plasmids Cut with Atari; transform yeast ^ sľ/ / -í ? « r-> T-? T-.* --.y '■'.'V'.'W/ (5-gal filter assay esenciální Citlivé YPD Hygro Defekt buněčné stěny MacDonald et al.: Nature, 1999 Cre rekombinasa ESSENTIAL pUC* jr.-P.I * Gene'2008 CPT5 -uraS+lfo" PCR product size /_\ 2.2 kb t +Cre cpr PCR product size 3.6 kb Postup lze použít několikrát se stále stejným markerem Nevýhoda pro genetické studie (marker nekosegreguje s mutací) Příprava monomerů pro výrobu plastů - využití Candida tropicalis Candida tropicalis\e schopna využít mastné kyseliny jako zdroj uhlíku (acetyl-CoA) mutantní kmen (APOX4, APOX5) není schopen p-oxidace a přeměňuje je OXidaCÍ na di-karbOXylOVé kyseliny (Picataggio et al, Biotechnology, 1992) pomocí flp rekombinasy odstranili geny oxidás (4 alkohol oxidásy) a dehydrogenás (6 alkohol dehydrogenás), aby eliminovali co-oxidaci nový kmen je schopen produkovat co-hydroxymastné kyseliny které lze použít pro výrobu bio-polymerů (plastů podobných polyetylénům, bio-odbouratelné na bio-palivo) • další modifikace kmene (integrace genů pro lipasy) by umožnilo přímé odbourávání Fa rty arid v-ovictation :iii\:AM Linear: ^ - guide RNA cassettes " » - donor DNA — - marked plasmid f J crRNA kódována na plasmidech Multiplex CRISPR integration Donor DNA 6. Insertion/ deletion Prototype pathways * Assess allele synergy New DMA Hoii-iiunioiogůus end joining [NHEJ] New DNA Homology di reeled repair (HDR) gRNA kazeta definuje místo štěpení donorová DNA nese integrační insert Horwitz et al, Cell Syst, 2015 6 integrací do 3 lokusů (po dvou) - nová metabolická dráha Yeast expressing Cas9 AroY AroY GAL4 GAL 80 DS AroF *ir* AroY AroY Linear: ^ ^ - guide RNA cassettes * * - donor DNA — - marked plasmid t *1 AroY v pěti kopiích - zvýšilo výtěžek A Viiiti' BT™ AR01US wsbm *ir^ AroZ AroY Multiplex CRISPR integration AroB *ir* AroD AR 01 DS Phosphoenol pyruvate glucose AroF AroB * AroD DAHP m+- DHQ M ■ AroZ AroY 4. E4P D HS t AroJ " ČATA PCA p*- catechol V^- cts.cŕs-muconic acid M3P04 ►fjPO* COj Aro1 T aromatic amino acids syntéza kyseliny mukonové - bioplasty zablokování tvorby aromatických AMK - AR01 - na bohatém médiu roste biomasa, ale na minimálním médiu bez aromatických AMK se spouští tato dráha AroB, D, F, Y a Z = E. coli ČATA = C. albicans Horwitz et al-CeN svst'2015 integrace do neutrálního HO lokusu nebo odstranění AR01 a GAL80 EuroFan projekt - testy fenotypu Assay/growth conditions YPD+tímMcaffdina Cyclch&xrriide hypersensitivity: YPD + 0.08 u.g m)"1 cycloheximide at 30 X Vihite/red colour on YPD - - :• • •;a; I i i r— Côbnflu :r hr/persensitwity: YPD + 12 m9' r1 calcoflucr at 30"C Buněčná stěna (stabilizující) YPD + 46 u.g rnr1 hygromycin at 3j C YPD + 0.003% SDS — Benomyi hypersensitMty: YPD + lOjugml"1 benomyi | |\/| JkfOtUbuly YPD + 5-bromo-4-:Ncro-3-inddyl phosphate at 37 °C (stabilizující) YPD + 0.001 % methylene blue at 30 CC Benomyi resistance: YPD + 20ngml-1 benomyi | MíkrOtUbuly YPDat376000 genech v rámci projektu EuroFan Funkční kategorie genů - anotace v databázích (genová ontológie) ~ 6000 heterozygotních delečních kmenů ~ 5000 homozygotních delečních kmenů (+ ~ 1000 esenciálních genů) (neesenciální - růst za specifických podmínek nebo redundantní procesy) Lethality (Giaever et al, 2002) I Growth defect in rich medium (Deutschbauet etal.. 2005) Growth defect in this study No phenotype in this study - Testováno -400 malých molekul a stresových podmínek (-aa ...) - Celkem provedeno ~ 6milionů testů - multidrug resistance (MDR) pokud byl gen potřebný pro resistenci vůči >20% z testovaných látek B Podobné profily svědčí o funkční podobnosti Hydrogen peroxide, pH8 MMS, MPP+. Paraquat, Sodium arsenate \__ " PEX5 PEX22 PEX19 PEX14 PEX8 YGL152C YJL211C PEX1 PEX3 PEX10 PEX4 PEX13 PEX6 PEX17 PEX12 PEX15 Er>:losom* transport Resistant UbiquitinJtep an riant protein catabotism via MVS pathway (P<107) (P< 10*)/ Vssids-mediated transport (P<10"'7) W Peroxisome (P=6x10-2e> 1 ..i - - ľ. I ■ i I -■ to vacuole transport (P < 10"7) / Vacuole I Vacuolar Endosome {P< Retromer complex /\(P<10J) «■•1.3 NTv tSCRT-l. II. III >v >4 ^ (P<10-ä) N Regulůtion of transcription (P<10-») Geny/Proteiny peroxisomu Science 320 (2008), p.362 Sensitive 410 homozvaous exDítinwils í POA SdecNoii (Hra") 1 v-ffT-i 1 Plasmid shuffling Pokud je VFG7 esenciální musí být v deleční mutantě přítomna extra divoká kopie genu např. na plasmidu Na dalším plasmidu může být vnesena mutovaná verze yfgl -její efekt se projeví až po odstranění plasmidu s divokou kopií genu (pomocí FOA) Podobně lze použít ade2, ade3 systém s YFG1 wt genem na plasmidu s ADE3 (kolonie jsou červené díky ade2 mutaci) - po ztrátě plasmidu jsou sektory kolonii bílé (bez Ade3p enzymu je metabolická dráha blokována dříve než vzniká červený metabolit) ts mutanty - ts mutanty jsou výhodné pro studium funkce esenciálních genů - mutanty jsou normální na permisivní (25°C) teplotě, ale nemohou dokončit buněčný proces vyžadující aktivní protein za restriktivní teploty (37°c) - ts mutanty = většinou nestabilní proteiny, které se při zvýšené teplotě denaturují/ztrácí aktivitu a jsou degradovány domain 1 domain 2 domain 3 pr celý protein je na 37°C degradován - je možno využít pro přípravu ts mutantních kvasinek (fůze s CDC28 - kvasinky arestují V G1 fázi) Dohmen et al.: Science, 1994 Rychlé vyřazení proteinu z funkce Anchůí-ťK3>1í Tafgtt-FňB pjparnyciri Terniry £4pi|>l4X WiMlype cell' Mutant celil li g 3 nd Plut rj pflnv ci n Haruki et al, Mol Cell, 2008