Příprava krevního roztěru příprava roztěru •Správně •Příliš tlustý •Moc krve •Nerovnoměrný tah •Třásla se ruka •Krev se •srážela • •Mastné •sklíčko Barvení roztěrů nStandardním barvením pro krevní nátěry je tzv. panoptické barvení dle Pappenheima. nPostup barvení: n n1. Celý nátěr na 3 minuty pokryjeme May-Grünwaldovým barvivem. n n2. Opatrně přikapáváme destilovanou vodu tak, aby se původní barvivo nesmylo. Cílem je nechat působit takto naředěné barvivo (1:1) další 1 minutu. n3. Barvivo slijeme, můžeme opláchnout vodou. n4. Na nátěr naneseme Giemsa-Romanowského barvivo. Toto barvivo musí být před barvením vždy čerstvě naředěné přibližně 1:9 (na 10 ml destilované vody 10 - 15 kapek barviva). Necháme působit přibližně 15 minut (10 - 20 minut). n5. Barvivo slijeme a důkladně opláchneme pod tekoucí vodou. n6. Spodní stranu sklíčka očistíme utěrkou. n7. Je vhodné ihned zkontrolovat probarvenost krevních buněk a eventuelně preparát ještě dobarvit. Barvení pomocí hotových barvicích sad nVýhody: nrychlé (cca 1 – 2 min) nroztoky již připraveny nvydrží dlouho (měsíce) nlze skladovat při pokojové teplotě npoužívají se opakovaně n nNevýhody: nNeposkytují tak dobré výsledky jako klasické barvící techniky nVe výzkumu nebo při hodnocení sporných patologických nálezu je lepší použít klasické techniky, přestože jsou časově náročnější •Příklady: •barvící sada Leukodif (Pliva Lachema) •Diff-Quik ( Medion Diagnostics) •Postup barvení : • •Roztěr musí být suchý • 1.Fixační činidlo (metanol) 5 x 1 s 2.Eozin 5 x 1 s 3.Azur 5-6x 1 s 4.Oplach (fosfátový pufr pH 7,4 nebo dest. voda) 5. •Nechat zaschnout a pozorovat pod imerzí •Mezi jednotlivými kroky neoplachujeme ani nesušíme Vyhodnocování krevního roztěru • Pozorujeme zásadně pod imerzí • • Správná oblast pro hodnocení: kde se krvinky příliš nedotýkají • V této oblasti prohlížet preparát při tzv. meandrovitém pohybu (C) • • Krevní diferenciál (dif): procentické zastoupení jednotlivých typů leukocytů • • Krevní obraz: kompletní hodnocení počtu a morfologie formovaných krevních • elementů • • Orientační pomůcka: na jeden leukocyt připadá asi 700 erytrocytů • schéma počítání Úkoly: nPřipravit cvičný roztěr z myší krve (jeden nebo více) n nObarvit myší roztěr a orientačně prohlédnout – nevyhodnocovat !!! n nVyhodnotit učitelem dodaný roztěr lidské krve: n n Zakreslit jednotlivé typy krvinek (erytrocyt, trombocyty, 5 typů leukocytů) n n Vyhodnotit diferenciál (u 50 leukocytů určit typ a vypočíst z toho jejich procentické zastoupení). n n Srovnat určený diferenciál s fyziologickými hodnotami, které je nutné vyhledat v textu ve složceJ n n n nV mezičase se seznámit s manipulací s automatickými pipetami Popis formovaných krevních elementů nGranulocyty: n nv cytoplasmě mají granula, jádro bývá segmentované n •Neutrofil: velikost 10 – 12 μm, cytoplasma se barví slabě růžově, jádro tmavě modré, segmentované (2 – 7 segmentů) Průměrný počet segmentů se vyjadřuje pomocí Hynkova čísla, které odráží stupeň zralosti neutrofilů. Granula se barví kyselým i zásaditým barvivem a mají proto nevýraznou narůžovělou barvu, jsou velmi malá, sotva rozlišitelná. Hlavní funkcí neutrofilů je fagocytóza cizorodých částic a jejich rozklad pomocí lyzosomárních enzymů. n n Neutro012tn Neutro050tn Neutro045tn •Eozinofil: velikost 12 – 14 μm, jádro ze dvou segmentů (brýlovité), granula větší než u neutrofilů, barví se cihlově červeně. n Hlavní funkcí eozinofilů je obrana proti endoparazitům a mohou se účastnit i alergických reakcí n • Bazofil: velikost 9 - 11 μm, jádro protáhlé, často esovité, granula tmavě • modrá, velká, barví se stejně jako jádro, proto se jeví jakoby jádro • překrývala. Bazofily se účastní alergických reakcí. eosino001tn eosino002tn eosino003tn Baso001TN Baso002TN Baso003tn Popis formovaných krevních elementů nAgranulocyty: n nv cytoplasmě nemají granula, jádro není segmentované n •Lymfocyt: velikost 6 – 12 μm podle stupně zralost (malé, střední a velké lymfocyty) , jádro okrouhlé hodně tmavé. Při diferenciaci (zrání) buňky přibývá cytoplasmy, jádro je stejné. Granula v cytoplasmě nejsou pouze drobná zrnitost. V roztěru nerozlišíme T a B lymfocyty, vetšina v periferní krvi jsou B lymfocyty. Hlavní funkce T lymfocytů je kooperace s dalšími imunitními buňkami při likvidaci cizorodých látek. Hlavní funkcí B lymfocytů je produkce protilátek. lympho002tn lympho003tn lympho004tn nMonocyt: velikost 14 – 20 μm, kulaté nebo oválně, jádro často n ledvinovitého tvaru (záleží na směru pozorování). Chromatin je jemně zrnitý, jádro je vždy světlejší než u lymfocytů. Granula nejsou, cytoplasma se však může jevit jako mírně zrnitá. Hlavní funkcí je fagocytóza cizorodých částic za účelem jejího zpracování a předložení dalším buňkám imunitního systému. mono002tn mono003tn mono001tn Popis formovaných krevních elementů nErytrocyty: velikost: 7 μm. Savčí erytrocyty jsou bezjaderné, oblast kde jádro před dozráním bylo se jeví jako světlejší disk. Erytrocyty ostatních tříd obratlovců jsou většinou oválné a mají vždy jádro. n nTrombocyty: krevní destičky, u savců jsou bezjaderné, jsou to vlastně odškrcené okrsky cytoplasmy z buněk, které se mazývají megakaryocyty a jsou trvale v kostní dřeni. Tyto okrsky cytoplasmy mají velikost asi 3 μm a často v roztěrech vytvářejí shluky. Trombocyty ostatních obratlovců jsou jaderné. ptačí trombocyty savčí trombocyty trombocyty neutrofil eozinofil bazofil lymfocyt monocyt •Granulocyty •neutrofil •eozinofil •bazofil •Agranulocyty •lymfocyt •monocyt Použité zdroje: nAtlas Hematologie zvířat: http://projekty.sosvet.cz/2006_hematologie/index.htm nTichý a kol: Histologie, VFU Brno, 2000 n n