CG020 Genomika Přednáška 5 Genová exprese a chemická genetika Jan Hejátko Funkční genomika a proteomika rostlin, Mendelovo centrum genomiky a proteomiky rostlin, Středoevropský technologický institut (CEITEC), Masarykova univerzita, Brno hejatko@sci.muni.cz, www.ceitec.muni.cz  Zdrojová literatura  Karaiskos N, Wahle P, Alles J, Boltengagen A, Ayoub S, Kipar C, Kocks C, Rajewsky N, Zinzen RP (2017) The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution. Science 358: 194-199  Lecuyer, E., Yoshida, H., Parthasarathy, N., Alm, C., Babak, T., Cerovina, T., Hughes, T.R., Tomancak, P., and Krause, H.M. (2007). Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell 131, 174-187.  Nevo-Dinur, K., Nussbaum-Shochat, A., Ben-Yehuda, S., and Amster-Choder, O. (2011). Translation-independent localization of mRNA in E. coli. Science 331, 1081-1084  Schonberger, J., Hammes, U.Z., and Dresselhaus, T. (2012). In vivo visualization of RNA in plants cells using the lambdaN(22) system and a GATEWAY-compatible vector series for candidate RNAs. The Plant journal : for cell and molecular biology 71, 173-181.  Surpin, M. and Raikhel, N. (2004) Traffic jams affect plant development and signal transduction. Nature Reviews/Molecular Cell Biology 5,100-10  Zouhar, J., Hicks, G.R. and Raikhel, N.V. (2004) Sorting inhibitors (Sortins): Chemical compounds to study vacuolar sorting in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., 101, 9497–9501 Genomika 05  Metody analýzy genové exprese  Kvalitativní analýza exprese genů  Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s reporterovým genem (gen zpravodaj)  Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s reporterovým genem  Využití dostupných dat ve veřejných databázích  Tkáňově a buněčně specifická analýza genové exprese  Kvantitativní analýza exprese  DNA a proteinové čipy  Next gen transkripční profilování  Regulace genové exprese v identifikaci funkce genů přístupy získané funkce  T-DNA aktivační mutageneze  Ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese  Chemická genetika Osnova  Metody analýzy genové exprese  Kvalitativní analýza exprese genů  Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s reporterovým genem (gen zpravodaj) Osnova Příprava rekombinantní DNA □ Transkripční fůze s promotorovou oblastí  Identifikace a klonování promotorové oblasti genu  příprava rekombinantní DNA nesoucí promotor a reportérový gen (uidA, GFP) TATA box počátek transkripce promotor 5’ UTR ATG…ORF reportérového genu Genová exprese □ Transkripční fůze s promotorovou oblastí  Identifikace a klonování promotorové oblasti genu  příprava rekombinantní DNA nesoucí promotor a reportérový gen (uidA, GFP)  příprava transgenních organismů nesoucích tuto rekombinantní DNA a jejich histologická analýza Genová exprese GUS reporter in mouse embryos  Metody analýzy genové exprese  Kvalitativní analýza exprese genů  Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s reporterovým genem (gen zpravodaj)  Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s reporterovým genem Osnova □ Translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s repotérovým genem  Identifikace a klonování promotorové a kódující oblasti analyzovaného genu  příprava rekombinantní DNA nesoucí promotor a kódující sekvenci studovaného genu ve fůzi s reportérovým genem (uidA, GFP) TATA box promotor 5’ UTR ATG…ORF analyzovaného genu….ATG…ORF reportérového genu….....STOP Genová exprese □ Translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s repotérovým genem  příprava transgenních organismů nesoucích tuto rekombinantní DNA a jejich histologická analýza  oproti transkripční fůzi umožńuje analyzovat např. intracelulární lokalizaci genového produktu (proteinu) nebo jeho dynamiku Histone 2A-GFP in Drosophila embryo by PAM Genová exprese PIN1-GFP in Arabidopsis □ Translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s repotérovým genem Genová exprese  Metody analýzy genové exprese  Kvalitativní analýza exprese genů  Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s reporterovým genem (gen zpravodaj)  Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s reporterovým genem  Využití dostupných dat ve veřejných databázích Osnova Genová exprese □ Analýza exprese pomocí Genevestigator (AHP1 a AHP2, Arabidopsis, Affymetrix ATH 22K Array) Genová exprese □ Analýza exprese pomocí Genevestigator (AHP1 a AHP2, Arabidopsis, Affymetrix ATH 22K Array) Genová exprese □ Analýza exprese pomocí Genevestigator (AHP1 a AHP2, Arabidopsis, Affymetrix ATH 22K Array)  Metody analýzy genové exprese  Kvalitativní analýza exprese genů  Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s reporterovým genem (gen zpravodaj)  Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s reporterovým genem  Využití dostupných dat ve veřejných databázích  Tkáňově a buněčně specifická analýza genové exprese Osnova Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) □ High-Resolution Expression Map in Arabidopsis Root Expression Maps - RNA Brady et al., Science, 2007 □ High-Resolution Expression Map in Arabidopsis Root Expression Maps - RNA Brady et al., Science, 2007 □ High-Resolution Expression Map in Drosophilla Expression Maps - RNA Brady et al., Science, 2007 Nikos Karaiskos et al. Science 2017;science.aan3235 Expression Maps - Proteins Ponten et al., J Int Med, 2011 □ Human Protein Atlas □ Human Protein Atlas (http://www.proteinatlas.org/) Expression Maps - Proteins □ Human Protein Atlas (http://www.proteinatlas.org/) Expression Maps - Proteins  Metody analýzy genové exprese  Kvalitativní analýza exprese genů  Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s reporterovým genem (gen zpravodaj)  Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s reporterovým genem  Využití dostupných dat ve veřejných databázích  Tkáňově a buněčně specifická analýza genové exprese  Kvantitativní analýza exprese  DNA a proteinové čipy Osnova  DNA čipy  metoda umožňující rychlé porovnání velkého množství genů/proteinů mezi testovaným vzorkem a kontrolou  nejčastěji jsou používané oligo DNA čipy  k dispozici komerčně dostupné sady pro celý genom  firma Operon (Qiagen), 29.110 70-mer oligonulkleotidů reprezentujících 26.173 genů kódujících proteiny, 28.964 transkriptů a 87 microRNA genů Arabidopsis thaliana  možnost používat pro přípravu čipů fotolitografické techniky-usnadnění syntézy oligonukleotidů např. pro celý genom člověka (cca 3,1 x 109 bp) je touto technikou možno připravit 25-mery v pouźe 100 krocích) Affymetrix ATH1 Arabidopsis genome array  čipy nejen pro analýzu exprese, ale např. i genotypování (SNP polymorfizmy, sekvenování pomocí čipů, …) DNA Chips  DNA čipy, analýza výsledků  pro správnou interpretaci výsledků je nutná dobrá znalost pokročilých statistických metod  kontrola na přesnost měření (opakované měření na několika čipech se stejným vzorkem, vynesení stejných vzorků analyzovaných na různých čipech proti sobě)  je nutné zahrnout dostatečný počet kontrol i opakování  kontrola reproducibility měření (opakované měření s různými vzorky, izolovanými za stejných podmínek na stejném čipu-stejné podmínky proti sobě) Che et al., 2002  identifikace hranice spolehlivého měření nespolehlivé spolehlivé  konečně vynesení experimentu proti kontrole nebo různých podmínek proti sobě – vlastní výsledek  v současnosti je již velké množství výsledků různých experimentů lokalizovaných ve veřejně přístupných databázích DNA Chips  Proteinové čipy  čipy s vysokou denzitou obsahující řádově 104 proteinů  analýza protein-proteinových interakcí, substrátů kináz a interakcí s malými molekulami  možnost použít protilátky – stabilnější než samotné proteiny Protein Chips  Identifikace proteinů interagujících s cytoplasmatickou částí integrinu αIIbβ3 krevních destiček  exprese cytoplasmatické části jako fůzního peptidu biotin-KVGFFKR  analýza vazby s proteinovým čipem obsahujícím 37.000 klonů E.coli exprimujících lidské rekombinantní proteiny  potvrzení interakce pull-down analýzou peptidů i koprecipitací celých proteinů (chloridový kanál ICln)  další využití např. při identifikaci substrátů kináz, kdy substráty jsou navázány na čip a vystaveny působení kináz za přítomnosti radiokativně značeného ATP (768 purif. proteinů ječmene, z nich 21 identifikováno jako subtráty kinázy CK2α, Kramer et al., 2004) Lueking et al., 2005 Protein Chips  Metody analýzy genové exprese  Kvalitativní analýza exprese genů  Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s reporterovým genem (gen zpravodaj)  Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s reporterovým genem  Využití dostupných dat ve veřejných databázích  Tkáňově a buněčně specifická analýza genové exprese  Kvantitativní analýza exprese  DNA a proteinové čipy  Next gen transkripční profilování Osnova WT hormonal mutant Next Gen Transcriptional Profiling □ Transcriptional profiling via RNA sequencing mRNA Sequencing by Illumina and number of transcripts determination mRNA cDNA cDNA Results of –omics Studies vs Biologically Relevant Conclusions □ Transcriptional profiling yielded more then 7K differentially regulated genes… gene locus sample_1 sample_2 status value_1 value_2 log2(fold_change) test_stat p_value q_value significant AT1G07795 1:2414285-2414967 WT MT OK 0 1,1804 1.79769e+308 1.79769e+ 308 6.88885e-05 0,00039180 1 yes HRS1 1:4556891-4558708 WT MT OK 0 0,696583 1.79769e+308 1.79769e+ 308 6.61994e-06 4.67708e- 05 yes ATMLO14 1:9227472-9232296 WT MT OK 0 0,514609 1.79769e+308 1.79769e+ 308 9.74219e-05 0,00053505 5 yes NRT1.6 1:9400663-9403789 WT MT OK 0 0,877865 1.79769e+308 1.79769e+ 308 3.2692e-08 3.50131e- 07 yes AT1G27570 1:9575425-9582376 WT MT OK 0 2,0829 1.79769e+308 1.79769e+ 308 9.76039e-06 6.647e-05 yes AT1G60095 1:22159735- 22162419 WT MT OK 0 0,688588 1.79769e+308 1.79769e+ 308 9.95901e-08 9.84992e- 07 yes AT1G03020 1:698206-698515 WT MT OK 0 1,78859 1.79769e+308 1.79769e+ 308 0,00913915 0,0277958 yes AT1G13609 1:4662720-4663471 WT MT OK 0 3,55814 1.79769e+308 1.79769e+ 308 0,00021683 0,00108079 yes AT1G21550 1:7553100-7553876 WT MT OK 0 0,562868 1.79769e+308 1.79769e+ 308 0,00115582 0,00471497 yes AT1G22120 1:7806308-7809632 WT MT OK 0 0,617354 1.79769e+308 1.79769e+ 308 2.48392e-06 1.91089e- 05 yes AT1G31370 1:11238297- 11239363 WT MT OK 0 1,46254 1.79769e+308 1.79769e+ 308 4.83523e-05 0,00028514 3 yes APUM10 1:13253397- 13255570 WT MT OK 0 0,581031 1.79769e+308 1.79769e+ 308 7.87855e-06 5.46603e- 05 yes AT1G48700 1:18010728- 18012871 WT MT OK 0 0,556525 1.79769e+308 1.79769e+ 308 6.53917e-05 0,00037473 6 yes AT1G59077 1:21746209- 21833195 WT MT OK 0 138,886 1.79769e+308 1.79769e+ 308 0,00122789 0,00496816 yes AT1G60050 1:22121549- 22123702 WT MT OK 0 0,370087 1.79769e+308 1.79769e+ 308 0,00117953 0,0048001 yes Ddii et al., unpublished AT4G15242 4:8705786-8706997 WT MT OK 0,00930712 17,9056 10,9098 -4,40523 1.05673e-05 7.13983e-05 yes AT5G33251 5:12499071- 12500433 WT MT OK 0,0498375 52,2837 10,0349 -9,8119 0 0yes AT4G12520 4:7421055-7421738 WT MT OK 0,0195111 15,8516 9,66612 -3,90043 9.60217e-05 0,000528904yes AT1G60020 1:22100651- 22105276 WT MT OK 0,0118377 7,18823 9,24611 -7,50382 6.19504e-14 1.4988e-12 yes AT5G15360 5:4987235-4989182 WT MT OK 0,0988273 56,4834 9,1587 -10,4392 0 0yes  Metody analýzy genové exprese  Kvalitativní analýza exprese genů  Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s reporterovým genem (gen zpravodaj)  Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s reporterovým genem  Využití dostupných dat ve veřejných databázích  Tkáňově a buněčně specifická analýza genové exprese  Kvantitativní analýza exprese  DNA a proteinové čipy  Next gen transkripční profilování  Regulace genové exprese v identifikaci funkce genů přístupy získané funkce  T-DNA aktivační mutageneze Osnova  Metody identifikace funkce genů pomocí přístupů získané funkce  T-DNA aktivační mutageneze  metoda umožňující izolaci dominantních mutantů prostřednictvím náhodné inzerce konstitutivního promotoru, vedoucí k nadměrné expresi genu a tím odpovídajícím fenotypovým změnám  prvním krokem je příprava mutantní knihovny připravené pomocí transformace silného konstitutivního promotoru nebo zesilovače  následuje vyhledávání zajímavých fenotypů  identifikace zasaženého genu např.pomocí plasmid-rescue Gain-of-Function Approaches TF TF TF 40S 60S TF TF TF TF 40S 60S 40S 60S 40S 60S 40S 60S TF TF TF Activation Mutagenesis Izolace genu CKI1 - izolace genu pomocí aktivační mutageneze - mutantní fenotyp je fenokopií exogenní aplikace cytokininů (CKI1, CYTOKININ INDEPENDENT 1) *- Tatsuo Kakimoto, Science 274 (1996), 982-985 * * no hormones t-zeatin K1 K2plasmid rescue 35S::CK1 cDNA  Metody analýzy genové exprese  Kvalitativní analýza exprese genů  Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s reporterovým genem (gen zpravodaj)  Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s reporterovým genem  Využití dostupných dat ve veřejných databázích  Tkáňově a buněčně specifická analýza genové exprese  Kvantitativní analýza exprese  DNA a proteinové čipy  Next gen transkripční profilování  Regulace genové exprese v identifikaci funkce genů přístupy získané funkce  T-DNA aktivační mutageneze  Ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese Osnova  Systémy regulovatelné genové exprese  umožňují časovou nebo místně specifickou regulaci genové exprese, vedoucí ke změně fenotypu a tím identifikaci přirozené funkce genu  pOP systém Regulated Expression Systems 35S LhG4 pOP TATA CKI1 activator reporter activator x reporter x Regulated Expression Systems 35S LhGR pOP TATA CKI1 activator reporter activator x reporter DEX DEX +DEX DEX DEX DEX x Regulated Expression Systems 35S LhGR pOP TATA CKI1 activator reporter activator x reporter DEX DEX +DEX DEX DEX DEX x pOP TATA GUS DEX DEX wt Col-0 4C Regulated Expression Systems  Systémy regulovatelné genové exprese  umožňují časovou nebo místně specifickou regulaci genové exprese, vedoucí ke změně fenotypu a tím identifikaci přirozené funkce genu  pOP systém  UAS systém http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/ Regulated Expression Systems  Metody analýzy genové exprese  Kvalitativní analýza exprese genů  Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s reporterovým genem (gen zpravodaj)  Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s reporterovým genem  Využití dostupných dat ve veřejných databázích  Tkáňově a buněčně specifická analýza genové exprese  Kvantitativní analýza exprese  DNA a proteinové čipy  Next gen transkripční profilování  Regulace genové exprese v identifikaci funkce genů přístupy získané funkce  T-DNA aktivační mutageneze  Ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese  Chemická genetika Osnova  Nové trendy  pojem chemická genetika – více než 50.000/89.631 záznamů v databázi PubMed (16.10. 2008/29.10. 2015, nárůst 65%)  chemická genetika Chemical Genetics  Nové trendy  pojem chemická genetika – více než 50.000/82.357 záznamů v databázi PubMed (16.10. 2008/23.10. 2014, nárůst 65%)  podobně jako v případě genetiky, existují i zde přístupy „přímé“ a „reverzní“  oproti přístupům „klasické“ genetiky není předmětem zájmu gen ale protein  chemická genetika se snaží identifikovat buď cílový protein po chemickém působení a následných fenotypových změnách („přímá“ chemická genetika) nebo naopak chemikálie schopné interakce s proteinem zájmu („reverzní“ chemická genetika)  za tímto účelem jsou prováděna vyhledávání v knihovnách nejrůznějších chemických látek (tisíce položek, komerčně přístupné)  příklad: analýza endomembránového transportu u rostlin  chemická genetika Chemical Genetics  Analýza mechanismů endomembránového transportu přístupy chemické genetiky  v rostlinných buňkách dochází k velice dynamickým procesům, zprostředkovávaným zejména tzv. endomembránovým transportem (viz film, GFP směřované do ER) Chemical Genetics  Analýza mechanismů endomembránového transportu přístupy chemické genetiky  v rostlinných buňkách dochází k velice dynamickým procesům, zprostředkovávaným zejména tzv. endomembránovým transportem (viz film, GFP směřované do ER)  endomembránový transport je důležitým regulačním mechanismem při přenosu signálu a regulaci buněčných procesů Chemical Genetics Richter et al., E J Cell Biol (2010) Anterograde transport Retrograde transport Trans-Golgi network Multivesicular bodies-late endosome (prevacuolar compartment) Recycling endosome  Analýza mechanismů endomembránového transportu přístupy chemické genetiky  pomocí vyhledávání v „knihovně“ chemických látek byly identifikovány takové, které vedou u kvasinek (S. cerevisiae) k sekreci enzymu (karboxipeptidázy Y), která je normálně transportována pomocí endomembránového transportu do vakuoly  analýza změny sekrece pomocí dot-blotu a imunodetekce karboxipeptidázy Y v kultivačním médiu pomocí monoklonálních protilátek Zouhar et al., 2004 chemická struktura sortinů detekce vakuolárního fenotypu (tvaru tonoplastu) kvasinek pomocí barvení specifickou barvou (MDY-64) Imunodetekce karboxypeptidázy Chemical Genetics  Analýza mechanismů endomembránového transportu přístupy chemické genetiky  pomocí vyhledávání v „knihovně“ chemických látek byly identifikovány takové, které vedou u kvasinek (S. cerevisiae) k sekreci enzymu (karboxipeptidázy Y), která je normálně transportována pomocí endomembránového transportu do vakuoly  identifikované látky („sortiny“) byly schopny vyvolat obdobné změny i u Arabidopsis - konzervované mechanismy transportu u kvasinek i u rostlin  analýza změny sekrece pomocí dot-blotu a imunodetekce karboxipeptidázy Y v kultivačním médiu pomocí monoklonálních protilátek  pro bližší identifikaci molekulárního procesu ovlivněného jedním z identifikovaných „sortinů“ byla provedena analýza jeho vlivu na sekreci markerového proteinu (AtCPY) – sortin 1 inhibuje specificky pouze tuto sekreční cestu  pomocí EMS mutageneze identifikace mutantů se změněnou citlivostí k sortinu 1 (hyper- nebo hyposenzitivní mutanti) Zouhar et al., 2004 tvar rostlinných vakuol pomocí EGFP:-TIP fenotyp semenáčků v přítomnosti sortinů Sortin 1 Sortin 2 Chemical Genetics  Analýza mechanismů endomembránového transportu pomocí chemické genetiky - shrnutí  GFP::d-TIP značení mebrány vakuoly (tonoplastu) a identifikace mutací vedoucí ke změně morfologie tonoplastu  chemická genetika v kombinaci s klasickou genetikou - identifikace proteinů zúčastńujících se regulace endomembránového transportu  proteomické přístupy – identifikace a analýza proteomu vakuol Chemical Genetics Diskuse