Principy a metody monokrystalové strukturní analýzy
lJaromír Marek
l
l
l
l
l .

Obsah přednášky
lMonokrystalová krystalografie jako chemická metodika
lHistorie difrakční krystalografie, krystalografické databáze
lPrincipy monokrystalové krystalografie
lPřístrojová instrumentace
lZákladní postupy
lPříklady výsledků
l
l
l
l
l
l 2/40
l .

Krystalografie
lExperimentální věda studující krystaly
lAnalýza difrakčních obrazců
lStudium atomární struktury pevných látek
lMonokrystalová krystalografie
l
l
l
l
l
l
l
l
l 3/40
l .

Historie difrakční monokrystalové krystalografie
lPotřeba vhodné „sondy“ – například elektromagnetické záření (1895, N.c. za fyziku 1901- W. C.
Röntgen)
l1912 - průkaz vlnové povahy rentgenového záření difrakcí na krystalu (N.c. za fyziku 1914 - M. von
Laue)
l1913-14 - První analýzy struktur krystalů (N.c. za fyziku 1915-W.H. Bragg & W.L. Bragg)
l1924 - vlnová povaha elektronů (N.c. za fyziku 1927 - L.V. de Broglie)
l1927 - difrakce elektronů na krystalu (N.c. za fyziku 1937- C.J. Davisson & G. Thompson)
lNeutronová difrakce (1994 - N.c. za fyziku - C. Shull &  N. Brockhouse)
l
l 4/40
l .

Historie monokrystalové krystalografie – další NC
l1946 - chemie - J.B. Sumner - „enzymes can be crystallised“ (1926)
l1954 - chemie - L. Pauling - „ research into the nature of the chemical bond and its application
to the structure of complex substances“
l1962 - chemie - M.F.Perutz & J.C.Kendrew – „studies of the structures of globular protein“  (1959)
l1962 - fyziologie a medicína - F.H.C.Crick, J.D.Watson & M.H.F.Wilkins - „helical structure of
DNA“ (1953)
l1964 - chemie - D. Crowfood-Hodgkin - „structure of many biochemical substances including Vitamin
B12“
l1976 - chemie - W.N.Lipscomb – „Structure of boranes “
l
l 5/40
l .

Historie monokrystalové krystalografie – další NC
l1982 - chemie - A. Klug - „crystallographic electron microscopy and structure of biologically
important nucleic acid - protein complexes“
l1985 - chemie - H. A. Hauptman & J.Karle - „Development of direct methods for the determination of
crystal structures “
l1988 - chemie - J.Deisenhofer, R.Huber & H. Michel – „determination of the three-dimensional
structure of a photosynthetic reaction centre
l2003 - chemie (1/2) - R. MacKinnon - „structural and mechanistic studies of ion channels"
l2006 - chemie - R. D. Kornberg - „molecular basis of eukaryotic transcription“ (= struktura RNA
polymerázy)
l2009 - chemie - V. Ramakrishnan, T.A. Steitz, A.E. Yonath - „structure and function of the
ribosome “
l2011 - chemie - Dan Shechtman - „for discovery of quasicrystals“
l2012 – chemie (1/2) – Brian Kobilka - "for studies of G-protein-coupled receptors"
l
l 6/40
l .

Oblasti užití monokrystalových difrakčních technik
lanorganická chemie - databáze ICSD
lorganická chemie - „Cambridgeská“ databáze CSDS
lbiochemie a molekulární biologie - databáze PDB
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l
l 7/40
l .

Růst užití difrakčních metodik v čase – databáze ICSD
l
l 8/40
l .
Studované subjekty: anorganické krystaly
Exponenciální růst       v 50. až 60. letech      20. století.
Detektor = film
isds-počet

Růst užití difrakčních metodik v čase – databáze CSDS
l
l 9/40
l .
„Malé“ organické molekuly
Nástup v 70.-80. letech: automatické difraktometry + „přímé metody“
90. léta – výpočty na PC
csds-počet

Růst užití difrakčních metodik v čase – databáze PDB
l
l 10/40
l .
biologické makromolekuly
90. léta - PCR [objev 1983, (1/2) N.C. za chemii 1993 - Kary B. Mullis]
plošné detektory, synchrotronové záření

pdb-počet1

Růst užití difrakčních metodik v čase – současnost
lhttp://en.wikipedia.org/wiki/Crystallographic_database                   11/40
l .
769px-Trend_of_crystal_structures_in_databases

Teoretické principy strukturní krystalografie: sonda
l„sonda“ velikosti vhodné pro studium atomů – elektron,neutron,foton
lrentgenové záření -  vlnová délka (10 - 0.01 nm) v oboru standardních meziatomových vzdáleností (~
1 Å)
linterakce fotonu s látkou - rozptyl nebo absorbce
lRozptyl - s energetickými ztrátami – Comptonovský
l - beze ztrát energie  - Thompsonův
l
l
l
l
l
l
l 12/40
l .

Teoretické principy krystalografie: Thompsonův rozptyl
l
l
l
l 13/40
l .
Nabitá částice je v poli rovinného monochromatického záření sekundárním zdrojem elektromagnetického
pole
Rozptyl na protonech je nevýznamný - je 18372x slabší než rozptyl fotonů na elektronech.
Při difrakci elektromagnetického záření studujeme elektronovou strukturu látky

Teoretické principy krystalografie: dráhový a fázový rozdíl
l
l
l
l 14/40
l .
Rovinná vlna, dvě nabitá rozptylová centra -> dráhový rozdíl
Amplituda záření rozptýleného na N centrech

Teoretické principy krystalografie: krystal,interference a difrakce
l
l
l
l 15/40
l .
f39
Rovinná vlna, dvě rovnoběžné roviny -> dráhový rozdíl

Teoretické principy krystalografie:
strukturní faktor, elektronová hustota
l
l 16/40
l .
Strukturní faktor – popisuje amplitudu difraktované vlny
Krystalová elektronová hustota  je obráceným Fourierovým obrazem strukturních amplitud
Fázový problém – neměříme strukturní amplitudy jako čísla komplexní, ale intenzity difrakcí =
velikosti amplitud = kladná reálná čísla

Difrakční experiment pro určení
krystalové 3-D struktury
l
l 17/40
l .
Cíl experimentu : s maximální možnou přesností a rychlostí naměřit co nejvíce intenzit vzniklých
difrakcí rovnoběžného monochromatic. záření na různých množinách krystalových rovin
Generování intenzivního rentgenového záření
Úpravy fyzikálních parametrů záření
Detekce záření v difraktometrech
Měření na difraktometrech
Chlazení vzorků

Difrakční experiment :
Generování RTG záření
l
l 18/40
l .
Rentgenové záření – vlnová délka 0,1 – 10 nm
Generování „klasického“ RTG záření – elektron vs. kovový terčík
Limitace – „bodový“ zdroj kulových vln s malými možnostmi zvyšování vyzářeného výkonu
 – charakteristické spektrum
Nekonvenční zdroje RTG
f47

Difrakční experiment :
konvenční zdroje RTG záření
l
l 19/40
l .

Difrakční experiment :
nekonvenční zdroje RTG záření
lwww.diamond.ac.uk/Home/About/Facts.html
l 20/40
l .
3D_model_of_the_machine Corel-Capt
např. Diamond Light Source (UK, 2007)
     7/22/40pracovišť,obvod 560 m,
     plocha 5 fotbal. hřišť, cena 400 mil GBP

Difrakční experiment :
úpravy fyzikálních parametrů záření
l
l 21/40
l .
Krystalový monochromátor – monochromatizace difrakcí
f2356a f211
„rovinná“ vlna – clony + „zrcadla“
osmic

Difrakční experiment:
detekce ionizujícího záření
l
l 22/40
l .
Interakce záření s detektorem
      chemická modifikace
      ionizace
-     konverze vlnové délky
-     generace páru elektron-“díra“ v polovodičích
-
-
-Detektory jednokanálové  x  detektory plošné
-
-
Rentgenový film
Scintilátor [Gd2O2S(Tb) ]+ CCD detektor
Polovodičové detektory

Difrakční experiment:
CCD detektor
l
l 23/40
l .
http://proteincrystallography.org/detectors/
ccd-principles ADSC-Quantum-315r-inside

Difrakční experiment:
automatický difraktometr-schéma
l
l 24/40
l .
www.marine-genomics-europe.org
sch_ma_diffraction__M

Difrakční experiment:
difraktometr-geometrie
l
l 25/40
l .
f29da f29bd

Difrakční experiment:
automatický difraktometr
l
l 26/40
l .
www.bruker-axs.de
bruker-proteum

Monokrystalová krystalografie:
základní postupy
l
l 27/40
l .
(0). Příprava studovaného materiálu
1.Krystalizace
2.Difrakční experiment
3.Fázový problém, příprava modelu
4.Zpřesňování 3-D modelu
•

Krystalografie - postupy: krystalizace monokrystalů
l
l 28/40
l .
časově nejnáročnější část určování 3-D struktur (je nutná dlouhodobá strukturní STABILITA vzorku!)
potřeba MĚŘITELNÝCH monokrystalů
organické a anorganická vzorky vs proteiny
multidimenzionální (multikomponentní) problém
proteomika: empirie, automatizace/robotizace

Krystalografie - postupy:
difrakční experiment
l
l 29/40
l .
rychlé vs přesné měření  =>  intenzivní zdroj RTG
limitované ROZLIŠENÍ difrakčního experimentu => geometrické limity na počet naměřených dat

Krystalografie - experiment:
rozlišení + omezené množství dat
l
l 30/40
•Rozlišení     Počet nezáv.                 Poměr počtů
•                        reflexí              reflexí a   proměnných
•   [ Å ]                              {x,y,z}        {x,y,z,B}
•40.0-2.5          6800                    1.6               1.2
•40.0-1.5           29800                      6.8               5.1
•40.0-1.0           81300                   18.5              13.8

Fázový problém – anorg. struktura
l
l 31/40
l .
metoda těžkého atomu

Fázový problém – organika
l
l 32/40
l .
„přímé“ metody - Karle & Hauptman (NC 1985) - „žádná“ předběžná informace
pravděpodobnostní metody
numerický „multisolution“ přístup
kritérium – správné/chybné řešené
délka (automatizovaného) řešení – do jednotek minut

„malé“ (do 1000 atomů=organické) molekuly
experimentální data do „atomárního“ rozlišení

Fázový problém – makromolekuly
l
l 33/40
l .
„velké“ systémy (tisíce atomů)
limitované experimentální rozlišení
využití podobnosti (MR, molecular replacement)
Se-Met proteiny (max. několik desítek metioninů, resp. Se atomů) + „přímé“ metody

Krystalografie - postupy:
stavba a zpřesňování 3-D modelu
l
l 34/40
l .
spojitá elektronová hustota vs 3-D atomární model
coot-substrat-a
automatické/“ruční“ doplňování a rušení atomů

Krystalografie – postupy při zpřesňování modelu
cíl: shoda experimentu (difrakčních dat) s 3-D modelem
experimentální data – intenzity difrakcí
nelineární závislost
minimalizace - metoda nejmenších čtverců
různé difrakční experimenty – různé množství dat
kritérium shodnosti:  R-faktor
typické hodnoty R-faktorů
l
l 35/40
l .

Monokrystalová krystalografie:
výstupy
l
l 36/40
l .
monokrystal – velikost ~10-4 m, V ~10-10-10-12 m3
krystalová mřížka - mřížkové parametry ~10-8 - 10-9m
                              - V ~10-24-10-27 m3
- typicky 2-8 „molekul“
strukturní model – „průměrná“, rovnovážná struktura
                               (ze vzorku 1012-1018)
teplotní pohyb atp => pravděpodobnost + teplotní elipsoidy

Monokrystalová krystalografie:
kvalita/přesnost řešení
l
l 37/40
l .
ORTEP obrázek + pravděpodobnost při jeho generování
finální R-faktory
chyby (e.s.d’s) souřadnic/vazebných parametrů
rozlišení difrakčního experimentu (limitní θ úhel)

Krystalografie –příklady výstupů: struktura komplexní sloučeniny
lSzüčová, Trávníček, Popa & Marek: Polyhedron 27 (2008), 2710–20
l 38/40
l .
a=8.1507(4) Å
b=15.6503(7) Å
c=14.1585(6) Å
b=101.086(4)°
3126 pozorování
266 parametrů
R=2.51%
Pt-Sucova-Polyhedron

linB
Krystalografie –příklady výstupů: makromolekulární struktura
lMarek, Vévodová, Kutá Smatanová,  Nagata,  Svensson, Newman, Takagi & Damborský: Biochemistry 39
(2000),14082-6
l 39/40
l .
a=50.26 Å
b=71.67 Å
c=72.70 Å
rozlišení 1.58 Å
34 513 pozorování
2301+449 atomů
R=14.5%
Rfree=20.4%

Monokrystalová strukturní krystalografie:další čtení
lwww.freeiconsdownload.com/site-images/Large/aqua-smiles-xp.jpg
l 40/40
l .
       Marek, J., Trávníček, Z.: Monokrystalová rentgenová strukturní analýza. Olomouc :
Vydavatelství Univerzity Palackého (2002).
         169 s. ISBN 80-244-0551-2
ico-smile