Úkoly Výpočet koncentrace proteinů ve vzorku na základě kalibrace BSA (list 'BCA-concentration') 1) Vypočítat rovnici kalibrační přímky ředění standardu BSA 2) Vypočítat koncentrace stanovovaných vzorků 3) Vypočítat objem vzorku nutný pro nanesení 10 µg proteinů na gel Analýza výsledků Western blotu (list 'MAPK-WesternBlot') 4) Provést denzitometrickou analýzu výsledků Western blotu MAPK pERK1/2 (fosfo-ERK1) a MAPK ERK1/2 (celkový ERK) " - k analýze použít přiložené soubory ""phosphoERK"" a ""totalERK""" - anotace obrázků a postup analýzy pomocí ImageJ - do tabulky dosadit výsledky z ImageJ => vypočítat relativní denzitu a normalizovanou denzitu Výsledky a odpovědi - pozn. buňky označené ŽLUTĚ je třeba vyplnit !!! Jméno: Datum cvičení: 2015-30-11 Číslo/označení vzorku: "1) Směrnice (""SLOPE"") kalibrační přímky BSA:" 2) Intercept kalibrační přímky BSA: "3) Koncentrace proteinů v neředěném vzorku, směrodatná odchylka koncentrace, koeficient variance:" C [mg/mL] = SD = KV = 4) Jaký je přídavek lyzačního pufru a LAEMLI (10×) k naředění vašeho vzorku do koncentrace 1 mg/mL (předpokládejte objem vzorku 100 µL): Lyzační pufr [µL] = LAEMLI 10× [µL] = 5) Kolikrát se u buněk ošetřených TPA zvýšil podíl fosforylované varianty MAPK ERK1 oproti kontrole (při normalizaci na celkové množství MAPK ERK1 ve vzorku): × 6) Kolikrát se u buněk ošetřených TPA zvýšil podíl fosforylované varianty MAPK ERK2 oproti kontrole (při normalizaci na celkové množství MAPK ERK2 ve vzorku): × 7) Jaká konkrétní fosfomísta MAPK ERK1/2 byla v tomto experimentu hodnocena (typ aminokyselinového zbytku a jeho pořadí v peptidovém řetězci): ERK1: ERK2: ##### Sheet/List 2 ##### 96-well microplate LAYOUT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 X = blank (naive/negative control; SDS) A 0 5 X = concentration of BSA standard [mg/mL] B 0.5 s1 X = name of the sample C 1 s2 D 1.5 s3 X = pole/hodnoty k VÝPOČTU !!! E 2 s4 F 2.5 s5 G 3 s6 H 4 ABSORBANCE 750 nm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 0.031 0.032 DO TÉTO TABULKY ZKOPÍRUJTE HODNOTY ABSORBANCE Z MĚŘENÍ (viz příloha e-mailu) B 0.029 0.03 C 0.031 0.03 D 0.03 0.035 E 0.032 0.032 F 0.034 0.032 G 0.033 0.031 H 0.03 0.031 1) CALIBRATION CURVE BSA [mg/mL] ABSORBANCE MEAN SD SLOPE INTERCEPT 0 0 0 - 0 - 0 0 0.5 0 0 - 0 - 0 0 1 0 0 - 0 - 0 0 1.5 0 0 - 0 - 0 0 2 0 0 - 0 - 0 0 2.5 0 0 - 0 - 0 0 3 0 0 - 0 - 0 0 4 0 0 - 0 - 0 0 5 0 0 - 0 - 0 0 Calibration curve: A (750 nm) = SLOPE * c (mg/mL) + INTERCEPT 2) SAMPLE ABSORBANCE MEAN SD C [mg/mL] s1 0 0 - 0 - 0 s2 0 0 - 0 - 0 s3 0 0 - 0 - 0 s4 0 0 - 0 - 0 s5 0 0 - 0 - 0 s6 0 0 - 0 - 0 3) CONCENTRATION OF BSA CONCENTRATION OF SAMPLE(S) THEORETICAL EXPERIMENTAL s1 0.0000 mg/mL 0 #DIV/0! mg/mL s2 0.0000 mg/mL 0.5 #DIV/0! mg/mL s3 0.0000 mg/mL 1 #DIV/0! mg/mL s4 0.0000 mg/mL 1.5 #DIV/0! mg/mL s5 0.0000 mg/mL 2 #DIV/0! mg/mL s6 0.0000 mg/mL 2.5 #DIV/0! mg/mL 3 #DIV/0! mg/mL ñ 4 #DIV/0! mg/mL "!!! IF GREEN, USE TABLE (1)" 5 #DIV/0! mg/mL "!!! IF RED, USE TABLE (2)" 4) (1) DILUTING OF SAMPLES FOR WESTERN BLOTTING to 1 mg/mL " weight of proteins applied onto the gel" 10 µg volume of sample(s) applied onto gel using LAEMLI 3× 15 µL !!! FILL IN !!! the volume of lysate you want to dilute to 1 mg/mL volume of sample(s) applied onto gel using LAEMLI 4× 12.5 µL volume of sample(s) applied onto gel using LAEMLI 10× 10 µL SAMPLE C [mg/mL] volume of lysate [µL] add lysis buffer [µL] add LAEMLI 3× [µL] (or) add LAEMLI 4× [µL] (or) add LAEMLI 10× [µL] s1 0.0000 0.00 0.00 0.00 0.00 s2 0.0000 0.00 0.00 0.00 0.00 s3 0.0000 0.00 0.00 0.00 0.00 s4 0.0000 0.00 0.00 0.00 0.00 s5 0.0000 0.00 0.00 0.00 0.00 s6 0.0000 0.00 0.00 0.00 0.00 "(2) DILUTING OF SAMPLES FOR WESTERN BLOTTING to 0,5 mg/mL" " weight of proteins applied onto the gel" 10 µg volume of sample(s) applied onto gel using LAEMLI 3× 30 µL "!!! FILL IN !!! the volume of lysate you want to dilute to 0,5 mg/mL" volume of sample(s) applied onto gel using LAEMLI 4× 25 µL volume of sample(s) applied onto gel using LAEMLI 10× 20 µL SAMPLE C [mg/mL] volume of lysate [µL] add lysis buffer [µL] add LAEMLI 3× [µL] (or) add LAEMLI 4× [µL] (or) add LAEMLI 10× [µL] s1 0.0000 0.00 0.00 0.00 0.00 s2 0.0000 0.00 0.00 0.00 0.00 s3 0.0000 0.00 0.00 0.00 0.00 s4 0.0000 0.00 0.00 0.00 0.00 s5 0.0000 0.00 0.00 0.00 0.00 s6 0.0000 0.00 0.00 0.00 0.00 ##### Sheet/List 3 ##### VYHODNOCENÍ (postup viz níže) Denzita Relativní Denzita (vůči kontrole) Normalizovaná denzita (vůči neovlivněnému proteinu) Fosfo-ERK (pERK) Celkový ERK (ERK) RD [pERK] RD [ERK] pERK1 / ERK1 pERK2 / ERK2 pERK1 pERK2 ERK1 ERK2 RD [pERK1] RD [pERK2] RD [ERK1] RD [ERK2] HBE1 - kontrola #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! #DIV/0! HBE1 - TPA RD = Relativní denzita - srovnání denzity proužků vůči kontrole (kontrola = 1.00) "Normalizovaná denzita - srovnání relativní denzity proužku zájmového proteinu v příslušném vzorku s relativní denzitou proužku neovlivněného proteinu (např. protein kontroly nanášení - house-keeping, nebo v našem případě celková MAPK ERK1/2)" "(v tomto experimentu šlo o zhodnocenípodílu fosforylované MAPK ERK1/2 vůči celkovému množství ERK1/2, které by nemělo být krátkodobou expozicí TPA prakticky ovlivněno, proto jsou hodnoty pERK normalizovány na celkový ERK)" ZDE NAKOPÍRUJTE OBRÁZKY DENZITOMETRICKÉ ANALÝZY S PÍKY POSTUP VYHODNOCENÍ POPIS MEMBRÁN "Western blotting kontrolních HBE1 buněk vs. buněk exponovaných chemikálií s nádorově promočními účinky, 12-O-Tetradekanoylforbol-13-acetát (TPA, 200 nM, 30 min). Metodou Western blot byla detekována aktivovaná (fosforylovaná) forma MAP kinázy ERK1/2 (pomocí primární protilátky Cell Signaling, 4370S) a celková (fosforylovaná i nefosforylovaná) forma MAP kinázy ERK1/2 (detekováno pomocí primární protilátky Cell Signaling, 4695S) " DENZITOMETRICKÁ ANALÝZA OBRAZU POMOCÍ PROGRAMU IMAGEJ ke stažení => http://imagej.nih.gov/ij/ 1) Otevřít obrázek s analyzovanými / srovnávanými bandy - phosphoERK.tif "2) Vybrat na liště nástrojů ""Rectangular selection"" a vytvořit obdélník ohraničující bandy pERK1/2 v kontrolním vzorku" 3) Stisknout Ctrl+1 (v obdélníku se objeví číslovka 1) "4) Přetáhnout pomocí myši vytvořený obdélník č. 1 na místo ohraničující bandy vzorku ""TPA""" 5) Stisknout Ctrl+2 (v druhém obdélníku se objeví číslovka 2) 6) Stisknout Ctrl+3 7) Objeví se denzitometrický profil vzorků - píky odpovídají profilu intenzity signálu jednotlivých bandů "8) Vybrat na liště nástrojů ""(Straight) Line selection"" a:" a) označit základní linii píků b) rozdělit dvojici píků svislou čarou vedenou dnem údolí mezi píky "9) Vybrat na liště nástrojů ""Wand (Tracing) Tool""" "10) Kliknout ""Wand"" hůlkou postupně doprostřed jednotlivých píků (hranice píku se zvýrazní)" "11) V nabídce ""Analyze"" vybrat ""Gels"" a následně kliknout na ""Label Peaks""" "12) Objeví se tabulka s hodnotami plochy píků (""Area"") a jejich relativní velikosti vůči celkové ploše (""Percent"")" "(POZNÁMKA: pořadí hodnot v tabulce odpovídá pořadí, v jakém byly píky vybrány pomocí ""Wand"" hůlky)" "13) Obrázky s píky s hodnotami vložte prosím sem (použít v ImageJ funkci ""Copy To System"" v záložce ""Edit"", pak Ctrl+V)" "14) Hodnoty ""AREA"" nebo ""Percent"" dosadit do tabulky na začátku tohoto souboru" => vypočte se relativní denzita bandů "15) Celý postup opakovat s obrázkem celkového ERK1/2, tzn. totalERK1/2.tif" => proběhne normalizace relativních denzit podle denzity neovlivněného proteinu (v tomto případě totalERK) PODROBNOSTI viz http://lukemiller.org/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-image-j/