CG020 Genomika
Přednáška 6
Proteinové interakce v genových regulacích
Jan Hejátko
Funkční genomika a proteomika rostlin,
Mendelovo centrum genomiky a proteomiky rostlin,
Středoevropský technologický institut (CEITEC), Masarykova univerzita, Brno
hejatko@sci.muni.cz, www.ceitec.muni.cz
 Zdrojová literatura
 Wilt, F.H., and Hake, S. (2004). Principles of Developmental Biology. (New York ;
London: W. W. Norton).
 Ainger, K., Avossa, D., Morgan, F., Hill, S.J., Barry, C., Barbarese, E., and Carson, J.H.
(1993). Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected
into oligodendrocytes. J Cell Biol 123, 431-441.
 Alberts, B. (1998). The cell as a collection of protein machines: preparing the next
generation of molecular biologists. Cell 92, 291-294.
 Grefen, C., Stadele, K., Ruzicka, K., Obrdlik, P., Harter, K., and Horak, J. (2008).
Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene
receptor family members. Molecular Plant 1, 308-320.
 Hu, C.D., and Kerppola, T.K. (2003). Simultaneous visualization of multiple protein
interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nat.
Biotechnol. 21, 539-545.
 Shahbabian, K., and Chartrand, P. (2012). Control of cytoplasmic mRNA localization.
Cellular and molecular life sciences : CMLS 69, 535-552.
 Van Leene, J., Witters, E., Inze, D., and De Jaeger, G. (2008). Boosting tandem affinity
purification of plant protein complexes. Trends Plant Sci 13, 517-520.
 Walter, M., Chaban, C., Schutze, K., Batistic, O., Weckermann, K., Nake, C., Blazevic, D.,
Grefen, C., Schumacher, K., Oecking, C., Harter, K., and Kudla, J. (2004). Visualization of
protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.
Plant J 40, 428-438.
Genomika 06
 Funkční význam specifických interakcí proteinů v
regulaci genové exprese
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Stabilita proteinů
 Přenos signálu
 Metody analýzy proteinových interakcí in vivo
 Koimunoprecipitace
 Tandemová afinitní purifikace (TAP-tag)
 Kvasinkový dvouhybridní test (Y2H)
 Bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC)
 Analýza zprostředkované membránové vazby (MeRA)
 Praktické využití metod pro studium PI in vivo
Osnova
 Funkční význam specifických interakcí proteinů
 Většina proteinů v buňce existuje ve
formě komplexů, které mohou dále
navzájem interagovat
 Proteazom
 proteinový komplex zodpovědný za
degradaci nepotřebných proteinů v
buňce
Význam interakcí
proteinů
1fnt
Proteazom
 Skládá se z centrálního komplexu
označovaného jako 20S a regulačních
částí (19S, někdy také 11S)
 Umožňuje cílenou degradaci proteinů
označených specifickou značkou, malým
proteinem (76 aa) - ubiquitinem
Význam interakcí
proteinů
 Funkční význam specifických inteakcí proteinů
 Struktura chromatinu
Význam PI
Regulation by histone
acetyl transferases or
histone deacteylases
CpG or CpNpG
CpNpNp
CpG
DNA methylation in animals vs. in plants
methylation status methylation status
Cell-specific methylation allows maintain of
tissue-specific gene expression profiles
Mechanism of transcriptional regulation by
DNA methylation mostly unknownImprinting and “cell memory”
 Funkční význam specifických inteakcí proteinů
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
Význam PI
Formation of transcription initiation complex
Positive TFs
Negative TFs
Formation of transcription initiation complex
Mechanism of transcriptional
regulation by TAFs
Signal recognition
Dimerization
DNA binding
and
transcription
activation every 7th aa
“Microprocessor-like” acting promoters
ProENDO16:REPORTER (sea urchin)
Deletion
mutagenesis Positive, interaction with
TAFs
Upregulation in the
presence of A and B
Developmental specificity
Combinatorial control
Midgut
Primary or skeletogenic
mesenchyme cells
Vegetal plate
“Microprocessor-like” acting promoters
Regulation of β-globin type of
hemoglobin chains expression
Locus control region
Development-dependent
activation by LCR
•Acetylation of H3?
•Involvement of other
genes?
Cca 50 kbp
 Funkční význam specifických inteakcí proteinů
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
Význam PI
BICOID mRNA NANOS mRNA
 Význam lokalizace mRNA
 Lokalizace proteinového produktu
genu v čase a místě
 asymetrické dělení během
vývoje
 polarizace embrya
Lokalizace mRNA
Shahbabian and Chartrand, 2012
ASH1 mRNA
 Role lokalizace mRNA
 Omezení exprese potenciálně
toxických proteinů
 lokalizace exprese MBP
do oblasti myelinizace
nervových buněk
Lokalizace mRNA
Ainger et al., 1993
MBP mRNA
Shahbabian and Chartrand, 2012
 Difůze a ukotvení mRNA
 Během ranné oogeneze u drápatky je
Xcat-2 mRNA lokalizována do tzv.
mitochondriálního oblaku (MO,
Balbianiho tělísko)
 Pohyb MO je částečně závislý na
depolymerizaci mikrotubulů (tzv.
molekulární motor)
 Ukotvení na vegetálním pólu je dáno
interakcíá MO s ER
Lokalizace mRNA
Mechanizmy
 Lokalizovaná degradace mRNA
 V embryogenezi u Drosophila m.
dochází polární lokalizaci Hsp83
mRNA, podobně jako NANOS
mRNA
 Hsp83 mRNA je lokalizována v
celém embryu, zde je však
destabilizována prostřednictvím cis
elementů jak v 3’UTR (HDE), tak v
kódující oblasti (HIE)
Lokalizace mRNA
Mechanizmy
 HIE elementy jsou rozpoznávány proteinem SMAUG, který
zprostředkováva vazbu degradačního komplexu
CCR4/POP2/NOT
 V oblasti posteriorního pólu je Hsp83 mRNA chráněna před
účinkem SMAUG tzv. HPE elementem v 3’UTR; mechanismus
této ochrany je dosud neznámý
Shahbabian and Chartrand, 2012
Shahbabian and Chartrand, 2012
 Aktivní transport mRNA
 ASH1 je represor HO u S.
cereviseae; inhibice HO
endonukleázy v dceřinných buňkách
zabraňuje změně párovacího typu
 ASH1 mRNA je aktivně
transportována prostřednictvím
„molekulárních motorů“
asociovaných s aktinem
Lokalizace mRNA
Mechanizmy
 ASH1 mRNA obsahuje 4 cis
elementy (3 v CDS a 1 ve
3’UTR), které jsou
rozpoznávány RNA vazebným
proteinem SHE2
 SHE2 umožňuje
prostřednictvím SHE3 vazbu
na „molekulární motor“,
MYO4, který se váže na aktin
a umožňuje transport ASH1
mRNA do dceřinné buňky
Shahbabian and Chartrand, 2012
ASH1 mRNA
 Funkční význam specifických inteakcí proteinů
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Sestřih hnRNA
Význam PI
 Funkční význam specifických inteakcí proteinů
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Sestřih hnRNA
 Stabilita proteinů
Význam PI
MP/ARF5
BDL/IAA12
Capron et al., Arabidopsis Book (2009)
Auxin signalling and its role in the embryo patterning
 Funkční význam specifických inteakcí proteinů
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Sestřih hnRNA
 Stabilita proteinů
 Přenos signálu
Význam PI
 PI a přenos signálu
 prostřednictvím G proteinu a
fosfolipasy C
 Signální kaskády využívající cAMP
PI a přenos signálu
 Funkční význam specifických interakcí proteinů v
regulaci genové exprese
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Stabilita mRNA
 Stabilita proteinů
 Přenos signálu
 Metody analýzy proteinových interakcí in vivo
 Koimunoprecipitace
Osnova
PI in vivo
Koimunoprecipitace
 založena na izolaci proteinových komplexů
pomocí protilátek rozpoznávajících jeden z
interagujících proteinů
 princip koimunoprecipitace využívá metoda
pro potvrzení interakcí u proteinů, kde již
tuto interakci předpokládáme pomocí tzv.
pull-down assay
CKI1
MYC
CKI1
HA
αMYC
αHA
CKI1
MYC
AHK3
HA
αMYC
 Funkční význam specifických interakcí proteinů v
regulaci genové exprese
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Stabilita mRNA
 Stabilita proteinů
 Přenos signálu
 Metody analýzy proteinových interakcí in vivo
 Koimunoprecipitace
 Tandemová afinitní purifikace (TAP-tag)
Osnova
PI in vivo
Tandemová afinitní purifikace (TAP-tag)
 izolace proteinových komplexů pomocí
rekombinantních proteinů, fúzovaných s dvěma
různými vazebnými doménami
 proteiny izolovaných komplexů jsou po rozdělení
na 1D ELFO identifikovány pomocí MS
 calmodulin-binding protein (CBP)
 IgG vázající domény proteinu A (ProtA)
 místo rozpoznávané specifickou
proteázou z TEV viru (tobacco etch
virus)
POI
 výhodou je použití dvou nezávislých proteinových
domén pro afinitiní purifikaci a tedy velká
specificita
 Funkční význam specifických interakcí proteinů v
regulaci genové exprese
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Stabilita mRNA
 Stabilita proteinů
 Přenos signálu
 Metody analýzy proteinových interakcí in vivo
 Koimunoprecipitace
 Tandemová afinitní purifikace (TAP-tag)
 Kvasinkový dvouhybridní test (Y2H)
Osnova
PI in vivo
Dvouhybridní kvasinkový test (Y2H)
 izolace proteinových komplexů pomocí
rekombinantních proteinů, každý z nich fúzovaný s
částí transkripčního faktoru Gal4
 jeden z proteinů (návnada, bait)
fúzovaný s DNA vazebnou doménou
Gal4 (Gal4-BD)
 druhý z proteinů (kořist, prey) fúzovaný
s aktivační doménou Gal4 (Gal4-AD)
 Interakce proteinů umožní rekonstituci vazebné
domény s aktivační doménou a spuštění
reportérového genu
 vizuální detekce (modré zbarvení, LacZ)
 auxotrofní selekce (růst na médiu bez
histidinu, His)
 umožňuje vyhledávání interakčních partnerů v
expresních knihovnách jednotlivých organismů
 Funkční význam specifických interakcí proteinů v
regulaci genové exprese
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Stabilita mRNA
 Stabilita proteinů
 Přenos signálu
 Metody analýzy proteinových interakcí in vivo
 Koimunoprecipitace
 Tandemová afinitní purifikace (TAP-tag)
 Kvasinkový dvouhybridní test (Y2H)
 Bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC)
Osnova
 Proteinová interakce je detekována na
základě reasociace fluoreskujícího proteinu
 každý z potenciálních interakčních
partnerů je fúzován s jednou z
podjednotek fluoreskujícího
proteinu, např. YFP
 při interakci dojde ke
znovuobnovení fluorescence
 Kromě identifikace vlastní interakce
umožňuje i lokalizovat interakci v buňce
PI in vivo
bimolekulární fluorescenční
komplementace (BiFC)
 Funkční význam specifických interakcí proteinů v
regulaci genové exprese
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Stabilita mRNA
 Stabilita proteinů
 Přenos signálu
 Metody analýzy proteinových interakcí in vivo
 Koimunoprecipitace
 Tandemová afinitní purifikace (TAP-tag)
 Kvasinkový dvouhybridní test (Y2H)
 Bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC)
 Analýza zprostředkované membránové vazby (MeRA)
Osnova
PI in vivo
Analýza zprostředkované membránové
vazby (MeRA)
 Umožňuje identifikaci interakcí cytoplazmatických
proteinů s membránovými proteiny
 membránový protein je fúzován s
fluoreskujícím proteinem
 potenciální ineterakční partner je
fúzován s jimým fluoreskujícím
proteinem, lišícím se svým emisním
spektrem
 v případě interakce dojde ke změně
lokalizace cytoplazmatického proteinu
na membránu (kolokalizaci s
membránovým proteinem)

PI in vivo
Analýza zprostředkované membránové
vazby (MeRA)
GFP
GFPGFPGFP
P35S::ERS1:RFP + P35S::ΔTM-ETR2:GFP
PI in vivo
Analýza zprostředkované membránové
vazby (MeRA)
 Funkční význam specifických interakcí proteinů v
regulaci genové exprese
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Stabilita mRNA
 Stabilita proteinů
 Přenos signálu
 Metody analýzy proteinových interakcí in vivo
 Koimunoprecipitace
 Tandemová afinitní purifikace (TAP-tag)
 Kvasinkový dvouhybridní test (Y2H)
 Bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC)
 Analýza zprostředkované membránové vazby (MeRA)
 Praktické využití metod pro studium PI in vivo
Osnova
D’Agostino et al., Plant Phys, 2000
Signal Transduction via MSP
NUCLEUS
PM
AHK sensor histidine kinases
• AHK2
• AHK3
• CRE1/AHK4/WOL
REGULATION OF TRANSCRIPTION
INTERACTION WITH EFFECTOR PROTEINS
HPt Proteins
• AHP1-6
Response Regulators
• ARR1-24
CK primary response genes
- Type-A ARRs expression
Recent Model of the CK Signaling via Multistep Phosphorelay (MSP)
Pathway
AHP1
AtHK1
AHP2
AHP3
AHP4
AHP5
AHK2
AHK3
AHK4
CKI1
CKI2
ETR1
ETR2/EIN4
Is there any specificity in plant
MSP?
□ Is there a signalling specificity of MSP in plants?
Specificity of CKI1 signalling
□ CKI1 interacts in vivo with only subset of AHPs
BiFC Y2H
AHP1
AHP2
AHP3
AHP4
AHP5
AHP6
CKI1 CKI1RD
Pekárová et al., Plant Journal (2011)
Specificity of CKI1 Signalling
□ Specificity of CKI1 interaction was confirmed in vitro
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
0 50 100 150 200 250
AHP concentration [nM]
A450
AHP2 AHP3 AHP5
AHP3: Kd ~ 10,5 nM
AHP2: Kd ~ 9,17 nM
AHP5: Kd ~ 108 nM
Pekárová et al., Plant Journal (2011)
Structure of CKI1RD
□ X-ray crystallography revealed conserved (α/β)5 structural fold
of CKI1RD
Pekárová et al., Plant Journal (2011)
Dynamics of CKI1RD
□ Mg2+binding leads to remodelling of active centre of
CKI1RD
Pekárová et al., Plant Journal (2011)
CKI1RD structural changes are
associated with its binding specificity
□ Mg2+- and BeF3
--induced structural changes fine-tune
binding specificity of CKI1RD
Pekárová et al., Plant Journal (2011)
AHP1
AtHK1
AHP2
AHP3
AHP4
AHP5
AHK2
AHK3
AHK4
CKI1
CKI2
ETR1
ETR2/EIN4
Model Suggestion
□ YES, there is signalling specificity of MSP in plants.
P
P
P
P
P
P
P
 Funkční význam specifických interakcí proteinů v
regulaci genové exprese
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Stabilita proteinů
 Přenos signálu
 Metody analýzy proteinových interakcí in vivo
 Koimunoprecipitace
 Tandemová afinitní purifikace (TAP-tag)
 Kvasinkový dvouhybridní test (Y2H)
 Bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC)
 Analýza zprostředkované membránové vazby (MeRA)
 Praktické využití metod pro studium PI in vivo
Shrnutí
Diskuse