1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212570_28446780.jpg logo_mu_cerne.gif • Luděk Bláha, PřF MU •Toxikokinetika • OPVK_MU_stred_2 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Co by si student(ka) měl(a) odnést ? • •Jaké procesy chemická látka prodělává uvnitř ORGANISMU ? • •Co je to TOXIKOKINETIKA a jaké popisuje procesy. •Znát vstupy •Přeměny •Vylučování toxických látek v organismech 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •TOXIKOKINETIKA -Osud látek v organismu – •(vstupy / přeměny / vylučování) • E3 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •PŘÍJEM ~ ELIMINACE (rovnováha, homeostáza) • - udržování látky v organismu pod úrovní škodlivého efektu • - organismus však vynakládá energii na udržení rovnováhy • (procesy eliminace, metabolismus ...) • •PŘÍJEM > ELIMINACE • - nárůst koncentrací látky v organismu • - časem překročení úrovně efektu (threshold level) • •Překročení limitů homeostatických procesů • -> přechod ze stadia rezistence (resp. adaptace) • do stadia pozorovatelných negativních efektů u jedince • -> škodlivé efekty na vyšších úrovních organizace •Toxicita = nerovnováha mezi VSTUPEM a VYLOUČENÍM 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif What processes are beyond toxicokinetics? •ADME •Absorption •Distribution •Metabolism •Elimination caption •Toxicokinetics ... •... EXPOSURE phase à Determines the final dose 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif ToxicoDYNAMICS http://4.bp.blogspot.com/-MebbujGDXi0/UAu26D7WxII/AAAAAAAAACk/StePoxIb3Go/s1600/2.png Dynamic simulation of processes causing toxicity and their grouping into toxicokinetics and toxicodynamics, illustrated on the example of the aquatic invertebrate Gammarus pulex. •MoA •(Mode of Action) • • •... and measurable EFFECTS •TARGETS = macromolecules •(DNA/RNA, proteins, membrane lipids) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Příjem látek u různých organismů • •1) jednobuněčné organismy • - pasivní difuze přes membránu • - „selektivní“ vstup přes existující transportní systémy • •2) vícebuněčné organismy / řasy • - difuze toxikantu přes membránu a mezi buňkami • •3) terestrické rostliny • - rozpuštěné ve vodě/půdě - vstup kořeny/listy • - plyné toxikanty - vstup přes stomata na listech • - lipofilní látky (některé herbicidy) - penetrace voskové kutikuly - vstup do buňky à přes membránu • •TOXIKOKINETIKA 1: příjem látek do organismu 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif • •4) živočichové - 3 hlavní cesty vstupu do organismu • •- potrava/pitná voda • - průchod trávicím traktem, změny/transformace dle pH, mikroflory střeva, př. cykasin: netoxický - ve střevě konverze->silný mutagen • •- respirační cesta • - trachee u hmyzu, žábry u akvatických organismů, plíce • - velká plocha pro výměnu/vstup látky (často 25x > povrch těla) • •- povrchem těla • - větší význam u menších organismů (relativně větší plocha) a akvatických organismů • •>> vždy je prvním krokem přestup přes buněčnou membránu • •TOXIKOKINETIKA 1: příjem látek do organismu 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Bez ohledu na typ organismu a cestu vstupu (do vyšších organismů) musí toxikant překonat barieru plazmatické •membrány (nebo i buněčné stěny) • • •Membrány – klíčová překážka pro toxické látky proteins 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Přestup toxikantů přes membrány • •Nejčastější (všechny látky) - pasivní difuze • •Podskupina látek určitých vlastností (např. podobné živinám nebo dalším tělu přirozeným látkám) usnadněný transport / aktivní transport • •Velké molekuly + částice - pinocytoza • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Přestup toxikantů přes membrány • •PASIVNÍ DIFUZE •- náhodný pohyb molekul podle koncentračního gradientu •- proces charakterizovatelný kinetikou prvního řádu •- závisí na: • - koncentračním gradientu • - ploše a tloušťce membrány/buněčné stěny • - rozpustnosti látky v tucích a ionizaci toxikantu • - lipofilní látky - dobrá difuze • - kationické - lepší navázání na povrch membrány (negativně nabité fosfolipidy) • - molekulové hmotnosti • - malé molekuly (<0.4 nm) rozpustné ve vodě (CO, HCN, N20, NO) dobrá pasivní difuze • - příliš velké molekuly – špatný (nebo minimální) přestup •TOXIKOKINETIKA 1 •- příjem látek do organismu - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Přestup toxikantů přes membrány • •USNADNĚNÝ TRANSPORT •- transmembránové proteiny vyvazují extracelulární látky a usnadňují přenos přes membránu : toxická látka - interference • (Ca2+ / calmodulin, Fe2/3+ / transferin) • •AKTIVNÍ TRANSPORT •- „pumpy“ po/proti koncentračnímu gradientu •- navázání látky na receptor / přenos přes membránu za spotřeby ATP • spřažené transporty Na+/K+ ATPáz - toxické látky / interference • •Tyto speciální biologické procesy se však u „cizorodých“ látek uplatňují vzácně – ojediněle u látek, které jsou podobné živinám apod. (např. toxiny sinic: peptidy) •TOXIKOKINETIKA 1 •- příjem látek do organismu - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Aktivní transport – eliminace (toických) látek z buňky • •- P-glykoprotein - transmembránová pumpa selektivně a aktivně transportující xenobiotika VEN z buňky (eliminace) • - MRP proteiny –(Multi Resistence Proteins ) -nádorové buňky - exkrece cytostatik, -bakterie - exkrece antibiotik •TOXIKOKINETIKA 1 •- příjem látek do organismu - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •PINOCYTOZA •- transport větších molekul endocytozou •- př. vstup vzdušných toxikantů na prachových částečkách (< 1 mm) do alveolárních buněk, vstup vláken azbestu do fagocytujících buněk • •TOXIKOKINETIKA 1 •- příjem látek do organismu - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Transport u živočichů •- krev, lymfa, hemolymfa • - transport rozpuštěných látek • - transport po navázání na proteiny (albumin, specifické proteiny) ! Mnoho organických (nepolárních) látek je vázáno •TOXIKOKINETIKA 2 •- transport látek v organismu - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Transport u rostlin - vodní proud v xylemu - plasmadesmy ve floemu - - -procesy závislé na podmínkách prostředí •(T,vlhkost, světlo ...) • •TOXIKOKINETIKA 2 •- transport látek v organismu - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Afinita k různým tkáním/pletivům •- chemické vlastnosti určují afinitu -> cílové tkáně - biokoncentrace • mušle - Cd/Pb - gonády • savci Cd - mozek/kosti, Pb - ledviny/kosti • Hg - u savců: ledviny > játra > slezina > střevo > srdce ... • lipofilní látky -> tukové tkáně (játra, mozek) •TOXIKOKINETIKA 2 •- Distribuce látek v organismu - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Příklad – kovy v tkáních ryb: Nové Mlýny •(Kenšová et al. ACTA VET. BRNO 2010, 79: 335-345) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Transformace xenobiotik v organismech • •- geneticky fixované staré konzervativní systémy pro transformaci xenobiotik jsou u všech organismů: • •- v minulosti • - transformace biotoxinů (plísní, rostlin, bakterií ...) • - produkty hoření (PAHs) • •TOXIKOKINETIKA 3 •- transformace látek v organismu - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif • •Základní strategie detoxifikace •- eliminace látky z organismu = omezení expozice •- většina vylučovacích orgánů: vodné tekutiny => transformace = lepší rozpustnost ve vodě - tvorba polárnějších, méně hydrofobních / více hydrofilních produktů • •- zpravidla rozlišovány 2 hlavní fáze detoxifikace • •- dobře prostudováno u zvířat (savců) • •Poznámka: u obratlovců (zvl. savců – teplokrevní = vyšší rychlost reakcí) •>> aktivnější detoxikace než u ryb nebo bezobratlích (è mlži akumulují PAHs x savci méně: oxidace/exkrece) • •- u rostlin - transformace oxidujícími enzymy: cytochrom oxidáza, fenol oxidáza, peroxidáza, askorbát oxidáza • • •TOXIKOKINETIKA •- transformace látek v organismu - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Velikost těla à rychlost metabolismu (transformací) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif E3 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Fáze I transformace •- enzymy MFO (mixed function oxidase, mixed function oxygenase) • •- membránové enzymy vázané na ER, extrahovatelné v podobě membránových vesikulů (= mikrozomů = S-9 frakce = mikrosomální oxidáza) • •- Konzervované - u všech rostlin i živočichů • •TOXIKOKINETIKA •- transformace - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Fáze I transformace – CYP450 • •- základní složkou enzymy obsahující jako koenzym hem = cytochromy P450 (CYP) = superrodina s více než 150 geny • •- u obratlovců nejčastější v parenchymu jater = hlavní orgán detoxifikace (ale i jinde - epitely střeva, žábry ...) • •- u bezobratlích v hepatopankreasu a trávicích žlázách • - hlavní reakce – reakce s kyslíkem + další reakce (hydrolyza / epoxidace / dehalogenace / hydroxylace / deaminace / dealkylace) • • •TOXIKOKINETIKA •- transformace - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif E3 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif E3 •Fáze I biotransformace – příklady 1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif E3 •Fáze I biotransformace – příklady 2 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Fáze I biotransformace – příklady 3 E3 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Fáze II transformace •- konjugace metabolitů z fáze I (nebo přímo reaktivních toxikantů) s řadou endogenních metabolitů (-> dále více rozpustné produkty) • : sacharidy, aminokyseliny a jejich deriváty (glukuronová kyselina, glutathion = GSH !), fosfáty, sulfáty ... •TOXIKOKINETIKA •- transformace - • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Fáze II transformace • •- enzymy cytosolové i membránové: glutathion S-transferázy (GST), epoxid hydroláza (EH), UDP-glucuronosyltransferaza (UDP-GTS), sulfotransferáza (ST) • •- vyloučení rozpustných produktů v moči / potu / žluči • • • •! Existuje řada látek, které jsou stabilní a podléhají jen pomalé nebo žádné transformaci ! (organochlorové látky ...) • •TOXIKOKINETIKA •- transformace - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif E3 •Fáze II biotransformace – příklady 1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Fáze II biotransformace – příklady 2 E3 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Indukce systému MFO a Fáze II: • •- enzymy MFO jsou indukovatelné řadou (lipofilních/toxických) látek • - organochlorové látky, PCDDs/Fs, PAHs, PCBs ... • -enzymy Fáze II jsou indukovatelné - zvýšeným výskytem substrátů (z I. Fáze detoxifikace) - reaktivních toxikantů v buňkách • • -Dlouhodobé expozice subletálním dávkám •à indukce detoxikačních enzymů • à tolerance organismu k toxikantu (fyziologická adaptace) • => příliš dlouhé působení: energetické vyčerpání •TOXIKOKINETIKA •- transformace - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Indukce detoxikačních enzymů = biomarker expozice • •- z aktivity detoxikačních enzymů lze usuzovat na předchozí expozici cizorodými látkami = biomarkery (vzrůst oproti pozaďovým aktivitám až 100+ krát) • •- často je diskutovaná indukce CYP1A (cytochromy P450 1AI) •- po vazbě a aktivaci AhR (aryl hydrocarbon receptor) -> spuštění transkripce translace nových enzymů - stanovení aktivace – tzv. EROD (ethoxyresorufin-O-deethylaza) - dobrá korelace s organickým (+chlor) znečištěním - - indukce dalších enzymů CYPs (stanovení MROD, BROD – podle typu substrátu) - • •TOXIKOKINETIKA •- transformace - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif E3 Změny v EROD aktivitě kaprů (samců vs. samic) u dvou řek (Anoia, Cardener) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Indukce detoxikačních enzymů u rostlin: • - oxidace : peroxidáza, 4-hydroxyláza • - ochrana před oxidací (superoxiddismutáza, kataláza ...) • - indukce - zejména herbicidy • •TOXIKOKINETIKA •- transformace - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Detoxikace à Aktivace -po metabolizaci řady látek detoxikačními enzymy vznikají více toxické metabolity -Obecně se užívá pojem „aktivace“ (nebo bioaktivace) -pro určité látky „aktivace prokarcinogen à karcinogen“ • •Například – POLYCYKLICKÉ AROMATICKÉ UHLOVODÍKY •Př. epoxidace benzo[a]pyrenu (BaP) • -> reakce s guanosinovými zbytky v DNA • - mutace / aktivace onkogenů • ALE BaP bez aktivace -> akutně netoxická látka • •- velmi silná indukce detoxikačních enzymů po expozici xenobiotiky může mít i další škodlivé efekty (toxicita dioxinového typu - viz dále) • •TOXIKOKINETIKA •- transformace - 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif E3 •TOXIKOKINETIKA – Bioaktivace Prokarcinogenu •BaP interkalovaný •v DNA 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Uložení xenobiotik v inertních tkáních • => omezení cirkulace a snížení expozice • •Živočichové - tuk (organochlorové látky), zuby, vlasy, rohy (kovy) • - u bezobratlích popsáno ukládání nerozpustných zinkových granulí ve střevě pijavek • •Rostliny - vakuoly, listy, kůra (-> opadání) • • •Uvolnění ze zásob •PCBs a další organochlorové látky -> tuk: ALE: rychlá potřeba energie (strádání, tvorba mléka ...) uvolnění ze zásob • -> náhlá větší expozice a/nebo uvolňování v mléce • •ULOŽENÍ (sequestration) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Metalothioneiny (MTs, MT-like proteins) • •- cytoplasmatické nízkomolekulární proteiny (6-10 kD) bohaté na Cys •- známy u velké řady eukaryot •- vazba kovů : Zn, Cd, Hg ... => snížení expozice / toxicity •- dlouhý poločas života proteinů (~ 25 dní) • •- původní biologická funkce - ? snad regulace dostupnosti esenciálních kovů (např. Zn) ? • •INDUKCE MTs • expozice kovy • jiný méně specifický stres - hypoxie, změny teploty ... • •- Indukce MTs - další příklad BIOMARKER EXPOZICE •ULOŽENÍ (sequestration) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Indukce MTs (příklad – expozice ryb arsenem) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Míra eliminace xenobiotika - míra možné toxicity • delší expozice / větší nebezpečí efektů • •SUCHOZEMŠTÍ ŽIVOČICHOVÉ (obratlovci) • •- většina rozpustných neplynných a nevolatilních látek - moč • glomerulus - kličky: filtrace / aktivní transcelulární exkrece / transcelulární difuze / i resorpce (!) • •- významné vylučování také - žluč • aktivní transport konjugátů při vylučování / ve střevě další transformace mikroflorou / event. resorpce • •- plynné látky (NH3) a volatilní látky (alkoholy) - plíce/dýchání •EXKRECE - VYLUČOVÁNÍ 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •VODNÍ ŽIVOČICHOVÉ •- hlavním vylučovacím orgánem žábry (NH3) + žluč (ledviny méně) • •ROSTLINY •- ukládání ve vakuolách, vylučování plyných toxikantů •EXKRECE - VYLUČOVÁNÍ 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •Př: EXKRECE různých kongenerů PCBs po injekci 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •U kterého z organismů bude rychleji probíhat biotransformace (detoxifikace) látek? U ryby nebo u člověka? Vysvětlete proč. • •Jaké jsou hlavní procesy, které látka prodělává v organismu? •Jaké jsou hlavní metabolismu v organismu? •Které enzymy se podílí na biotransformacích látek? •Které jsou nejčastější chemické reakce při biotransformacích? •Jaké transformační produkty s největší pravděpodobností vzniknou v organismu, který bude exponován látce benzen? •Co je to glutathion? •Co je to první a druhá fáze detoxifikace? •Znáte příklad látky, která je „bioaktivována“ v organismu? •V jaké podobě a jakým orgánem se vylučují toxické látky z ryb? z rostlin? z živočichů – obratlovců? • •Shrnutí - otázky