Souhrn - protein-proteinové interakce • proteiny jsou troj-rozměrné - mají různé tvary a více domén => mají mnoho vazebných míst na povrchu => komplexy a “sítě“ • části proteinů/domény interagují s doménami partnerů – domény mají určitou strukturu, která do značné míry determinuje tvar jejího povrchu, ale … – charakter (hydrofobicitu, polaritu, náboj) povrchu určují postraní řetězce aminokyselin směřujících do solventu, takže … – interakce proteinu je determinována povrchem, který musí mít tvar i charakter komplementární s interakčním partnerem (typy interakcí: …) + polá hydrofob rní ní - Protein-proteinové interakce • stabilní (velké plochy, většinou součástí komplexů) • přechodné/slabé (součást dynamických procesů – předávání signálů, modifikace) • posttranslační modifikace mohou změnit vazebné vlastnosti povrchu (fosforylace, ubiquitinace, SUMO) • souhrn proteinových interakcí = interaktom (modularita díky interakcím domén – různé kombinace domén - různé „(re-)wiring“ komplexů) Bader et al, FEBS Lett, 2008 Inhibice interakcí (virovými proteiny, mutacemi) vs. nové interakce Srovnání interaktomů => konzerv. interakcí (=> evoluce komplexů => evoluce organismů ) Síť neznamená komplex, ale vztah Interaktom x komplexom Wang et al., Nature, 2004 transkripce MAPk α γ β k kk kkkk kkk scaf TF TF k - proteiny jsou si blízko vs difuze - koordinované předávání signálů, substrátů … - moduly místo jednoho proteinu Jaké jsou výhody komplexů? Proč skládat komplexy z menších podjednotek? – skládání funkčního komplexu na specifickém místě (toxin je transportován jako rozpustný monomer a poté se skládá => stává se toxickým až mimo původní buňku) bakteriální toxin porin v mitochondrii Proč skládat komplexy z menších podjednotek? – skládání funkčního komplexu na specifickém místě (toxin je transportován jako rozpustný monomer a poté se skládá => stává se toxickým až mimo původní buňku) – skládání i rozpad komplexů jsou snadněji kontrolovatelné, reversibilní (protože podjednotky asociují skrze množství relativně slabých interakcí - nízká energie) – velký komplex (homo-oligomer) může být kódován relativně krátkou genetickou informací (skládá se menší protein – větší je méně stabilní a hůře se skládá) – menší pravděpodobnost defektní makromolekuly (menší gen => méně mutací + dá se relativně snadno vyhnout chybám – odstraní/degraduje se pouze jedna poškozená menší podjednotka => méně energie než pro nápravu celé struktury) – komplexy mohou být dynamičtější (flexibilnější) – evoluční výhoda modulů (nový komplex vzniká záměnou podjednotek) bakteriální toxin porin v mitochondrii Gavin et al., Nature, 2006 Izolace komplexů z kvasinky Saccharomyces cerevisiae 2 Primárním zdrojem strukturních informací = PDB Interaktivní web PDB-101 - relativní velikost komplexů voda, ATP ATP pumpa mikrotubuly chromatin proteasom Příklady komplexů chaperon apoptosom ATP pumpa Liljas a spol. Pouze některé části byly vykrystalizovány (zbylé části doplněny dle EM) Jak funguje ATPasová pumpa? PDB: 1C17:Apumpa obsahuje arginin, který předává proton/vodík aspartátu Rastogi & Girvin, Nature, 1999 pumpa obsahuje arginin, který předává proton/vodík aspartátu (ve vodném prostředí by byl negativně nabitý, ale v prostředí lipidické membrány nikoli). Dochází k neutralizaci náboje – otočka. Liljas, Structural Biology (kniha) pumpa obsahuje arginin, který předává proton/vodík aspartátu (ve vodném prostředí by byl negativně nabitý, ale v prostředí lipidické membrány nikoli). Dochází k neutralizaci náboje – otočka. „ATP syntasa je jedním z divů molekulárního světa“. Je to dvojitý molekulární motor – „nanostroj“ – vyrábějící většinu ATP (energie). Molekula měsíce v prosinci 2005 Rastogi & Girvin, Nature, 1999 F0 je protonový rotor (uložen v membráně) poháněný tokem vodíkových iontů (z dýchacího řetězce) přes membránu. Tento rotor je spojen s druhým F1 chemickým motorem poháněným ATP (nebo vyrábějícím ATP). Oba rotory jsou spojeny statorem. Při otočce osa tlačí na F1 motor (3 různé konformace) – levý panel = konformace vhodná pro vazbu ADP - pravý panel = ATP molekula byla vytlačena Liljas, Structural Biology (kniha) in vitro průkaz otáčení rotoru VIDEO Mulkidjanian et al, NRM, 2007 mitochondriální vakuolární Burkinshaw et al, BBA, 2014 Type III secretion systém (T3SS - injectisome) – bakteriální patogeny injikují (efektorové) proteiny skrze „jehlu“ do hostitelské buňky – ATPasová část pomáhá „protlačit“ efektorové proteiny z patogení bakterie skrze „jehlu“ do hostitelské buňky Replikace DNA (video): DNA helikasa “denaturuje” dvoušroubovici (modrá) – připojen je „clamp loader“ (šedá tlapka) - 2 raménka drží DNA polymerásy (fialové) spojené s PCNA („sliding clamp“, zelená). „Leading strand“ je syntetizován kontinuálně zatímco „lagging strand“ musí být primásou (žluto-zelená) odstartován (RNA primer = žlutý – Okazakiho fragmenty). PCNA zvyšuje procesivitu DNA polymerás Kelch et al, BMC Biol, 2012 Cell, SnapShot Replikace DNA: DNA helikasa “denaturuje” dvoušroubovici – připojen je „clamp loader“ - 2 raménka drží DNA polymerásy spojené s PCNA („sliding clamp“. „Leading strand“ je syntetizován kontinuálně zatímco „lagging strand“ musí být primásou odstartován (RNA primer – Okazakiho fragmenty). PCNA zvyšuje procesivitu DNA polymerás Kelch et al, BMC Biol, 2012 Citace, popis Kelch et al, BMC Biol, 2012 Kelch et al, Science, 2011 clamp loader ATP ADP Aktivovaný (ATP) clamp loader interaguje s PCNA a otevírá ji pro DNA. Vazba DNA stimuluje hydrolýzu ATP a uvolnění clamp loader (uzavřeného s DNA). PCNA-Fen1 -> PCNA-Lig1 Zheng a Shen, J Mol Cell Biol, 2011 Gao a spol, Mol Cell, 2012 Po skončení syntézy „lagging strand“ metylovaný Fen1 (flap endonucleasa) odštěpí RNA primer (demetylace a fosforylace disocuje Fen1) Poté PCNA asociuje s Lig1 (ligásou), která spojí cukrfosfátovou kostru Posttranslační modifikace modulují složení komplexu PCNA – regulace buněčného cyklu Analýza PPI PCNA naznačila mechanismus … p21 je upregulován nádorovým supresorem p53 Maga et al, FASEB J, 2004 Freudenthal et al, NSMB, 2010 Pokud je DNA poškozená, polδ se zastaví a je třeba poškození nejdříve opravit – jednou z možností je „zastoupení“ jinou polymerásou, která poškozené místo „toleruje“ a překopíruje (translesion synthesis) – přepíná se ubiquitylací PCNA (na „zadní straně“) TLS polymerasy (η, ι, κ) obsahují PIP a UBM motivy pro interakce s Ubi-PCNA Bergink & Jentsch, Nature, 2009 Sale et al, JCS, 2012 Oprava DNA: PCNA-ptm TLS polymerasy (η, ι, κ) obsahují UBM (správně přečtou chybu a zařadí správnou bázi) Srs2 (antirekombinása) obsahuje SIM (nedovolí rekombinaci v průběhu replikace) Template switch PCNA – moduly PCNA je „jádrem“ pro mnoho „attachments“ tj. s mnoha funkčními moduly - Loading - Sliding - Termination - Buněčný cyklus - TLS a oprava DNA - Chromatinizace … PCNA asociuje s CAF1 (chromatin assambly factor) a pomáhá znovunavázání histonů (nukleosomů) a vzniku chromatinu Dohke et al, Genes to Cells, 2008 Ransom et al, Cell, 2010 PCNA je “swiss-army knife” typ proteinového komplexu gen -> protein -> interakce -> komplex -> superkomplex … (molekulární stroj) -> kompartment -> buňka … genom -> proteom -> interaktom -> komplexom -> … fenom (funkce v buňce -> funkční znak v mnohobuněčných organismech) ~800 komplexů v S.c. Bertero et al, Cell, 2010 Shrnutí • Proteiny mohou být součástí jednoho (stabilní) nebo více komplexů (dynamické) • Stabilní komplexy (ATPasová pumpa) – Podjednotky jsou často koexprimovány (koexprese je vzájemně stabilizuje, lepší rozpustnost) – stabilní komplexy disociují proteolyticky – pokles hladiny jednoho proteinu má za následek pokles hladiny ostatních podjednotek • Dynamické komplexy (PCNA) – Interakce podjednotek dynamických komplexů jsou modulovány např. posttranslačními modifikacemi CG030 – Struktura a funkce proteinových komplexů (v jarním semestru) Doc. Jan Paleček Průběh mitózy (mikrotubuly, chromosomy) Více: http://www.molecularmovies.com/learning/ http://www.hhmi.org/biointeractive/explore-animations C9041 – Struktura a funkce eukaryotických chromosomů Prof. Jiří Fajkus CG030 – Struktura a funkce proteinových komplexů Doc. Jan Paleček You can find many more examples of protein complexes in this book: Alberts et al, Molecular biology of the cell, 2014 (6th edition)