Sekreční dráha a endocytóza (vesikulární transport) Charakteristika pojmů endocytóza pinocytóza fagocytóza exocytóza sekrece Polarizovaná sekreční buňka Sekreční organely – ER, GA a sekreční váčky - jsou uspořádány polárně a sekret je uvolňován do lumina žlázy Jak byla objevena sekreční dráha ER → GA → vesikly - ve žlázových buňkách jsou tyto kompartmenty abundantní - izotopové techniky prokázaly že po pulse-chase je radoaktivita nejprve nad ER, pak GA a pak u povrchu v zymogeních granulích Začátek sekreční dráhy: syntéza proteinu na membráně ER Translokace proteinu do lumina ER Postup (N-)glykosylace proteinů v průběhu kotranslačního transportu na membránách endoplasmatického retikula Jak je kontrolován postup sekrečního produktu po sekreční dráze? U kvasinek S.cerevisiae byly detekovány geny, jejichž produkty jsou potřebné pro průběh sekrece. Mutací těchto genů je blokována sekreční dráha v místě, kde schází genový produkt Randy Schekman Geny kontrolující průběh sekreční dráhy v kvasinkové buňce – termosensitivní mutanty, zastavující sekreční dráhu na vyznačených místech z důvodu termolability proteinu Jak se izolují sec mutanty? Jestliže syntéza bílkovin pokračuje, ale sekrece je zastavena, vzrůstá specifická hmotnost buněk a v hustotním gradientu jsou těžší! Shekman (1982) provedl NG mutagenezi u kvasinek S. cerevisiae a po odstranění NG inkuboval kulturu 60 min při 37 0C. Následně buňky centrifugoval v gradientu sacharózy a izoloval nejtěžší frakci buněk. Tuto frakci nechal narůst při 24 0C na agaru a narostlé kolonie testoval na termosensitivitu. Buňky, které rostly při 24 0C a nerostly při 37 0C (asi 1800 kolonií) pak testoval na místo bloku v sekreční dráze Sekreční mutanta S. cerevisiae sec 18, transfer 25 0C do 37 0C 240C 370C Sekreční mutanta S. cerevisiae sec 7 Transfer z 25 0C do 37 0C 240C 370C Sekreční mutanty kvasinek: ts sec 1, 24 oC → 37 oC 370C 240C Jak jsou geny (genové produkty)seřazeny podél sekreční dráhy ? křížení: α sec 18 x β sec 7 → blok ER sec 18 - blok ER sec 7 - blok GA křížení: α sec 7 x β sec 1 → blok GA sec 1 – blok VES sec 7- blok GA Produkty genů zasahují do sekreční dráhy v pořadí: sec 18 → sec 7 → sec 1 Jaký význam má pasáž přes sekreční kompartmenty? Kvasinky secernují mannanproteiny, které se ukládají ve stěně, např. invertáza MV 270 000, z toho 55% je mannan Při izolaci ER ze sec 18 byla zjištěna invertáza s malým obsahem mannanu. Při izolaci GA ze sec 7 zjištěna invertáza plně glykosylována. Proteinová část invertázy je tedy syntetizována v ER, kde je i částečně glykosylována. Glykosylace tohoto glykoproteinu je dokončena v GA. Proteiny, potřebné k exocytóze sekrečního váčku (post-Golgi secretory vesicle), definované na základě genetické analýzy sekrečních mutant Jak se izolují sec mutanty? Jestliže syntéza bílkovin pokračuje, ale sekrece je zastavena, vzrůstá specifická hmotnost buněk a v hustotním gradientu jsou těžší. Z frakce těžších buněk se případně izolují teplotně senzitivní mutanty: v pokojové teplotě 250C probíhá sekrece proteinů normálně, avšak při zvýšení kultivační teploty na 370C je sekrece zastavena na tom místě, kde schází teplotě denaturovaný protein. Exocytosa Molekulární mechanizmy fuze membrány sekrečního váčku s plasmatickou membránou: interakce membránových proteinů startuje fuzi membrány Endocytóza Jak lze sledovat postup přijímaných molekul endocytózou: - radioaktivní polypeptid n. polysacharid - ferritin (na ultratenkých řezech) - FITTC - fluorescencí zabarvený substrát (luciferáza) se objeví nejprve ve frakci měchýřků - endosomy, pak ve frakci lyzosomů Endocytóza: invaginace plasmatické membrány. Tvorba a odštěpení váčku - endosomu Účast některých proteinů na vytváření (assembly) endocytotického měchýřku Analýza participace genů (genových produktů) na endocytóze u S. cerevisiae (Drubin) actin Současný model molekulárního mechanizmu endocytózy: Las17 (WAS) a Myo1 aktivují protein 2/3(Arp2/3). Tento komplex aktivuje polymerizaci aktinu, kde hrají úlohu ještě další proteiny. Současně se organizuje clathrinový obal měchýřku. Polymerizace aktinu vede k prohlubování invaginace plasmatické membrány a oddělení měchýřku – endosomu. Množina proteinů, která se podílí na kontrole polymerace aktinu Molekulární mechanismy vzniku hereditární hypercholesterolemie 1.Porucha syntézy receptorového proteinu na ER 2.Porucha postranslační modifikace proteinu v GA 3.Porucha vazby receptorového proteinu s ligandou (LDL – light density lipoproteins) 4. Porucha shlukování komplexu receptor-LDL v plasmatické membráně