ODOnonononono DODODOnononoa ODODODOnonono DODODOnononoa O d o d o "CL'7 o n o d o Š o dQ4.NA^^° ° ODODOuv^uODODO DODODODODODOD ODODODODODODO I IUI | MASARYKOVA UNIVERZITA □ O o □ □ o o □ □ o o □ D O O D □ O O □ □ O O D □ O O □ □ O O □ D O O □ □ O Design sekvence PCR primerů Hana Konečná CEITEC - MU Centrální laboratoř - Proteomika Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky. MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, mládeže a tělovýchovy EVROPSKÁ UNIE H INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ OP Vzdělávání pro konkurenceschopnost tin (soudoi|3seoiiejiD|uo)| aid ju?A?ispzA dO JNVAVlSaZA 3ÍOAZOH Od 3 D 11 S 3 A N I AAOHOAA0131 v azaaynm ■ ^4 lINnvXSdOUAl 'JA±S~IO>H§ OA±SH3±SINIIAI Á>|!|qnd3j a^saj wa^odzoj wiiqeis e uiapuoj iuiu|epos wA>|sdojA3 ueAODui2uyn|ods aí )>{9[ojd 0}uai B>)ZB>in B>)0!l>lBJd L OOIIO eJBMJios JUBAOl|JABU ÁpBSBZ 90U9A>|9S Uß|S9p Aaii03i>inNOono ÁJ!|BA>| B|OJJUO>| 80B>|!|und BZ9JUÁS 90B>|!I!P0LU 90B>|!|dB 90|U!|9p ododododododo dodododododod OaODOn^nODODO viizyaAiNn VACWAWSVW ODODOl^^^jODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz ODODODODODODO oligonukleotid orientace! polymeráza! )H 5' end HJ krátká jednořetězcová struktura DNA nebo RNA (event. PNA) hydroxyl na obou koncích (normálně na 5'- konci fosfát) oligonukleotid o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o ODODODODODODO Aplikace syntetických oligonukleotidů • primery pro syntézu komplementární DNA PCR, Real-Time PC R • syntéza genů a rekombinantní proteiny • hybridizační sondy pro klonování • místně cílená mutageneza • sekvenování a genetické profilování • diagnostika-testy a biosensory • gene arrays • blokace genové exprese antisense oligo • potenciální léčiva a DNA vakcíny • NMR studia interakcí DNA-protein • strukturální rentgenová analýza NA 3ie6nfuoo □ odododododod ododododododo □ Odododododod ododododododo □ Odododododod (X. a _0-d = 0 (jeßns) aßp|jq JS}saipogdsoL|d VNd j>|no ezeq 80Z8J8J 80U0>| 0OB>l!i!PO|A| ododododododo ododododododo zD-mnui-MMM VlIZ^BAINfl VAO>IAWSVW 111111SI i 1111 ododododododo dodododododod ododododododo VlIZäBAINfl VACMAWSVW o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ 0 □ 0 □ 0 □ o □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ 0 o □ □ 0 o □ □ 0 o □ □ o MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ □ o □ o □ o □ o 1 i i i 1 Ě Ě Ě Degenerované oligonukleotidy Příklady: ACG TAC GTA CGT ACG TAC nedegenerovaný ACG TAM GTA CGT ACG TAC M = A/C ACG TAC GTA CDT ACG TAC D = A/G/T ACG TAC GTA CGT ACG NAC N = A/C/G/T o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o ododododododo Degenerované oligonukleotidy 2-deoxyinosin dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod M A or C R A or G W A or T S C or G Y C or T K G or T V A or C or G H A or C or T D A or G or T B C or G or T N G or A or T or C X G or A or T or C o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o ooononononono Modifikace na 5'- konci postsyntetické modifikace sekvenování fragmentační analýza gene arrays Real-Time PCR □ OdodododOdOo odododooododo □ ODODODOnonon ODODODODODODO □ODODODOnonon 5' fosforylace aminoskupina thioskupina digoxigenin biotin enzymy psoralen akridin cholesterol fluoresc. barviva zhášedla 2,4-dinitrofenyl TBR-chelát spacer větvení blokáda o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o Modifikace na 3'- konci 3' derivatizovaná matrice fosfát thioskupina —- aminoskupina spacer akridin —- biotin —► fluorescbarviva —- zhášedla cholesterol 2,4-dinitrofenyl nODODODOnonon oaoaODOoonono □ ODODODOnonon ODODODOnonono noDODODononon o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o Real-Time PCR • 2x značená sonda • REPORTER • QUENCHER nOHWARD PPIMĽP. ncvcpic Pllľ/ĽP 2, Strand displacement: When the probe is intact, the reporter dye emission is quenched. r i a1 5_9, ľ ľ □ ODODODOnonon odododooododo □ ODODODOnonon ODODODODODODO □ odododododod 3, Cleavage: During each extension cycle, the DNA polymerase cleaves the reporter dye from the probe. r-a- ■■-r -*- B' 4, Polymerization completed: Once separated from the quencher, the reporter dye emits its characteristic fluorescence. ľ B' o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ g i g g g 1 1 g 1 1 g Další modifikace fosforothioáty <-páteř fosforodithioáty H-fosfonáty metylfosfonáty cukr modifikace v 2'pozici modifikace ribózové jednotky □ ODODODOnonon OdODODOnonono □ oaOnODOnonon onononononono □ ononoDODODOn o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o o □ □ o o □ □ 0 o □ □ o o □ □ 0 o □ □ o o □ □ o MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ lil o m □ ra o ni □ ra o ni □ ra o ra □ ra o □ ra o Terapeutika nedegradována nukleázami! modifikace fosfodiesterové vazby 0 1 0 = P I o o = 0 1 p I o CH I 0 = P o phosphorothioate methylphosphonate phosphoramidate S "CH2 "O I I 2 l CH2 H3C-N 0 = P-BH3 I 3 I i 3 0 0 3'-thioformacetal methylene(methyliminio) boranophosphate □ ^^^^^^^^^^^^^^^^^ ODODODOnonono □ ODODODOnonon onoDODOcionoDO □ ODODODODODOn ODODODODODODO □ ODODODODODOD ISIÍIÍIÍIS!SI MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □ ODODODODODOD ODODODODODODO antisense oligonukleotid • oligonukleotid nebo analog • komplementární k segmentu RNA nebo DNA • vazbou inhibuje jejich normální funkci _ Antigene (triplex) dodododododoo ododododododo dodododododoo Ribozyme RNA s katalytickou aktivitou Antisense Sense/Aptamer ODODODODODODO DODODODODODOD ISIÍIÍIÍISIÍI MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz DODODODODODOD ODODODODODODO Peptidonukleová kyselina pna N-terminal nenabitá molekula vazba k DNA/RNA N-(2-aminoethyl)-glycin DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD HN O r Repeat J Unit C-terminal j. i s v v. DNA 3'-end ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz Peptidonukleová kyselina • nenabitá molekula • vazba k DNA/RNA PNA DNA Kl L. N-(2-aminoethyl)-glycin DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD DNA ODODODOaODODO □ ODODODOOOOOD IlIIIIIIIIiii MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □onononoooooo ODODODOQODODO Vlastnosti PNA • vysoká termostabilita • Tm nezávisí na obsahu solí • vyšší specifická • vyšší afinita • rezistentní k enzymům... Gambari R. Expert Opin Ther Pat. 2014, 24(3):267-94. Peptide nucleic acids: a review on recent patents and technology transfer. ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz LNA Locked Nucleic Acid 2'-0, 4'-C methylenový můstek o=P—O" potlačená flexibilita ribofuranožového kruhu struktura je zamčena do rigidní C3-endo konformace zlepšená hybridizace výjimečná biostabilita Molecular Therapy (2012); 20 8, 1590-1598. LNA-based Oligonucleotide Electrotransfer for miRNA Inhibition ododododododo □ odododododod onononononono nonononononon Onononononono nonononononon onononononono onononononono MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz OLIGONUKLEOTIDY design syntéza purifikace EXPEDITE 8909 nonononononon onononononono nonononononon onononononono nonononononon ODODODODODODO □ ODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz Syntéza oligonukleotidu • syntéza na pevné fázi • od 3'-konce k 5'-konci • bezvodé prostředí o ll CH-~ C — O E 1 O II E O n \ HO-^ -o— p -o—v II o- -OH Step 3. Capping o-m Cleavaga/Deprotection DMT- O - O- p -o -v - o - tm N Step 4. Oxidation DMT- O O— p -o - on Step 2. Coupling O -i - O - ODODODODODODO □ ODODODODODOD ododododododo □ odododododod ISIÍIÍIÍISIÍI MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □ odododododod ododododododo Kontrola kvality HPLC Perfúzní chromatografie anex RP uuuuuDuauuuuu dodododododod ododododododo dodododododod o □ o □ o □ on o □ ono □ ono □ ono n o □ o n o □ o □ o □ on o n ono □ ono o □ o □ □ 0 ono □ on n o o □ non ono MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □ o □ o □ ono □ o □ on o □ o □ o □ on o □ ono o n o n 1341ong.bio - 20.Opi Perfúzní chromatografie 0.15 0.10- klasický sorbent POROS nonononononon onononononono nonononononon onononononono nonononononon 0.05- 0.00 4 nxljuuiu 5 10 15 20 25 30 35 /^ÍQ> Min (-- 134.bio - 20.0ul 100 m 0.15- 0.10- m 0.05- 0.00 0.0 JV.----- V- 2.5 Min 100 50 m MM oodododododod ododododododo I o H □ N rO U •f ™ Mt ■t C/3 9 3 £011 it 001 30 SIAI d01-!P|B|Aj ododododododo ododododododo zD-mnui-MMM VlIZ^BAINfl VAO>IAWSVW II I II II II II II ododododododo dodododododod ododododododo VlIZäBAINn VACMAWSVW o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o ododododododo v v VYTEZEK 1.000 0.900 0.800 0.700 0.600 Yield o.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 □ □ O. o- -Q □ tJ □ U Efficiency ■ 0.995 ■ 0.990 □ 0.980 PAGE 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Oligonucleotide Length □ odododododod ododododododo DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD OldH -X8pei|d8s« 30v>iidiynd o D O D O □ O D O D O D O D O D O D O D O D O D O D ZD'jUnUJ-MMM VllZyBAINn VACMAWSVW o D D O O D D O O D D o O D D O O D D O O D D O O D o D O D O D O D O D O D O D O D O D O D O D O D O D o D O D O D O D O D O D O o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o ododododododo DESIGN OLIGONUKLEOTIDU • manuální • počítačový www.protocol-online.org/prot/Research_Tools/Online_Tools/Oligo_Design/index.h Hlavní kritéria pro sekvenci PCR primem • vysoce specifické • netvoří dimery a vlásenky • stabilní duplexy s aktivní sekvencí • nepříliš stabilní 3'-konec ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO □ ODODODODODOD ODODODODODODO MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz ODODODODODODO OLIGO 6 PCR primery, hybridizační sondy sekvenační primery OLIGO 7 (od roku 2008) • TaqMan sondy • primery pro nested PCR • molecular beacons siRNA ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz Terminologie PCR primem forward primer... část sekvence + vlákna reverse primer... část sekvence - vlákna pos: 350 tm: 57.1 ,,260, ,|27Ů, , 2GD _ ,,290, , i300 , , 31-Ü _ , 32Ů _ , 330 _ , 340 _ CCTGGCTíTGACTACTCA ►>■►►*■......►......►......► ► ► ► i hhhhhhthhth TTAATGC CTG G CTGTGACTACTCAC E E E E EAAGGATGGTATTGAGC CTATGTG G G AAG A GAGAAAAACAAAC GGGGAGGACGATG G CTAATTACATTGAACAAACWSCAíACACG AACTÍACC C m™cggaccgacactgatgagtgaaaaattcctaccataactcggatacacccttctactc i i i i igtttgcccctcctgctaccgattaatgta; tCTTGTTTGTC GTCTCTG CTTC ACTG G ag LMPGCDY5 L F K D -G IE P M i E DE KNKRGGRi ITL N K Q Q R R 5 DL UPPER - FORWARD - LEFT 5'-► + 5'-- 3'- DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ■ 3' ■ 5' 5' LOWER - REVERSE - RIGHT o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o ododododododo Terminologie forward primer... část sekvence + vlákna reverse primer... část sekvence - vlákna pos: 350 tm: 57.1 , 2G0 _ ,,290, ^33 1-3 12-i 111 ľ--) ll-i IM 170 TTAATGC CTG G CTGTGACTACTCAC1 111IAAGGATGGTATTGAGCCTATCTG G GAAGATGACAAAAACAAAC GGGGmGGACGA GG CTAATTACATTGAmCAAAtACt ACACAt CAACTCAtt C AATTACG GAC C GACACTGATGAGTGAAAAATTC CTAC CATAACTC G GATACAC C CTTCTACTCTTTTTGTTTGCCCCTCCTGCTACC GATTAATGTAACTTGTTTGTCGTCTCTG CTTCACTG GAG H H H i H H * ACTC G GATACAC CCTTCTACTC LMPGCDY5 L FKDCIEPHWEDEKNKRGGRW ITL NKQQRR5DL UPPER - FORWARD - LEFT 5' » polymeráza + 5] ^=^=| 3' - 3'- 5' polymeráza * 5' LOWER - REVERSE - RIGHT dodododododoo ododododododo dodododododoo ododododododo dodododododod o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o ODODODODODODO Nasedání PCR primerů pos: 350 tm: 57.1 , 2G0 _ _ 1290 _ Ö33 l. 3 120 33Ü l'-O ll-i 100 170 TTAATG C CTG G CTGTGACTACTCACf 1111AAG GATG GTATTGAGGCTATGTGG GAAGATGAGAAAAACAAAC GGGGAGGACGA GG CTAATTACATTGMACAMCAGCAGAGA«AAGTGAtt C AATTAC G GAC C GACACTGATGAGTGAAAAATTC CTAC CATAACTC G GATACAC C CTTCTACTCTTTTTGTTTG C C C CTC CTG CTAC C GATTAATGTAACTTGTTTGTCGTCTCTG CTTCACTG GAG h h h i h h h ACTC G GATACAC CCTTCTACTC L M P G t D Y 5 L FKDGIĚPMWĚDĚKNKRGGRW ITL N K Q Q R R 5 Q L UPPER - FORWARD - LEFT + 5'-- 3'- 5' □ ODODODOnonOö ODODODODODODO DODODODODODOö ODODODODODODO DODODODODODOD 5' 3' 5' LOWER - REVERSE - RIGHT o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o ODODODODODODO 5'CTTCTGCTCAATCTTTCTAC 3' FORWARD + X' 1 ATGGÍTTCTG CTCAATCTTT CTACAáCCAA AGCTCTGTCT TGAAAATCAA 51 TGTCÁI I I (j I LlkLLkl (j Ál CäTGTTTT CCTTGATATC ATGTCACGCA 101 TGCTTCAACA CTCCAAATAC AGAGGTAATT AAATATTATT ATCATATTAT 151 ATATAATATG TTATTGATTT TTTGTTTGTG ATTTCATTTA GATTTTTATT 201 TCTATGATTT CTTAGCATGA AATACAATTT TTGGAGAAAC AACTAGCAGT 251 TTTAAAAACA AAACTTGAAT TTTGAGAAAT TCAAAGATGT TATATATATA 301 TGTCAAAATT TAACAATTAT TCTTCTAAAT CATCCGGATT CCGTTTACAT 351 GTACACATCT ACAATTTTCA ATTGAGGTAT TCTTGTTTTG ATGCCTTTGA 401 GACGAATAGT TTGATTGATA AAAAAAATTC TAACCAATAT GATATATAAA 451 GTTTATTTTC TTTTTGTCAA ACCATACTTT ATACTATGTA ACTTTTTTAA 501 GAGATTATTG AAAATAGTTT ATTTATAAAA TAGTAACCTA TTGTTGAATT 551 AAAAAAAAAA A A A A A ATTfJT A A ATT GTGTT TGCAAACGAC ATGTGATTTA 601 TCTTAGTTTA |\AACTAGCTG ATATTCTTCA AfTCGACTGT TCTTATAAGT 651 AATCAACCAArTAOCATCM TCACAATAM TTGTAAACAC TTCAATGAAA 701 ATGGTGATTT TAAAGAATAT GTTTTACTTA TGTTATGAAC TATCTCAAAT 751 TTGTGAAATA TTTCATAACT AATGTGGAAA ACTATATAAC CCCTCCATAC 801 AAAACGTAAG TAAAATTTAT GAAATCCTAT CATTTTTAAA GGTTAAACCA 851 ATCAAAAAGT AATAATTCTT GGTACTTGCA ATATTTTTGT CATTATATTT 901 TAGTTTATTA ATTTTATTTT GATTAAATGG TTTTAGATCC ATCAGTTATG 951 GAGATCGCAG TTATAGCTGT AGACGATCCG AAGAAAGCAT TATCTACTCT 1001 AAAAATTCAA CGAGACAATA TAGATCTCAT AATCACAGAT TATTATATGC 1051 CTGGTATGAA CGGTTTACAA CTCAAAAAAC AAATCACTCA GGAATTTGGA 1101 AATTTACCGG TCTTAGGTAA CATTTTTTGT TCTTTACAAC TTAAATTAAA 3' 5' TGA-AGA ATA TCA GCT AGT TT 3' REVERSE ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD □ ODODODODODOD ODODODODODODO □ ODODODODODOD m 1 111 iy55y»H)l303iWd3I50)ldlSAG35dWl 3i_)Vi_>iJ3_>_>V3VlV_>_>_>J3V......... [I VD DID VDIID DIDIDID DIDiJID JJJ W1D1WLLVD D DV1D DID DID D D D D HID1 1 1 1 1D1DV1D J_LD D D VD VLVD D DID WLVD D VLD D JJ.WWVD1D VD1VD1D VD VD D D VD D D VLLW J1IDV3VVDI)V3VDVIHVI)VW J Vtf H ±i¥ J ¥MWlOOOlV*)I)¥ 3 HVH H H [i J ?YY ^VWW-JTOIV H gV H H [liMVJJ^BTOilVJJBlV'MVV 11111 DVDiDViDVDiDiD[iDiDDDiWli ........i.........i....... CiE GSE i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i oh1 c-^ oor ce; usz' ogz' rzs :uji □St :sod ■ — ■ .......■ h ■ ■ ■. ..11L ■ 1 ■'■ . -- 1 ... |. Z m .1........ MM '......1 ' .. ■ 1 ■■ ^ -^- _ noai1 noil1 nmi1 post1 doh1 (JOEt1 go?!1 noil1 nonr one-1 ohr1 on.;1 oarv ms1 on-?1 KJE1 m?' KIT' [ wnpoJdUDd err 3,E'GS :ml (XT zz tsz e 07 9SE : 110414 sod — Oujio jaddn o iu 1Z :i|l6uari Oujio luajjrQ IS9"I sod Z ST BZE jthuuj d-;.J3.V3V| e T + :slutjjj uUjptjay OBttrsi- T ST 6SZ J3LUU(j pjTJMJOJ e ClT iu B9B1 :i|l6uar| 33U3nbas □unieaj # uo!i!?oj □nianbag VMG aiMjanbas ooe ODODODODODODO ODODODODODODO zD-mnui-MMM VllZ^3AINn VAO>IAWSVW 111111SI i 1111 ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o o □ o □ c □ ono: o □ o □ c □ ono: OO Search for Primers & Probes — Search Options Subsearches Search in: iVf + Strand 5? - Strand Search Mode: @ Select Verify 5? Complex Substrate ® PCR Primers Compatible with the Q Forward Primer Q Reverse Primer 0 TaqMan Probes & PCR Pairs Compatible with the _ Upper Probe w Lower Probe 0 Molecular Beacons & PCR Pairs O Nested Primers Sequencing Primers C Hybridization Probes siRNA Probes After successfull search show: All Results Search ( Cancel ) ( Apply ) i Parameters ) ( Ranges ) ( Defaults ) ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz c r. e™ Search for Primers & Probes Search Options Subsearches* Search method: Compatible Pairs 5! Eliminate Ambiguous Bases 0 Duplex-free Oligonucleotides 0 Highly Specific Oligonucleotides (3'-end Stability) _ 5'-end Stability _ siRNA Internal Stability 0 Oligonucleotides with GC Clamp 0 Oligonucleotides within Selected Tm Limits Hairpin-free Oligonucleotides ^ Eliminate Mono- and Di-Nucleotide Repeats 0 Detect Sequence Repeats B Eliminate Frequent Oligonucleotides Omit High Secondary Structure Regions in the Template Check Primers/Probe Sequence Constraints 0 Restrict the Number of C Bases B Eliminate False Priming Oligonucleotides and _ Continue Above Search in Other File(s) _ Consensus Primers Search ) ( Cancel ) ( Apply ) ( Parameters ) ( Ranges ) ( Defaults ) ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz File: I 0O PCR File: Human 4E.seq Optimal Annealing Temperature: 50.S T (Max: 66.3 T) Product Tm - Reverse Primer Tm Primers Tm difference: L6 "C 23.6 °C Comments: Concentration Forward Primer 200.0 nM Reverse Primer ZOO'.O nM Upper Oligo 200.0 nM Lower Oligo 200.0 nM Monovalent Cation 50.0 mM Free Mg[2+| 0.7 m M f Position and Length GCpť| P.E# Score Product S62 78.9 29.6 n/a 697 Forward Primer 9LS 56,9 45.5 47L/47L S40 Reverse Primer L753 27 55.3 29.6 4S9 / 4S9 S34 Upper Oligo 979 24 55.5 33.3 479 / 479 9L7 Lower Oligo L694 23 55A 39. L 45? í 457 64 L Total Na[+] Equivalent: mM ododododododo dodododododod ISIÍIÍIÍISISI MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □ odododododod ododododododo □ odo eeo Selected Primers Tile: BRCA2 gene.seq AY436640:L543Sr22 AY436640:L59L7R20 5' C A ATATATA C C GTA CTC C C CTA 3' 5' CA C CTA C ATATTA C C C C A C A 3' Length: 22-mer Length: 20-mer 5core: 802 points Score: 9L4 points 5' Position: 15438 3' Position: L59L7 "I'm ■ 53.4 52.6 °C Tm/tm: 53. L 53.8 °C AC/Ag (25 °C): -30.5 -29.2 kcal/mol AC/Ag (25 '0: -28.6 -28.5 kcal/mol AS/As: -472.L -449.5 cal/ůK*rnol A5/As: -430.5 -4L9.6 cal/ůK * mol AH/Ah: -L7L3 -L63.2 kcal/mol AH/Ah: -L57.0 -L53.6 kcal/mol 3'AC: -6.5 kcal/mol 3'AC: -6.9 kcal/mol Degeneracy: ___1 Degeneracy: ___1 P.E.#: (443/443) P.E.#: (477/477) 1/E: 4^63 nm ol /A2 G0 L/E: 5^05 nm ol /A2 G0 3L.L ug/A2G0 3L.0 Mg/A260 Priming Efficiency PE Score o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o ododododododo eoe_ 1 File: BRCAZ gene.seq Current Oligo 21-rner [5042] Current Oligo Duplexes • HAIRPIN intramolekulärni DIMER intermolekulärni [Current t ON go! - The most stable 3-dinier: £ of hydrogen bonds = 10: AG = -0t7 kcal/mol 51 GAATrAGATAAArrCAAArrA 31 III II II III V ATTAAACTTAAATAGAITAAG 5r [Current- ON go! - The most stable 3-dinier: tfof hydrogen bonds = L0: AG = -7.3 kcal/mol; Tm = 2.9°C 5 1 TAArrTOAATTTATCTAATTC 3 f I I I I I I I I I I 3r CTTAATCTATTTAAGTTTAAT Sr The most stable dimer overall: # of hydrogen bonds = L0: AG = -7.4 kcal/mol; Tm = 2.2^ S1 LlAATTALlArAAATrCAAATTA 3' I I I I I I I I I I 3 ' ATTAAAC TTAAATAt]ATTAAt] 5 1 Hairpin: loop = 5 nt; AG = -3.0 kcal/mol; Tm = 54.6 °C I I I I I A 3 'ATTAAACTTAAAT-1 o □ o □ □ odo ODODODODODODO DODODODODODOD ISIÍIÍIÍISIÍI MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □ ODODODODODOD ODODODODODODO ooo Current Oligo Hairpin Stems File: BRCA2 gene.seq Current Oligo 21-rner [5042j L # of paired bases = 5; loop = 5 nt: AC = -3.0 kcal/rnol; Tm = 54.6 °C 5042 GAATT 5046 I I I 5056 CTTAA 5052 5 rCAArrAG--| 1 í 3 1 AT T AAAC ITAAAT -' 2. # of paired bases = 5; loop = 5 nt; AC = 0.2 kcal/rnol; Tm = 2L7 °C 5043 AATTACA 5049 5 16AATTAfiAí I I I I II I I I I II 5061 TTAAACT 5055 | 3 ' ATTAAACTTA 3. # of paired bases = 4: loop = 2 nt: AC = 0.9 kcal/rnol; Tm = 8.7 T 5052 AATT 5055 I I 506L TTAA 5053 5 1 GAATTAGATAAATTCn I I I I 3 ' AITAAAJ DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO ODODODODODODO MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz ©06 Reverse Primer False Priming Sites File: M13MP18 Reverse Primer M13MP18 6310R19 (positive strand) Priming efficiency of the perfect match is 482 (above the threshold) Priming efficiency. 482 (above the threshold) 5'(6328) GGTTTTCCCAGTCACGACG (6310)3' I I I I I I I I I I I I I I I I I I I 3*(6328) ccaaaagggtcagtgctgc (6310)5' Priming efficiency 244 (above the threshold) 5*(6328) GGTTTTCCCAGTCACGACG (6310)3* III I I I I MINI 3'(626) agcaaatggtc—tgctgc (610)5' Priming efficiency 193 (above the threshold) 5'(6328) GGTTTTCCCAGTCACGACG (6310)3' I II MINIM III 3'(5125) tctaagtggtcagtg-tgc (5108)5' □ O □ O u r^Tj u u u u o u o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ c MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o ODODODODODODO O ^ ^ Forward Primer Composition File: BRCA2 gene.seq Forward Primer AY436640 6275F19 64.2° (nearest neighbor method] Tm 56.5* [nearest neighbor method] Tm 7O.80 (XGC method) Tm 56' |2(A+TT + 4(G + C)' method) Tm(RNA)(lM Na] 8T (XGC method) Tm (DNA. RNA)[ 1M Na) 74.7° (XGC method] A2Gfj/A280 1.59 (single strand) Molecular Weight 5.8K [one strand] Molecular Weight 11.7K (two strands] ug/OD_ 47.4 (dsDNA) Base Number &% A 2 (10.5X) C S [26.3%] C 14 (21.1%) T_I 8 1*2.1X1 A + T 10 (52.6X1 CiC 9 (47.4X1 o □ ODODODODODw ododododododo dodododododod ISIÍIÍIÍISIÍI MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz dodododododod ododododododo ododododododo File: NewDatabase.cdb ONgonutleotide Database 9. 9L # of Records: 29 # Date i □ 21 12/02/06 e 22 12/02/06 □ 23 12/02/06 & 24 12/02/06 □ 25 12/02/06 □ 26 12/02/06 □ 27 12/02/06 □ 28 12/02/06 ID Number Sequence AY436640: AY436640: AY436640: AY436640: AY436640: AY436640: AY436640: AY436640: 5916R19 5916R20 5937R21 5937R22 4695U22 5325U22 57E6L23 5S60LL9 AATGCCTGCCTTTA CTCTG CAATGCCTGCCTCTAGTCTG TC A ATTTCTTTA GCTTGGCAT 3'-Dim.ůG P.E / p.e. Tm /tm TTG A ATTTCTTTA C GTTC C G AT TC C CTTAA C A A A A CTA ATCC AT AATTA C CTCTTTCTTATC CC AA CTCTCCCTA CAA CATTATCACTC AACAACCAAACCCAACCTC 0.3 n 3 sc 5C Selected oligo 0.3 5C 0.3 SC -0.3 sc -0.9 sc 430 430 54.1 366 450 50.9 ^49 449 54.7 Isa 45S 55.9 432 432 54.5 453 453 53.3 451 451 54.S 444 55.3 54.5 57.2 53.1 53.S 53.0 53.0 55.0 55.9 Oligonucleotide 5ets (64) o Forward Reverse Upper Lower # Primer Primer Oligo Oligo 1 2 i A 36 S 23 25 28 42 S 24 25 2S Checked Set of nested primers 47 9 15 25 27 9 16 25 27 9 17 25 27 4S 9 IS 25 27 This database is linked to BRCA2 gene.seq dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod oododododod odododododo □ ododododod odododododo o □ □ o o □ □ o □ -j J U F l juj- PUL- _■ ^ ._ _ -_ j P L- -U P jll ■n- ul jll UE_ L- U j F l l E- P P l. l. -o- -ľ '"íl U P I 008ZZ ZS99Z ZĹ E ÍBZ9Z OTZ Sŕ09Z OE Sfr09Z ZOfr Efr9SZ 9ES ŕOTSZ EŕZ frEBfrZ 151 ES917Z ssz SGEfrZ ZIE EBOfrZ 69E 19fr LZ 9ZZEZ S3 8ETEZ ES6ZZ ZZE TE9ZZ 9ĹZZZ- 9t 9-XV1ZW SOŕEZ ZSŕSZ IIZT TfrSfrZ 99E0Z Z SA^IZWH ŕSTSZ OOEfrZ US 69ÍEZ ^88 ZBBZZ 9EE 9frSZZ 19EZZ- V SW^HEAM |OD|M 9fr E6SťZ fr9BfrZ EťOOZ- ■ 1 gy^dvzvD |JVM 6SQEZ B6E9Z EZ9 SŕŕSZ 6 H 9Z9SZ EZS 98 ŕ96frZ 9BZT "[B9EZ frBOEZ EZBTZ- ■ t gyxvdZDV E9BZZ fr5S9Z OZfr frŕ!9Z ^s: ZB6SZ EŕZSZ 1SE ZZ51?Z Zŕ OSBfrZ ÍH S091?Z ZSZ 9ZEtZ TSE SĹbíZ SSE 0Z9EZ ŕBZTZ- ■ 01 SILNÉHO |unH E* EEOEZ frZfr9Z VrZ 0ST9Z 901 frŕ09Z 9ŕS B6frSZ frZSZ frŕ9ZZ EEZZZ- s Zfr 1SSZZ 9099Z 6IZ1 ŕBESZ SZ9 BSŕfrZ Z9I 96SfrZ SBS UOfrZ ZEZ frŕŕEZ ZS ZZŕEZ 89 frS9EZ ESZTZ- B 9 ANAZID |ud> HU 3 WEE J J |EdH IIIPUiH Idsj 01? 6E BE |35j ltd ?! 9E SE frE ŕ ontnz1 crnra1 ůdm?1 ůnřsr1 ůo-íeí1 cmtsž1 an/sr1 anůsrf dnít? an-st?1 anttz1 an/pr' anúpr1 Qiisrs-^ on^Fí1 áiwz1 anrr.r1 onůF.r1 ani:?1 wň?7x art?? sijuAzijg EE jjajojci u| sens sujAzu] uoiiuu^ay ododododododo ododododododo zD-mnui-MMM VlIZ^BAlNfl VAO>IA^IVSVW 111111SI i 1111 ododododododo dodododododod ododododododo ODODODODODODO DODODODODODOD iiiiliiiiiiii MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz DODODODODODOD ODODODODODODO , © O 1 ' Hybridization Time Tile: M13MP1S DNA Length: Concentration: ai 1 nt. 200.0 nM L29S pg/niL VÄ = 45.4 sec = 3 min 47 sec DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD ODODODODODODO DODODODODODOD o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o ododododododo © 0 O Concentrations File: HRCA2 gene.seq e Constant Concentration Constant Volume © Current + Oligo: (2/ Current +Oligo: 2 Entire Sequence (ds): Q Forward Primer: (3 Reverse Primer: 0 PCR Product (ds): (3 Upper Oligo: O Lower Oligo: 5.08 nmol/OD.32.5 ug/OD 4.67 nmol/ODr30.9 ug/OD 0.00L nmol/ODr 4S.L ug/OD 5.98 nmol/ODr 35.0 ug/OD 5.3L nmol/OD, 34.0 ug/OD 0.L46 nmol/ODř 48.L ug/OD 4.83 nmol/OD>31.2 ug/OD 4.67 nmol/ODř30.9 ug/OD 32.5 ug or or in yields L.O OD(260) 5.084 nmol 508.4 uL LO.O uM ododododododo dodododododod o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o ododododododo AHP2 cDNA (TAIR database)! Sequence: AT3G29350.1 Date last modified 2007-04-17 Name AT3G29350.1 Tail Accession Sequence:40 10737427 Sequence Length (lip) 827 1 ACAATTCGCG AGAAAGACAA AACACAAGTT TCTTCTTCTT GGGATTGGCT 51 ATTTCCAGAA ATCCAAGTCA ATAATCAAAG TCCAAACAAA AAAATCCTCT 101 CCCAATCTCC GCTTCACTCT TCTCATGGAC GCTCTCATTG CTCAGCTTCA 151 GAGACAATTT CGTGATTACA CCATTTCTCT CTACCAACAG GGGTTTTTGG 201 ATGATCAATT TACTGAGTTG AAAAAGCTAC AAGATGATGG AAGTCCTGAT 251 TTTGTGTCTG AAGTGCTTTC ACTTTTCTTT GAAGATTGTG TGAAGCTTAT 301 CAGTAACATG GCTAGAGCTT TGGACACGAC AGGAACTGTA GATTTTAGTC 351 AGGTAGGTGC TAGTGTGCAT CAATTGAAGG GTAGTAGCTC AAGTGTTGGT 401 GCCAAGAGGG TCAAAACTTT GTGTGTTAGC TTCAAGGAAT GTTGTGAAGC 451 TAAGAACTAC GAAGGGTGTG TGAGATGTTT GCAGCAAGTG GATATTGAGT 501 ACAAGGCGTT AAAGACAAAG CTTCAAGATA TGTTCAATCT TGAGAAACAG 551 ATCATTCAAG CTGGTGGTAT AGTTCCTCAA GTGGATATTA ACT AAA GAGA 601 CTAGTCCATA AGAAGAAAAA AG AT GATGAC TTTCTTTCTT TAGTTTCTCT 651 TCTAAATTAT TTTGGATTTG GTGTTTGCTC AAAAACTCAA TAAAATATGT 701 GCAAAAAGAA ACAAAAACAA GTGATGGTTG TTTATAAATC AGTAGTATGT 751 ATTGTTTGAT CTCATCCGAG AAAATTGAAA CCATTGGACT AATGAATGTG 801 ATGATAATAT ATATTGGTTT GCTTCTG □ odododododod ododododododo dodododododod o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o ododododododo 101 CCCAATCTCC GCTTCACTCT TCTCATGGAC GCTCTCATTG CTCAGCTTCA 151 GAGACAATTT CGTGATTACA CCATTTCTCT CTACCAACAG GGGTTTTTGG 201 ATGATCAATT TACTGAGTTG AAAAAGCTAC AAGATGATGG AAGTCCTGAT 251 TTTGTGTCTG AAGTGCTTTC ACTTTTCTTT GAAGATTGTG TGAAGCTTAT 301 CAGTAACATG GCTAGAGCTT TGGACACGAC AGGAACTGTA GATTTTAGTC 351 AGGTAGGTGC TAGTGTGCAT CAATTGAAGG GTAGTAGCTC AAGTGTTGGT 401 GCCAAGAGGG TCAAAACTTT GTGTGTTAGC TTCAAGGAAT GTTGTGAAGC 451 TAAGAACTAC GAAGGGTGTG TGAGATGTTT GCAGCAAGTG GATATTGAGT 501 ACAAGGCGTT AAAGACAAAG CTTCAAGATA TGTTCAATCT TGAGAAACAG 551 ATCATTCAAG CTGGTGGTAT AGTTCCTCAA GTGGATATTA ACTAAAGAGA EcoRI restriction site 5 ......gIaattc......3 3"......cttaa g......5' Design of primers AHP2 ex_np 5'- ccg gaa ttc atg gag ggt ctc att gct c ag - 33 AHP2ex_low 5'- ccg gaa ttc tta gtt a at atc c ac ttg agg - 3' o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o onononononono 101 CCCAATCTCC GCTTCACTCT TCTCgŤGGÄČ GCTCTCATTG CTCÄČJCTTCA 151 GAGACAATTT CGTGATTACA CCATTTCTCT CTACCAACAG GGGTTTTTGG 201 ATGATCAATT TACTGAGTTG AAAA4GCTAC A4GATGATGG AAGTCCTGAT 251 TTTGTGTCTG AAGTGCTTTC ACTTTTCTTT GAAGATTGTG TGA4GCTTAT 301 CAGTAACATG GCTAGAGCTT TGGACACGAC AGGA4CTGTA GATTTTAGTC 351 AGGTAGGTGC TAGTGTGCAT CAATTGA4GG GTAGTAGCTC AAGTGTTGGT 401 GCCAAGAGGG TCAAAACTTT GTGTGTTAGC TTCAAGGAAT GTTGTGAAGC 451 TAAGAACTAC GA4GGGTGTG TGAGATGTTT GCAGCAAGTG GATATTGAGT 501 ACAAGGCGTT AAAGACAAAG CTTCA4GATA TGTTCAATCT TGAGAAACAC 551 ATCATTCA4G CTGGTGGTAT AGTlfľCTCAA GTGGATATTA ACTA^AGAGA EcoRI restriction site 5 ......gI aattc......3 3"......cttaa g......5' Design of primers AHP2 ex_np 5'- ccg gaa ttc atg g ac gct ctc att gct ca g - 33 AHP2ex_low 5'- ccg gaa ttc tta gtt a at atc c ac ttg agg - 3' ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo dodododododod ododododododo ododododododo MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz LITERATURA I Artificial DNA: Methods and Applications; Khudyakov, Y.E., Fields, W.A., Ed. (2003) PCR Primer: A Laboratory Manual (2003) OLIGO Primer analysis software, Version 7 Expert Opin Ther Pat. 2014, 24(7):801-19. Oligonucleotide delivery: a patent review (2010 - 2013). AAPS Journal2009, 11(1): 195-203. Targeted Delivery Systems for Oligonucleotide Therapeutics Large-scale de novo DNA synthesis: technologies and applications Nature Methods 2014, 11 (5): 499 o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o o □ □ o MASARYKOVA UNIVERZITA www.muni.cz □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ o □ □ o □ o □ o □ o □ o 1 i g g g g 1 1 1 1 1 Discovery is not in seeking new landscapes, but in having new eyes... Marcel Proust Tato prezentace vznikla s podporou projektu OP VK „Rozvoj týmu pro výuku, výzkum a aplikace v oblasti funkční genomiky a proteomiký'{CZ. 1.07/2.3.00/09.0132) Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky. INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ