Bi5596 Moderní metody v ekotoxikologii STUDIUM RNA & DNA I. Jak je izolovat a jak s nimi nakládat RNDr. Iva Sovadinová, Ph.D. sovadinova@recetox.muni.cz podzim 2016 2 CÍLE PŘEDNÁŠKY  Co to jsou NK  Jak je získáme  Jak je poznáme  Jak je rozeznáme – DNA vs. RNA  Jak s nimi manipulujeme  Jak je zkoumáme 2 CÍLE PŘEDNÁŠKY  Co to jsou NK  Jak je získáme  Jak je poznáme  Jak je rozeznáme – DNA vs. RNA  Jak s nimi manipulujeme  Jak je zkoumáme 2 CÍLE PŘEDNÁŠKY  Co to jsou NK  Jak je získáme  Jak je poznáme  Jak je rozeznáme – DNA vs. RNA  Jak s nimi manipulujeme  Jak je zkoumáme 2 CÍLE PŘEDNÁŠKY  Co to jsou NK  Jak je získáme  Jak je poznáme  Jak je rozeznáme – DNA vs. RNA  Jak s nimi manipulujeme  Jak je zkoumáme 2 CÍLE PŘEDNÁŠKY  Co to jsou NK  Jak je získáme  Jak je poznáme  Jak je rozeznáme – DNA vs. RNA  Jak s nimi manipulujeme  Jak je zkoumáme 2 CÍLE PŘEDNÁŠKY  Co to jsou NK  Jak je získáme  Jak je poznáme  Jak je rozeznáme – DNA vs. RNA  Jak s nimi manipulujeme  Jak je zkoumáme 2 CÍLE PŘEDNÁŠKY  Co to jsou NK  Jak je získáme  Jak je poznáme  Jak je rozeznáme – DNA vs. RNA  Jak s nimi manipulujeme  Jak je zkoumáme 3 Proces přenosu genetické informace  Centrální dogma molekulární biologie www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf , http://en.wikipedia.org/wiki/Central_dogma_of_molecular_biology#cite_note-crick1970-2 https://www.youtube.com/watch?v=yVQ1or5FYx8 3 Proces přenosu genetické informace  Centrální dogma molekulární biologie www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf , http://en.wikipedia.org/wiki/Central_dogma_of_molecular_biology#cite_note-crick1970-2 https://www.youtube.com/watch?v=yVQ1or5FYx8 NUKLEOVÉ KYSELINY A JEJICH STRUKTURA A FUNKCE 11 6 NK: STRUKTURA  nukleotidové polymery  nukleotid: 1. dusíkatá báze 2. pentózový cukr 3. fosfátová skupina Báze (1.) Nukleosid (2.) Nukleotid (3.) Adenin Adenosin AMP Guanin Guanosin GMP Cytosin Cytidin CMP Thymin Thymidin dTMP Uracil Uridin UMP CH O HC CH OH CH CH2 O OH P OOH OH Báze 1 23 4 5 www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf 12 6 NK: STRUKTURA  nukleotidové polymery  nukleotid: 1. dusíkatá báze 2. pentózový cukr 3. fosfátová skupina Báze (1.) Nukleosid (2.) Nukleotid (3.) Adenin Adenosin AMP Guanin Guanosin GMP Cytosin Cytidin CMP Thymin Thymidin dTMP Uracil Uridin UMP CH O HC CH OH CH CH2 O OH P OOH OH Báze 1 23 4 5 www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf N-glykosidová vazba 13 6 NK: STRUKTURA  nukleotidové polymery  nukleotid: 1. dusíkatá báze 2. pentózový cukr 3. fosfátová skupina Báze (1.) Nukleosid (2.) Nukleotid (3.) Adenin Adenosin AMP Guanin Guanosin GMP Cytosin Cytidin CMP Thymin Thymidin dTMP Uracil Uridin UMP CH O HC CH OH CH CH2 O OH P OOH OH Báze 1 23 4 5 www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf N-glykosidová vazba Fosfodiesterová vazba 14 7 DNA: Struktura & funkce www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf https://is.muni.cz/do/sci/UEBBiol/DNA-FTBcz/pages/2-19-zkrouceny- zebrik.html Fosfodiesterová vazba Záporný náboj N-glykosidová vazba 7 DNA: Struktura & funkce www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf https://is.muni.cz/do/sci/UEBBiol/DNA-FTBcz/pages/2-19-zkrouceny- zebrik.html Fosfodiesterová vazba Záporný náboj N-glykosidová vazba 7 DNA: Struktura & funkce www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf https://is.muni.cz/do/sci/UEBBiol/DNA-FTBcz/pages/2-19-zkrouceny- zebrik.html Fosfodiesterová vazba Záporný náboj N-glykosidová vazba DNA: Struktura & funkce  záporně nabitá  rozpustná ve vodě, naopak v ethanolu se sráží (bílá barva)  denaturace  vysoká teplota, nízká iontová síla, silně zásadité prostředí (obsah CG)  kyselé prostředí  hydrolýza glykosidových vazeb  stabilní  poločas rozpadu DNA v kosti - asi 521 let (kosterní nález) http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/32799/title/Half-Life-of-DNA- Revealed/ http://www.astronauti.cz/news/novy-objev-dna-prepisuje-historii-evoluce/ http://news.discovery.com/earth/weather-extreme-events/oldest-dna-bacteria- discovered.htm  DNA v roztoku při −20°/− 80 °C  několik měsíc až let, při 4 °C  několik týdnů 18 RNA: Struktura & funkce © 2009 Nature Education All rights reserved. 19 20 RNA: Struktura & funkce © 2009 Nature Education All rights reserved. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Difference_DNA_RNA-EN.svg DNA RNA: Struktura & funkce  cukr: ribóza, báze: A, U, C, G  záporně nabitá rozpustná ve vodě, naopak v ethanolu se sráží (bílá barva)  sekundární a terciární struktury  reaktivnější a flexibilnější, ale také nestabilnější než DNA  roztok v pufru při −20° stabilní pouze několik týdnů  náchylnější k degradaci enzymů  RNázy těžko degradovatelné 21 12 RNA: Struktura & funkce http://highered.mheducation.com/sites/0072507470/student_view0/chapter3/ani mation__mrna_synthesis__transcription___quiz_1_.html 13 RNA: Struktura & funkce https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ribosome_mRNA_translation_en.svg TRANSLACE http://highered.mheducation.com/sites/0072507470/student_view0/cha pter3/animation__how_translation_works.html 13 RNA: Struktura & funkce https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ribosome_mRNA_translation_en.svg TRANSLACE http://highered.mheducation.com/sites/0072507470/student_view0/cha pter3/animation__how_translation_works.html NUKLEOVÉ KYSELINY A JEJICH IZOLACE 25 15  volba techniky záleží na: 1. výchozím materiálu (typ, množství, kvalita atd.) 2. typu izolované NK  genomová DNA (chromozomální)  satelitní DNA  plasmidová DNA (extrachromozomální)  fragment DNA v agarózovém gelu  fagová (virová) NK  RNA 3. požadované čistotě 4. požadovaném množství 5. následné aplikaci 6. časové náročnosti 7. ekonomické náročnosti NK: IZOLACE  Izolace ve zkumavce  Kity  Automatické roboty 16 Hüttenhofer et al. Nature Reviews Genetics advance online publication; published online 18 April 2006 | doi:10.1038/nri1855 16 16 Hüttenhofer et al. Nature Reviews Genetics advance online publication; published online 18 April 2006 | doi:10.1038/nri1855 16 17 RNA Purifi cation and Analysis: Sample Preparation, Extraction, Chromatography Douglas T. Gjerde, Lee Hoang, and David Hornby Copyright © 2009 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim ISBN: 978-3-527-32116-2 NK: IZOLACE http://isb-up.cz/data/PDF/MMSR/MMSR_LS_2012_01_DNA-extrakce.pdf 30 NK: IZOLACE http://isb-up.cz/data/PDF/MMSR/MMSR_LS_2012_01_DNA-extrakce.pdf 31 19  Vychází z fyzikálně-chemických vlastností NK:  fosfátové estery jsou silné kyseliny a chovají se jako anionty při neutrálním pH  báze jsou jen slabě bazické a bez náboje  nabitá fosfátová páteř dělá NK spíše hydrofilní vs. proteiny jsou spíše hydrofóbní  NK se snadno precipitují alkoholem  vodíkové vazby mezi skupinami –NH2 a –OH jsou stabilní od pH 4 do pH 9  NK mají max. absorbance UV světla při 260 nm NK: IZOLACE Principy I. 20  Využívá se:  odlišná rozpustnost  adsorpční metody  gradientová centrifugace (hustota)  Metody lze rozdělit na:  Klasické v roztoku „organické“  Klasické v roztoku „anorganické“  Adsorpční na pevnou matrici NK: IZOLACE Principy II. NK: IZOLACE Důležité kroky 21 NK: IZOLACE Důležité kroky A. úspěšné rozbití vzorku a narušení buněčných membrán 21 NK: IZOLACE Důležité kroky A. úspěšné rozbití vzorku a narušení buněčných membrán B. denaturace nukleoproteinového komplexu 21 NK: IZOLACE Důležité kroky A. úspěšné rozbití vzorku a narušení buněčných membrán B. denaturace nukleoproteinového komplexu C. inaktivace nukleáz 21 NK: IZOLACE Důležité kroky A. úspěšné rozbití vzorku a narušení buněčných membrán B. denaturace nukleoproteinového komplexu C. inaktivace nukleáz D. odstranění všech nežádoucích složek – proteinů, solí, sacharidů, lipidů, DNA/RNA 21 NK: IZOLACE Důležité kroky A. úspěšné rozbití vzorku a narušení buněčných membrán B. denaturace nukleoproteinového komplexu C. inaktivace nukleáz D. odstranění všech nežádoucích složek – proteinů, solí, sacharidů, lipidů, DNA/RNA E. vyhnutí se kontaminování vyizolované NK jinou NK během izolace 21 40 Rozrušení vzorku a buněčných membrán 41 Rozrušení vzorku a buněčných membrán  mechanická lyze – kvasinky, houby, rostliny, živočišné pojivové tkáně  v třecí misce v tekutém dusíku, skleněné kuličky, tyčové homogenizátory atd.  enzymatická lyze – spóry, kvasinky  lysozym, celuláza atd.  osmotická lyze – např. E. coli, živočišné tkáně: krev, mozek  ionorgenní detergenty – dodecylsíran sulfát (SDS), N-laurylsarkosin, guanidinium hydrochlorid  neionogenní detergenty (umožní rozpustit buněčnou membránu při zachování jaderné membrány; izolace plazmidové DNA) – Triton X100, NP-40  organická rozpouštědla  zásadité látky (NaOH)  povaření  chaotropní činidla 42 Rozrušení vzorku a buněčných membrán  mechanická lyze – kvasinky, houby, rostliny, živočišné pojivové tkáně  v třecí misce v tekutém dusíku, skleněné kuličky, tyčové homogenizátory atd.  enzymatická lyze – spóry, kvasinky  lysozym, celuláza atd.  osmotická lyze – např. E. coli, živočišné tkáně: krev, mozek  ionorgenní detergenty – dodecylsíran sulfát (SDS), N-laurylsarkosin, guanidinium hydrochlorid  neionogenní detergenty (umožní rozpustit buněčnou membránu při zachování jaderné membrány; izolace plazmidové DNA) – Triton X100, NP-40  organická rozpouštědla  zásadité látky (NaOH)  povaření  chaotropní činidla 43 Rozrušení vzorku a buněčných membrán ALBERTS, B, D BRAY a A JOHNSON. Základy buněčné biologie. 2. vydání. Espero Publishing, 2005. 740 s. ISBN 80- 902906-2-0. Denaturace NK Inkubace s enzymy 44 Denaturace NK  používá se: SDS, zásady, zahřátí na vysokou teplotu, chotropní činidla  rozpustí a oddělí NK od ostatního materiálu (např. proteinů)  inhibuje nukleázy Inkubace s enzymy 45 Denaturace NK  používá se: SDS, zásady, zahřátí na vysokou teplotu, chaotropní činidla  rozpustí a oddělí NK od ostatního materiálu (např. proteinů)  inhibuje nukleázy Inkubace s enzymy  degradace nechtěných komponent: - proteázy (např. proteináza K)  proteiny - nukleázy  nechtěné NK - RNáza štěpí RNA, pak nutné přečistit fenol:chloroform extrakcí a DNA vysrážet EtOH 46 47 NK: IZOLACE Metody „quick-and-dirty“ pro genomovou DNA  inkubace zahřátí lyzovaných buněk na vysokou teplotu (např. 90°C/ 20 min, v přítomnosti SDS na 65-70°C)  „natrávení“ lyzovaných buněk proteinázou K ↓ limitované použití nepřečištěného lyzátu v dalších aplikacích ↓ obsahuje složky inhibující enzymy (např. soli) ↓ DNA není v optimálním pH ↓ nutná úplná inaktivace proteinázy K ↓ omezené skladování – rychlá degradace DNA 25  Organické látky sráží proteiny – fenol  Princip: proteiny jsou hydrofóbní a přecházejí do organizké fáze, kdežto NK jsou vysoce nabité a přecházejí do vodné fáze NK: IZOLACE Klasická metoda v roztoku - „organická extrakce“ 26  fenol  organické rozpouštědlo  vysoce čistý pro molekulární techniky, skladuje se při -20°C  sytí se Tris pufrem (pH 4: separuje se RNA; pH 7-8: separuje se DNA) s EDTA (vychytává ionty nutné pro aktivitu nukleáz – např. Ca2+) a NaCl - skladuje se při 4°C  oxidace (zežloutnutí) snižuje účinnost izolace  vysoce nebezpečná látka (hořlavá, korozivní a toxická)  výhody:  jednoduché provedení  lehce modifikovatelné  rozmezí objemů: 40 ml až několik ml  aplikace: genomová DNA s vysokou molekulovou hmotností Extrakce NK – převedení NK do vodné fáze I. Fenol-chloroformová extrakce 27  postup:  důkladně smíchat vzorek s fenolem  centrifugace  NK ve vodné fázi a a proteiny v organické („fenolové“)  modifikace:  přídavek chloroformu  lepší separace fází  přídavek guanidin thiokyanátu nebo guanidin hydrochloridu  denaturace proteinů  směs fenol:chloroform:isoamyl alkohol - isoamylalkohol: zvyšuje rozpustnost fenolu v chloroformu  TRIzol®  monofázický roztok fenolu a guanidin thiokyanátu izoluje NK v přítomnosti chloroform nebo bromochloropropanu (TRI reagent®) – izolace DNA, RNA a proteinů z 1 vzorku  nevýhody:  časově náročné  nebezpečí kontaminace, zejména fenolem (odstranění fenolu pomocí extrakce směsí chloroform-isoamylalkohol  fenol do chloroformové/organické fáze)  nebezpečné chemikálie  digestoř VODNÁ FÁZE RNA ORG. FÁZE Proteiny DNA Proteiny pH 4-6 7-8 VODNÁ FÁZE DNA, RNA ORG. FÁZE INTERFÁZE INTERFÁZE 28 Extrakce NK – převedení NK do vodné fáze II. Alkalická extrakce  alkalická denaturace (NaOH, pH = 12)  vysokomolekulové chromozomální DNA i plazmidové DNA v přítomnosti SDS  neutralizace (KAc, pH = 5.5)  selektivní renaturace plazmidové DNA, dlouhá bakteriální genomová DNA NErenaturuje  centrifugace  plazmidová DNA v roztoku, genomová DNA vázána na proteiny, které v tomto prostředí precipitují  (RNáza A), precipitace ethanolem  aplikace: plazmidová DNA (i kolonková verze) 29  srážení v nevodném prostředí *ethanol, isopropylalkohol – alkohol má nižší dielektrickou konstantu než voda  neutralizace negativního náboje NK, která se stává méně hydrofilní, tedy rozpustnou ve vodě – odmytí solí oplachem 70% ethanolem a rozpuštění NK ve vodě nebo pufru (TE pufr o pH 7,5)  srážení ve vodném prostředí *polyaminy (spermidin, spermin) – vysoce selektivní precipitace (nevhodné pro genomovou DNA, ne < 50 bp) – vhodné pro izolaci NK-vazebných proteinů – odmytí polyaminu oplachem peletu koncentrovanou solí *PEG - polyethylenglykol (různá MW i koncentrace) – vysoce selektivní precipitace (nevhodné pro nízkomolekulární NK <150 bp) – vhodné pro selektivní precipitaci v závislosti na délce NK – odmytí PEG oplachem peletu ethanolem vysrážené NK Precipitace NK – srážení NK z vodné fáze 30 NK: IZOLACE Klasické metody v roztoku - „anorganická extrakce“ Vysolování: 1. Lýze buněk  SDS 2. RNA odstraněna RNázami 3. Proteiny precipitovány v koncentrovaném roztoku solí (octan sodný či amonný) 4. DNA precipitována ethanolem a rehydratována NK: IZOLACE Klasické metody v roztoku - „anorganická extrakce“ Odstranění polysacharidů:  rostliny, houby a některé bakterie  extrakce s cetyltrimetylamonium bromidem (CTAB)  kladně nabitý CTAB se váže s negativně nabitými polysacharidy (pectin, xylan)  při 0.7-0.8 M NaCl jsou polysacharidy vyprecipitovány a DNA/RNA zůstává v roztoku  precipitace alkoholem 31 32 NK: IZOLACE Adsorpční na pevnou matrici  NK se v přítomnosti chaotropních solí adheruje na pevný povrch/nosič  adsorpce NK na pevnou fázi záleží na pH a obsahu solí v roztoku  pevná fáze: silikát, silikagel, skleněné kuličky, křemelina a nosiče aniontů  Kroky: 1. Lýze buněk 2. Adsorpce NK na pevnou fázi 3. Oplach 4. Vymytí 1. Lýze 2. Přidání chaotropních solí a protřepání se silikátovými částicemi 3. Centrifugace a oplach navázané NK roztokem chaotropních solí 4. Přidání vody či pufru  eluce 5. Centrifugace  NK v roztoku 33  NK v přítomnosti chaotropních solí (jodid sodný, guanidinové soli) adherují na silikátový povrch (na sklo)  vazba: vysoký obsah soli a pH≤7, vymytí: nízký obsah soli a pH≥ 1. Adsorpce na silikát 34  lyzát buněk se přidá na kolonky se speciálními membránami (silikát) vázajícími NK v přitomnosti chaotropních solí, následuje vymytí NK pufrem s nízkým obsahem soli  rozpuštěná NK se vysráží ethanolem a naváže se v pufru s vysokým obsahem soli (pH < 7) a eluuje v pufru s nízkým obsahem soli (pH > 7) 2. Kolonky založené na adsorpční chromatografii 1. Lýze 2. Navázání 3. Oplach 4. Vymytí https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Qiagen_Mini_Spin_Column.svg 35 3. Magnetické částice  magnetické silikátové částice  NK se váží při vysoké koncentraci chaotropních solí  magnetické silikátové částice váží při vysoké koncentraci solí i kratší NK a eluují při nízké http://www.bio-protocol.org/e1238 http://eng.bioneer.com/products/Protein/MagneticBeads-technical.aspx 36 4. Iontoměniče  resin   interakce mezi negativně nabitými fosfátovými skupinami NK a pozitivně nabitými molekulami zvoleného povrchu (např. DEAE, diethylaminoethyl)  vazba i eluce při různých koncentrací solí a pH dle izolované NK 5. FTA® Technology  „fast technology for analysis of nucleic acids“ 37 38  opakované použití enzymů a opakovaná extrakce fenolem  zákaz natahování a napínání v opačném směru a vortexování  několika hodinová fenolová extrakce za pomalého míchání  po vysrážení DNA ethanolem dojde k namotání DNA NK: IZOLACE Specifické aplikace & modifikace 1. Izolace vysokomolekulární chromozomální DNA www.tulane.e du/~wiser/me thods/notes.p df 2. Izolace mitochondriální DNA  osmotická lýze buněk v pufru pH=7 – rostlinná tkáň: sacharóza nebo mannitol 0,2-0,5 M, živočišná tkáň: 0,15 M KCl  EDTA – inhibuje proteolytické enzymy  BSA – bovinní sérový albumin – vychytává fenolické látky uvolněné např. z vakuol, váže mastné kys., inhibice proteáz  PVP – polyvinylpyrrolidone – absorbuje fenolické látky o Differenciační centrifugace - krátce nízké otáčky např. 3000 g/5-10 min  pelet: zbytky buněčných stěn, jádra, intaktní plastidy, škrobová zrna; supernatant: mitochondrie - dlouze vysoké otáčky např. 10,000 g/10-20 min  pelet: mitochondrie, peroxizómy, zbytky membrán plastidů o Gradientová ultracentrifugace - v roztoku Percolu – separovaný prstenec oddělený od ostatních kontaminant 39 o Differenciační centrifugace - krátce nízké otáčky např. 1500 g/15 min  pelet: plastidy, zbytky buněčných stěn, jádra, škrobová zrna o Gradientová ultracentrifugace - v roztoku Percolu nebo CsCl – separovaný prstenec oddělený od ostatních kontaminant 3. Izolace chloroplastové DNA 40 http://www.bio-protocol.org/e1238 4. „Rychlé izolace“ DNA nebo RNA  DNA vhodná pro přímou PCR bez nutnosti zdlouhavé izolace a přečištění – klíčový je návrh primerů  extrakt buněk vhodný přímo pro RT-PCR Ho 2013. PLOS One 8, e72463. mRNA miRNA (http://www.komabiotech.com/product/su b/directPCR_selectiongGuide.php) http://www.genscript.jp/direct_pcr.html 41 42  95% objemu NK v buňce (rRNA - 80-85 %, tRNA a snRNA – 15- 12 %, mRNA – 1-5 %)  inaktivace stabilních Rnáz  inhibitory (RNasin, RNaseOUT), detergenty, DTT, merkaptoethanol  DNáza bez přítomnosti Rnáz, selektivní polymer/nosič (Adsorbin)  nestabilní  dlouhodobě uchovávat vysráženou v 70% etanolu při při -80°C  selektivní precipitace: LiCl, acetát amonný  Organická extrakce v roztoku:  lýze buněk a solubilizace RNA v guanidinových solích (guanidin thiokyanát-fenol-chloroform)  fenol saturovaný pufrem o pH 4 Trizol®, Tri reagent  monofázický roztok fenolu a guanidin thiokyanátu izoluje RNA v přítomnosti chloroformu 5. Izolace RNA  Selektivní precipitace LiCl: - vysráží selektivně delší RNA (rRNA, mRNA) - postup: 8M LiCl (1:1), promíchání, inkubace při 20°C a centrifugace  Afinitní chromatografie: - kolonky s oligodT pro mRNA www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf 43 44  Magnetické částice nesoucí oligodT: http://www.lifetechnologies.com/cz/en/home/life- science/dna-rna-purification- analysis/napamisc/mrna-isolation-dynabeads.html 45 6. Různé typy DNA/RNA – Gradientová centrifugace (hustota)  hustota v CsCl: DNA ~ 1,7 g/cm3 proteiny ~ 1,3 g/cm3 RNA > DNA ssDNA > dsDNA http://biochem1362blog.wordpress.com/ http://cbc.arizona.edu/classes/bioc471/pages/Lecture2/Lecture2.html 46 NUKLEOVÉ KYSELINY A JAK JE ZÍSKAT DOMA 47 48 NK: Recept do domácí kuchařky • Homogenizace jahod v roztoku detergentu a NaCl • Pomůcky: igelitový sáček, vidlička, JAR, solnička, slivovice (55-65%), hrubé plátno nebo kuchyňské cedítko • Postup: - jahody zhomogenizovat pomocí vidličky s přídavkem pár kapek soli a detergentu (JAR, PUR… = popraskání stěn buněk, uvolnění DNA do roztoku) - Filtrace přes plátno - Přídavek etanolu = vysrážení DNA v podobě bílé hmoty http://www.priroda21.upol.cz/docs/2012-01-30_-_Kitner_- _Zakladni_metody_molekularni_biologie_v_botanice.pdf http://www.youtube.com/watch?v=UDKm9rZbhyI 49 • Homogenizace kousku jater (5-10g) v 10% roztoku kuchyňské soli a vysrážení DNA alkoholem • Pomůcky: talířek, vidlička, nůž, solnička, slivovice (55-65%), kuchyňské cedítko (hrubé plátno) • Postup: - kousek jater zhomogenizovat pomocí vidličky - zalít přiměřeným objemem 10% NaCl – popraskání stěn buněk, uvolnění DNA do roztoku - filtrace přes plátno - přídavek etanolu = vysrážení DNA v podobě bílé hmoty http://www.priroda21.upol.cz/docs/2012-01-30_-_Kitner_- _Zakladni_metody_molekularni_biologie_v_botanice.pdf NK: Recept do domácí kuchařky http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/extraction/howto/ http://www.youtube.com/watch?v=DBb1utQBlY4 NUKLEOVÉ KYSELINY A JAK S NIMI PRACOVAT 50 51  dekontaminace a sterilizace pracovních ploch UV zářením, čerstvým 10% roztokem bělidla (SAVO) a komerčním roztokem pro inkativaci RNáz (např. RNaseZapTM), DNáz a NK (např. DNAZapTM)  používat pouze vodu pro molekulární biologii („molecular grade water“) sklo – omýt detergentem a vodou a sušit při vysoké teplotě (350°C/2 h) plast – garantované bez RNáz/DNáz a DNA/RNA nebo autoklávovat nosit rukavice a často je měnit používat špičky s filtry NK: PRACOVNÍ PODMÍNKY 52 52 NUKLEOVÉ KYSELINY A JAK JE STANOVIT 53 54  SPEKTROFOTOMETRICKY VLNOVÁ DÉLKA ODEZVA KOMENTÁŘ 215-230 nm *NK absorbují minimálně *Peptidová vazba v proteinech absorbuje Měření nejsou při této délce prováděny, protože obecně používané pufry a solventy (např. Tris) také absorbují při těchto vlnových délkách. 260 nm *NK absorbují maximálně Puriny absorbují maximálně při vlnové délce mírně pod 260 nm; pyrimidiny kolem 260 (mírně nad). Puriny mají vyšší molární absorptivitu než pyrimidiny. Maximum absorbance a absorptivity záření úseku RNA/DNA proto závisí na přítomných bází. Proteiny absorbují pouze slabě při této vlnové délce. 270 nm * Fenol absorbuje silně Fenol může být kontaminant ve vzorku izolovaných NK. 280 nm *Aromatické aminokyseliny absorbují NK také absorbují při této vlnocé délce. 320 nm *Ani proteiny ani NK neabsorbují Používá se jako pozadí, když ani NK, ani proteiny neabsorbují. NK: KVANTITA & KVALITA DNA TRIZOL EDTA DNA A260 1,0 ~ 50 mg/ml dsDNA 1,0 ~ 33 mg/ml ssDNA A260/A280 A260/A230 1,6-1,8 (>1,8  RNA; <1,6  protein, fenol atd.) 1,8-2,2 (< 1,8 naznačuje přítomnost např. fenolu, solí, EDTA, TRIZOlu, guanidine HCl) RNA A260 1,0 ~ 40 mg/ml RNA A260/A280 A260/A230 ~2,0 (>2  guanidin isothiokyanát; <1,6  proteiny, fenol atd.) 1,8-2,2 (< 1,8 naznačuje přítomnost např. fenolu, solí, EDTA, TRIZOlu) Koncentrace Typ vzorku 260/280 260/230 55 56 -NanoDrop®  UV/Vis spektrum vlnových délek (220-750 nm), 1 ml vzorku bez ředění (3700 ng/µl dsDNA) 57  FLUORESCENČNĚ - vzorky s nízkou koncentrací nebo kontaminované - fluorescentní barvy: ethidium bromid, Ribogreen, QuantiFluor® RNA Systém, PicoGreen Eppendorf, Application Note 271, Březen 2013 58 Eppendorf, Application Note 271, Březen 2013  RADIOAKTIVNĚ - vizualizace malého množství DNA - Southernův či Northernův přenos na nylonovou membránu, hybridizace s radioaktivně značnou sondou - 32P http://biocadmin.otago.ac.nz/fmi/xsl/bioc2h/learnbitslecture.xsl?- db=bioc2hweb.fp7&-lay=Lectures&-recid=4604&-find= Southern EM (1975). J Mol Biol, 98 (3), 503-517 59 6084  HORIZONTÁLNÍ ELEKTROFORÉZOU V AGARÓZOVÉM GELU - odečet množství NK z gelu - marker - kvalita a integrita - barvení ethidium bromidem nebo dalšími fluorescenčními barvami pro NK  vizualizace UV světlem http://worldwide.promega.com/resources/pubhub/met hods-of-rna-quality-assessment http://www.priroda21.upol.cz/docs/2012-01-30_- _Kitner_- _Zakladni_metody_molekularni_biologie_v_botanice .pdf http://worldwide.promega.com/products/pm/genomics/rnasin 61 1. Trizol (12 mg) 2. Trizol (24 mg) 3. RNeasy (12 mg) 4. Invisorb II (12 mg) 5. Invisorb II (24 mg) 6. Invisorb Spin (12 mg) 7. Invisorb Spin (24 mg) JAK SEPAROVAT NK 62 NK: ELEKTROMIGRACE  využívá separace makromolekul na základě náboje, konformace nebo velikosti v elektrickém poli  migrace nabité částice v elektrickém poli je ůměrná jejímu celkovému náboji, velikosti a tvaru  malé částice s velkým nábojem vs. velké částice s velkým nábojem ELEKTROFORÉZA V GELU  Agarózová – vhodné pro rozlišení dlouhých fragmentů DNA a RNA (>400 bp), 1 kbp ssDNA ~ 330 kDa  Polyakrylamidová – vodné pro rozlišení krátkých fragmentů DNA nebo sekvenci lišícího se záměnou jednoho nukleotidu (<400 bp) 63  CO OVLIVŇUJE MIGRACI NK V GELU: - velikost pór, napětí, iontová síla roztoku, koncentrace fluorescenční barvy - velikost NK  menší rychleji - konformace DNA či RNA faster migration slower migration 88 65 NK: ELEKTROMIGRACE  HORIZONTÁLNÍ ELEKTROFORÉZA - agarózová (neutrální lineární polymer agarobiózy)  hustá síť, kterou rychleji prostupují kratší fragmenty (molekuly) než delší fragmenty – „molekulové síto“ 65 NK: ELEKTROMIGRACE  HORIZONTÁLNÍ ELEKTROFORÉZA - agarózová (neutrální lineární polymer agarobiózy)  hustá síť, kterou rychleji prostupují kratší fragmenty (molekuly) než delší fragmenty – „molekulové síto“ 65 NK: ELEKTROMIGRACE  HORIZONTÁLNÍ ELEKTROFORÉZA - agarózová (neutrální lineární polymer agarobiózy)  hustá síť, kterou rychleji prostupují kratší fragmenty (molekuly) než delší fragmenty – „molekulové síto“ www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf Agaróza – odlišná úroveň čistoty podle množství zbytkových nabitých sulfátových a karboxylových skupin, jejichž ionty mohou migrovat ke katodě a způsobovat jev zvaný elektroendoosmóza (EEO)  neselektivní, nežádoucí tok částic  agaróza s nízkým bodem tání (<90°C) – až 4% „méně pevné“ gely, vhodné pro separaci menších molekul DNA - izolace DNA z gelu bez denaturace - „in-gel“ PCR nebo „in-gel“ ligace  agaróza pro „pevné“ gely – pulse field gel elfo (PFGE) 66 Agaróza – odlišná úroveň čistoty podle množství zbytkových nabitých sulfátových a karboxylových skupin, jejichž ionty mohou migrovat ke katodě a způsobovat jev zvaný elektroendoosmóza (EEO)  neselektivní, nežádoucí tok částic  agaróza s nízkým bodem tání (<90°C) – až 4% „méně pevné“ gely, vhodné pro separaci menších molekul DNA - izolace DNA z gelu bez denaturace - „in-gel“ PCR nebo „in-gel“ ligace  agaróza pro „pevné“ gely – pulse field gel elfo (PFGE) 66 Elektroforetické pufry:  TBE (Tris/kyselina boritá/EDTA) - 0.1-3 kb DNA - i vysoké napětí (>150 V)  TAE (Tris/kyselina octová/EDTA) - 12-50 kb DNA - nižší pufrovací schopnost než TBE - nižší napětí (90-120 V) 67 68  5-10 ng DNA  agarózová elektroforéza  100 bp až 20 kb  polyakrylamidová elektroforéza  malé NK a oligonukleotidy www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf Alberts (2015), Základy buněčné biologie. 2. vydání. Espero Publishing, 2005. 740 s. ISBN 80-902906-2-0.  VERTIKÁLNÍ ELEKTROFORÉZA - polyakrylamidová (PAGE, polymer z akrylamidu zesíťovaný N,N‘- methylenbisakrylamidem)  Separace NK: - bez denaturujících činidel si DNA i RNA zachovává sekundární struktury, které znemožňují separaci dle velikosti RNA: Formaldehydový denaturační gel – agarózový gel v elektroforetickém pufru MOPS (3-(N-morfolino)propan sulfonová kyselina) s přídavkem formaldehydu DNA: Denaturující alkalické gely pro DNA– agarózový gel s přídavkem NAOH a EDTA v elektroforetickém pufru (75mM NaOH) DNA&RNA: denaturující PAGE s močovinou nebo formaldehydem či formamidem 69  2D AGARÓZOVÁ GELOVÁ ELEKTROFORÉZA: - 1. rozměr – separace molekul dle velikosti: např. při nízkém napětí v nízkoprocentní agaróze - 2. rozměr – při vysokém napětí ve vysokoprocentní agaróze v přítomnosti interkalační látky (EtBr)  separace molekul dle tvaru a složistosti struktur http://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2005/mb/b509471m http://cdn.intechopen.com/pdfs-wm/34921.pdf 70  2D PAGE ELEKTROFORÉZA - „Two-dimensional strandness-dependent electrophoresis“ (2D-SDE): - 1. rozměr  separace dle počtu řetězců, jejich délky i konformace - 2. rozměr - denaturace všech fragmentů na jednořetězcové  separace dle délky Gunnarsson et al. (2007), Nature Protocols 1, 3011. 71  VIZUALIZACE SEPAROVANÝCH NK V GELU  agarózový gel  ethidium bromid, SYBR Green I  polyakrylamidový gel  ethidium bromid, stříbro, radioaktivita, kovalentně navázané fluorescenční sloučeniny http://en.wikipedia.org/wiki/Molecular- weight_size_marker#mediaviewer/File:DNAgel4wiki.png 72  KAPILÁRNÍ GELOVÁ ELEKTROFORÉZA (CGE) 73  využívá elektrokinetických principů elektroforézy a elektroosmózy k separaci látek uvnitř křemenné kapiláry  vysokoúčinná kapilární elektroforéza (HPCE) - volná kapilární elektroforéza - gelová elektroforéza https://publi.cz/books/140/02.html delliss.people.cofc.edu  PULZNÍ GELOVÁ ELEKTROFORÉZA (PFGE) „Contoured-Clamped Homogeneous Electric Field“ • standardní gelová ELFO rozliší DNA fragmenty do 75 kb • separace velkých molekul DNA (až 10 Mb) v měnícím se elektrickém poli (orientace pólů o 90°, 120°, 180° atd. • délka pulzu, orientace, chlazení, pufr agaróza s nízkým EEO • i celé buňky • genotypování, genetický otisk („fingerprint“), epidemiologie pathogenních organismů www.tulane.edu/~wiser/methods/notes.pdf 74  SEPARACE DNA LIŠÍCÍ SE V JEDNÉ BÁZI • bodová mutace SSCP = jednovláknový konformační polymorfismus DGGE = denaturační gradientová gelová elektroforéza chemickým činidlem TGGE = denaturační gradientová gelová elektroforéza teplotním gradientem 75  SSCP (“Single-strand conformation polymorphism”)  Separace jednořetězcové DNA (denaturovaná) na nedenaturujícím polyakrylamidovém gelu při nízké teplotě  DNA řetězec se sbalí na základě vnitřních komplementarit a separuje se na základě odlišnosti tání DNA fragmentů http://www.lf2.cuni.cz/projekty/prusaDNA/newlook/defa7.htm http://wiki.biomine.skelleftea.se/biomine /molecular/index_11.htm 76 DGGE & TGGE (“Denaturing/Temperature Gradient Gel Electrophoresis”)  Separace na základě odlišnosti tání DNA fragmentů • posloupnost nukleotidů • obsah GC párů • ovlivňují průběh tání fragmentu DNA a následně rychlost migrace v denaturačním gradientu v polyakryamidovém gelu zvyšující se teplota, nebo koncentrace denaturantů www.wikiskripta.eu/index.php/DGGE http://wiki.biomine.skelleftea.se/biomine/molecular/index_11.htm 77 NK: IZOLACE Z GELU http://webcast.skola-profession.cz/Pages/Player.aspx?id=41  AGARÓZOVÝ GEL  elektroeluce  vazba a eluze ze skleněných nebo silikátových kuliček  elektroforéza na DEAE-celulózovou membránu  agaróza s nízkou teplotou tání  POLYAKRYLAMIDOVÝ GEL  metoda “crush and soak” http://www.peqlab.co.uk/wcms/uk/products/index.php?do=getArticlesByGroup&which=Gelex 78 GENETICKÝ OTISK 83  Metody detekce bodových polymorfismů (SNP) - SSCP, DGGE, TGGE - RFLP („restriction fragments length polymorpfismus“) NK: MAPOVÁNÍ SNP 84 • Autozomální mikrosatelity („Short Tandem Repeats“, STRs)  nekódující čtyřnukleotidové tandemově se opakující repetice • VNTR (variabilní počet tandemových opakování)  polymorfismu repetitivních úseků DNA • Variabilita v populaci je délková, daná počtem repetic 85  (PCR/)RFLP (Polymorfismus v délce restrikčních fragmentů)  restrikční analýza DNA • gDNA nebo namnožený specifický úsek naštěpíme restriktázou • Fragmenty rozdělíme elektroforeticky • Z gelu je přesajeme na membránu • Membránu hybridizujeme se sondou Southern blot • Navázanou sondu detekujeme NK: MAPOVÁNÍ 86 o genetické mapování o dědičné onemocnění o kriminalistika o určení otcovství 82  Restrikční endonukleázy:  štěpí DNA na specifických místech  Třída II: štěpí DNA v rozpoznávacím místě (4-8 nukleotidů), palindrom https://quizlet.com/25549586/genetics-flash-cards/ 87 87 88 89 http://www.hbwbiology.net/quizzes/ch20-DNA-technology.htm  (PCR/)T-RFLP (Terminální polymorfismus v délce restrikčních fragmentů)  restrikční analýza DNA http://en.wikipedia.org/wiki/File:Step-by- step_procedure_of_using_T-RFLP_analysis_in_microbiology.pdf 90  AFLP („Amplified fragment length polymorphism“) http://www.nature.com/scitable/content/outline-of-the-aflp-procedure-41047 https://botany.natur.cuni.cz/dna/index.php?option=com_content&view=article&id=47:af lp-princip&catid=35:aflp&Itemid=55 91 OTISK MIKROBIÁLNÍHO SPOLEČENSTVA 92  Stanovení profilu diverzity mikrobiálního společenstva pomocí technik mol. biologie  Odhad množství variant genu ve společenstvu  Celkový pohled na společenstvo, neřekne nic o přímé identifikaci nebo počtech individuálních buněk  Studium mikrobiálních systémů (vodní ekosystémy, půdy, lidská mikroflóra) - měření biodiverzity, změny ve společenstvu v čase, vliv faktorů..... sukcese společenstva, environmentální narušení habitatu, odpověď na znečištění polutanty www.moloch.upol.cz/uploads/vyukovy-portal/eko-mem-rulik.pdf 93 • DGGE, TGGE, SSCP, RFLP,T-RFLP, ARDRA, ARISA • Izolace DNA ze vzorku s mikrobiálním společenstvem • Cílem analýzy je gen nebo specifický úsek DNA • Častým cílem geny kódující 16S rRNA nebo geny, které mají klíčovou roli v metabolických procesech http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=S0718- 27912008000200004&script=sci_arttext 94  ARDRA („Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis“) • restrikční štěpení amplifikovaného fragmentu DNA pro konzervativní úseky rRNA bakterií http://entamoeba.lshtm.ac.uk/riboprnt.htm 95  RISA/ARISA („(Automated) Ribosomal Intergenic Spacer Analysis“) • prokaryocká DNA kodující vysoce konzervativní 16SrRNA a 23SrRNA geny • mezi těmito dvěma geny se nachází tzv. „internal transcribed spacer (ITS)“ region • ITS - nekoduje proteiny, vysoce variabilní v sekvenci a délce nukleotidů http://en.wikipedia.org/wiki/Community_Fingerprinting 96 97