ÚLOHA č. 2 Stanovení koncentrace proteinů pomocí BCA metody Chemikálie: - BCA Protein Assay Kit (Pierce / Thermo, Cat# 23225) - rozsah stanovovaných koncentrací je 0,125-2 mg/mL - Reagent A a Reagent B, jejich smíchaním v poměru 50 dílů reagentu A a 1 díl reagentu B vznikne Reagent A:B, spotřeba 3x200 uL na každý vzorek (blank, standard BSA, neznámý) + rezerva - MilliQ H2O a lyzační pufr použitý pro extrakci proteinů - vzorky (např. homogenizovaný buněčný lyzát): - spotřeba 3x10 uL + 10 uL (rezerva) = 40 uL - vzorky je vhodné naředit: - při použití misky 9 cm2, 150 uL lyzačního pufru a předpokládaném výtěžku extrakce 30-60 ug proteinu/cm2: (9 cm2 x 30 ug/cm2) / 150 uL = 1.8 mg/mL (9 cm2 x 60 ug/cm2) / 150 uL = 3.6 mg/mL => očekávaná koncentrace proteinů ve vzorku velmi pravděpodobně překročí koncentrační rozsah metody - snížení koncentrace složek lyzačního pufru, které mohou interferovat s metodou stanovení (zkontrolovat tabulku kompatibility!) - úspora vzorku - sada kalibračních roztoků BSA (0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 mg/mL, rozpuštěno v MilliQ H2O) - spotřeba 3x10 uL + 10 uL (rezerva) = 40 uL - kalibrační standard ve vodě je vhodné naředit lyzačním pufrem tak, aby podíl lyzačního pufru ve vzorcích standardu odpovídal podílu lyzačního pufru v neznámých vzorcích naředěných pro stanovení Pomůcky: - 1.5 mL mikrozkumavky, stojánek, 15 mL centrifugační zkumavka - automatické pipety (2-20 uL, 20-200 uL, 100-1000 uL) - multikanálová pipeta 100-300 uL, rezervoár pro multikanálovou pipetu - 96j PS mikrotitrační deska - vortex, minicentrifuga, třepačka na mikrotitrační desky - mikrodestičkový spektrofotometr Postup: 1) Ředění vzorků: - ředit vodou v poměru 1:4 (tzn. 1 díl vzorku a 3 díly vody, ředící faktor 0,25) => vzorky budou zředěny 4x - do mikrozkumavky napipetovat 30 uL vody a přidat 10 uL buněčného lyzátu - krátce vortexovat a následně stočit 2) Ředění standardů: - ředit vodou v poměru 3:4 (tzn. 3 díly roztoku standardu a 1 díl lyzačního pufru, ředící faktor 0,75) => standardy budou zředěny 1,33x - Slepý vzorek (BLANK): do mikrozkumavky napipetovat 30 uL roztoku MilliQ vody a přidat 10 uL lyzačního pufru - Standardy BSA: do mikrozkumavky napipetovat 30 uL roztoku standardu BSA o příslušné koncentraci (0,25-2,5 mg/mL) a přidat 10 uL lyzačního pufru - krátce vortexovat a následně stočit 3) Příprava BCA reagencií: - připravit Reagent A:B (míchat v poměru 50 dílů Reagentu A a 1 díl Reagentu B): ([blank + počet standardů BSA + počet neznámých vzorků] x 3 x 200 uL) + 700 uL (rezerva) Příklad: ((1 + 7 + 10) x 3 x 200) + 700 = 11500 uL 11500 uL / 50 = 230 uL => Napipetovat 11500 uL Reagentu A a přidat 230 uL Reagentu B => 11730 uL Reagentu A:B 3) Provedení BCA stanovení 3.1) Do mikrodestičky napipetovat ve třech opakováních po 10 uL: - blank - BSA standardy - neznámé vzorky 3.2) Přidat 200 uL Reagentu A:B do jamek se vzorky (pomocí multikanálové pipety) 3.3) Promíchat na třepačce 1 min 3.4) Inkubovat 30 min při 37°C 3.5) Změřit absorbanci při 562 nm 4) Výpočet koncentrace proteinů c stdu BSA (mg/mL) Ředění Finální c stdu BSA (mg/mL) A1 A2 A3 Průměr A SD Cv% 0.0 (Blank) 0,75 0.000 0.250 0,75 0.188 0.500 0,75 0.375 0.750 0,75 0.563 1.000 0,75 0.750 1.500 0,75 1.125 2.000 0,75 1.500 2.500 0,75 1.875 Kalibrační přímka: A(562nm) = SLOPE * c (mg/mL) + INTERCEPT SLOPE (Směrnice): Intercept: Vzorek Ředění A1 A2 A3 C1 C2 C3 Průměr C SD Cv% 1 0,25 2 0,25 3 0,25 4 0,25 5 0,25 6 0,25 7 0,25 8 0,25 9 0,25 10 0,25