Bi5596 Moderní metody v ekotoxikologii STUDIUM RNA & DNA II. Co nás zajímá a jak to zjistíme RNDr. Iva Sovadinová, Ph.D. sovadinova@recetox.muni.cz podzim 2016 2 CÍLE PŘEDNÁŠKY  Jak namnožit NK  Jak zjistit sekvenci NK  Co to je transkriptom a k čemu nám je  Co to je (eko)toxigenomika  Jak zapnout či vypnout gen  Jak zkoumat genotoxicitu 2 CÍLE PŘEDNÁŠKY  Jak namnožit NK  Jak zjistit sekvenci NK  Co to je transkriptom a k čemu nám je  Co to je (eko)toxigenomika  Jak zapnout či vypnout gen  Jak zkoumat genotoxicitu 2 CÍLE PŘEDNÁŠKY  Jak namnožit NK  Jak zjistit sekvenci NK  Co to je transkriptom a k čemu nám je  Co to je (eko)toxigenomika  Jak zapnout či vypnout gen  Jak zkoumat genotoxicitu 2 CÍLE PŘEDNÁŠKY  Jak namnožit NK  Jak zjistit sekvenci NK  Co to je transkriptom a k čemu nám je  Co to je (eko)toxigenomika  Jak zapnout či vypnout gen  Jak zkoumat genotoxicitu 2 CÍLE PŘEDNÁŠKY  Jak namnožit NK  Jak zjistit sekvenci NK  Co to je transkriptom a k čemu nám je  Co to je (eko)toxigenomika  Jak zapnout či vypnout gen  Jak zkoumat genotoxicitu 2 CÍLE PŘEDNÁŠKY  Jak namnožit NK  Jak zjistit sekvenci NK  Co to je transkriptom a k čemu nám je  Co to je (eko)toxigenomika  Jak zapnout či vypnout gen  Jak zkoumat genotoxicitu 2 CÍLE PŘEDNÁŠKY  Jak namnožit NK  Jak zjistit sekvenci NK  Co to je transkriptom a k čemu nám je  Co to je (eko)toxigenomika  Jak zapnout či vypnout gen  Jak zkoumat genotoxicitu CO NÁS, (EKO)TOXIKOLOGY, ZAJÍMÁ PŘI STUDIU NUKLEOVÝCH KYSELIN? 9  NUKLEOTIDOVÁ SEKVENCE  analýza variací  POLYMORFISMUS DNA  bodový nebo repetitivní  GENETICKÝ OTISK  OTISK MIKROBIÁLNÍHO SPOLEČENSTVA  MUTACE  GENOVÁ EXPRESE, REGULACE A FUNKCE  REKOMBINACE DNA NK: PROČ ZKOUMÁME? 10  NUKLEOTIDOVÁ SEKVENCE  analýza variací  POLYMORFISMUS DNA  bodový nebo repetitivní  GENETICKÝ OTISK  OTISK MIKROBIÁLNÍHO SPOLEČENSTVA  MUTACE  GENOVÁ EXPRESE, REGULACE A FUNKCE  REKOMBINACE DNA NK: PROČ ZKOUMÁME? 11  NUKLEOTIDOVÁ SEKVENCE  analýza variací  POLYMORFISMUS DNA  bodový nebo repetitivní  GENETICKÝ OTISK  OTISK MIKROBIÁLNÍHO SPOLEČENSTVA  MUTACE  GENOVÁ EXPRESE, REGULACE A FUNKCE  REKOMBINACE DNA NK: PROČ ZKOUMÁME? 12  NUKLEOTIDOVÁ SEKVENCE  analýza variací  POLYMORFISMUS DNA  bodový nebo repetitivní  GENETICKÝ OTISK  OTISK MIKROBIÁLNÍHO SPOLEČENSTVA  MUTACE  GENOVÁ EXPRESE, REGULACE A FUNKCE  REKOMBINACE DNA NK: PROČ ZKOUMÁME? 13  NUKLEOTIDOVÁ SEKVENCE  analýza variací  POLYMORFISMUS DNA  bodový nebo repetitivní  GENETICKÝ OTISK  OTISK MIKROBIÁLNÍHO SPOLEČENSTVA  MUTACE  GENOVÁ EXPRESE, REGULACE A FUNKCE  REKOMBINACE DNA NK: PROČ ZKOUMÁME? 14  NUKLEOTIDOVÁ SEKVENCE  analýza variací  POLYMORFISMUS DNA  bodový nebo repetitivní  GENETICKÝ OTISK  OTISK MIKROBIÁLNÍHO SPOLEČENSTVA  MUTACE  GENOVÁ EXPRESE, REGULACE A FUNKCE  REKOMBINACE DNA NK: PROČ ZKOUMÁME? 15  NUKLEOTIDOVÁ SEKVENCE  analýza variací  POLYMORFISMUS DNA  bodový nebo repetitivní  GENETICKÝ OTISK  OTISK MIKROBIÁLNÍHO SPOLEČENSTVA  MUTACE  GENOVÁ EXPRESE, REGULACE A FUNKCE  REKOMBINACE DNA NK: PROČ ZKOUMÁME? 16  NUKLEOTIDOVÁ SEKVENCE  analýza variací  POLYMORFISMUS DNA  bodový nebo repetitivní  GENETICKÝ OTISK  OTISK MIKROBIÁLNÍHO SPOLEČENSTVA  MUTACE  GENOVÁ EXPRESE, REGULACE A FUNKCE  REKOMBINACE DNA NK: PROČ ZKOUMÁME? 17 PCR aneb JAK NAMNOŽIT NE/SPECIFICKÝ ÚSEK NK? 18 PCR: „KOPÍRKA“ PRO DNA  PCR = „Polymerase Chain Reaction“  Polymerázová řetězová reakce objevena v roce 1983  Kary Mullis  Nobelova cen 1993 ústřední metoda v biochemii a molekulární biologii „polymerázová“ – využití DNA polymerázy  replikace in vitro „řetězová reakce“ – více reakcí za sebou, produkt první reakce se stává „šablonou“ v další reakci atd. atd. atd. atd. atd. atd. 19 PCR: „KOPÍRKA“ PRO DNA  PCR = „Polymerase Chain Reaction“  Polymerázová řetězová reakce objevena v roce 1983  Kary Mullis  Nobelova cen 1993 ústřední metoda v biochemii a molekulární biologii „polymerázová“ – využití DNA polymerázy  replikace in vitro „řetězová reakce“ – více reakcí za sebou, produkt první reakce se stává „šablonou“ v další reakci atd. atd. atd. atd. atd. atd. 20 PCR: „KOPÍRKA“ PRO DNA  PCR = „Polymerase Chain Reaction“  Polymerázová řetězová reakce objevena v roce 1983  Kary Mullis  Nobelova cen 1993 ústřední metoda v biochemii a molekulární biologii „polymerázová“ – využití DNA polymerázy  replikace in vitro „řetězová reakce“ – více reakcí za sebou, produkt první reakce se stává „šablonou“ v další reakci atd. atd. atd. atd. atd. atd. 21 240 = 1 099 511 627 776 kopií PCR: „KOPÍRKA“ PRO DNA  PCR = „Polymerase Chain Reaction“  Polymerázová řetězová reakce objevena v roce 1983  Kary Mullis  Nobelova cen 1993 ústřední metoda v biochemii a molekulární biologii „polymerázová“ – využití DNA polymerázy  replikace in vitro „řetězová reakce“ – více reakcí za sebou, produkt první reakce se stává „šablonou“ v další reakci atd. atd. atd. atd. atd. atd. 22 240 = 1 099 511 627 776 kopií 23 PCR: CO POTŘEBUJEME? I. 1. TEMPLÁT DNA 2. PRIMERY  krátké oligonukleotidy DNA  Specifické pro např. – gen (receptor, enzym, membránový přenašeč atd.) – kmen bakterií (16S rRNA)  Nespecifické 24 PCR: CO POTŘEBUJEME? I. 1. TEMPLÁT DNA 2. PRIMERY  krátké oligonukleotidy DNA  Specifické pro např. – gen (receptor, enzym, membránový přenašeč atd.) – kmen bakterií (16S rRNA)  Nespecifické 25  20 až 30 bazí  Teplota nasedání závislá na sekvenci primerů (~ 50% obsahu GC)  Neměl by tvořit sekundární struktury, zejména na 3’ konci  Neměly by tvořit tzv. dimery  komplementarita sekvencí primerů  Sekvence primerů by měla končit GC  silnější vazba ńa templát PCR: (NE)SPECIFICKÉ PRIMERY 5’-ACGGATACGTTACGCTGAT-3’ 3’-GACTATTCCATGTAGACCT-5’ Primer 1 5’-ACGGATACGTTACGCTGATAAGGTACATCTGGA-3’ 3’-TGCCTATGCAATGCGACTATTCCATGTAGACCT-5’ Primer 2 26 PCR: PROGRAMY PRO DESIGNOVÁNÍ PRIMERŮ OLIGO www.oligo.ne PRIMER3 http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi PrimerQuest http://www.idtdna.com/primerquest/home/index 27 PCR: CO POTŘEBUJEME? II. 3. PŘÍSTROJ umožňující rychlé a precisní střídání teplot 95 °C  denaturace DNA 50-60 °C  nasednutí primerů 72 °C  prodloužení vlákna 28 Průběh PCR před vynalezením thermocykleru 8 NUDNÝCH hodin !!! 95º C 5 min 35 cyklů 55º C 3 min 72º C 5 min 29 Průběh PCR před vynalezením thermocykleru 8 NUDNÝCH hodin !!! 95º C 5 min 35 cyklů 55º C 3 min 72º C 5 min 30 Automatizace „Baby Blue“ (1986) G-STORM GS4 (2006) Starší prototyp termocykleru Biometra T1 (1999) Techne TC-PLUS (2010) Eppendorf Mastercycler EP (2003) AUTOMATIZACE Biometra Toptical (2012) 31 PCR: CO POTŘEBUJEME? III. 5. REAKČNÍ SMĚS VE ZKUMAVCE Vzorek DNA Primery pro (ne)specifickou detekci Nukleotidy Enzym – termostabilní DNA polymeráza 32 33 www.zivaveda.ivb.cz Polymerázová řetězová reakce aneb Děkujeme, pane Mullis!, Mgr. Tereza Králová Taq DNA (templát) Termostabilní DNA polymeráza (Tag polymeráza) Volné deoxynukleotidy G ddH2O Hořčík SložkyPCR: Primery Pufr + + A C T G VIDEO  http://www.dnalc.org/view/15475-The-cycles-of-the-polymerase-chain-reaction-PCR-3D-animation.html 1. DENATURACE 2. NASEDÁNÍ PRIMERŮ 3. PRODLUŽOVÁNÍ PRIMERŮ Clin. Microbiol. Rev. (2004) 17: 903-925 34 Obvyklé teploty & časy PCR 4o CUkončení reakce 5 – 10 min 70o – 75o CKonečné prodlužování 0.5 – 2 min 70o – 75o CProdlužování primerů 0.5 – 1 min 45o – 65o CNasedání primerů 0.5 – 1 min 90o – 95o CDenaturace 1 – 3 min 90o – 95o CPočáteční denaturace 20 – 40 cyklů 35 Obvyklé teploty & časy PCR 4o CUkončení reakce 5 – 10 min 70o – 75o CKonečné prodlužování 0.5 – 2 min 70o – 75o CProdlužování primerů 0.5 – 1 min 45o – 65o CNasedání primerů 0.5 – 1 min 90o – 95o CDenaturace 1 – 3 min 90o – 95o CPočáteční denaturace 20 – 40 cyklů nasedání 94ºC 94ºC 55ºC 72ºC 4ºC 3 min 1 min 45 sec 1 min ∞ udržování Počáteční denaturace DNA 1X 35X 1X prodloužení denaturace 36 po n-tém cyklu => 2n molekul DNA 37 PCR: JAK DETEKUJEME NAMNOŽENÉ KOPIE DNA?  GELOVÁ ELEKTROFORÉZA  horizontální elektroforéza na agarózovém gelu  DNA fragmenty: 100 až 500 pb http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html 38  potvrzení specificity fragmentu sekvenačními metodami PCR: JAK DETEKUJEME NAMNOŽENÉ KOPIE DNA?  GELOVÁ ELEKTROFORÉZA  horizontální elektroforéza na agarózovém gelu  DNA fragmenty: 100 až 500 pb http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html KONVENČNÍ PCR („end-point“ PCR) 39  potvrzení specificity fragmentu sekvenačními metodami http://www.labome.com/method/Current-PCR-Methods.html KONVENČNÍ PCR: LIMITACE 40   citlivost   rozlišení   dynamický rozsah < 2 logs  neautomatizovatelná  pouze rozlišení velikosti  ethidium bromid je spíše pro semikvantitativní barvení KONVENČNÍ PCR: LIMITACE 41 qPCR: DETEKCE V REÁLNÉM ČASE kvantitativní PCR http://www.gene-quantification.de/block.html 42  fluorescenční barva vázající se na dsDNA http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/pcr/quantitative-pcr/sybr-green-based- qpcr/syber-green-animation.html qPCR: SYBR GREEN I 43  fluorescenční barva vázající se na dsDNA http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/pcr/quantitative-pcr/sybr-green-based- qpcr/syber-green-animation.html qPCR: SYBR GREEN I 44 DeBiasi R L , and Tyler K L Clin. Microbiol. Rev. 2004;17:903-925 45 DeBiasi R L , and Tyler K L Clin. Microbiol. Rev. 2004;17:903-925 https://dna.utah.edu/LightCycler/Top_LightCycler.html 46  limitace  SYBRG GREEN se váže nespecificky na jakoukoliv dsDNA (“primer-dimer”, nespecifický produkt atd.) http://hrm-dyes.gene-quantification.info/ https://dna.utah.edu/LightCycler/Top_LightCycler.html 47  Fluorescenčně značené próby vázající se specificky na cílový produkt PCR DeBiasi R L , and Tyler K L Clin. Microbiol. Rev. 2004;17:903-925 qPCR: PRÓBY 48 http://www.labome.com/method/Current-PCR-Methods.html 49 http://www.labome.com/method/Current-PCR-Methods.html 50 qPCR: KVANTIFIKACE 51 qPCR: KVANTIFIKACE 52 RT-(q)PCR: PCR PRO RNA  “Reverse transcription polymerase chain reaction“  RNA (total, mRNA, miRNA)  Reverzní transkriptáza  Primery pro RT: oligodT specifický primer  náhodný primer VIDEO  https://www.youtube.com/watch?v=0 MJIbrS4fbQ tp://en.wikipedia.org/wiki/Reverse_transcription_polymerase_chain_reaction 53 RT-(q)PCR: PCR PRO RNA  “Reverse transcription polymerase chain reaction“  RNA (total, mRNA, miRNA)  Reverzní transkriptáza  Primery pro RT: oligodT specifický primer  náhodný primer VIDEO  https://www.youtube.com/watch?v=0 MJIbrS4fbQ tp://en.wikipedia.org/wiki/Reverse_transcription_polymerase_chain_reaction 54 RT-(q)PCR: KRITÉRIA ÚSPĚŠNOSTI http://www.gene-quantification.de/optimization2.html#overview 55 RT-(q)PCR: KRITÉRIA ÚSPĚŠNOSTI http://www.gene-quantification.de/optimization2.html#overview 56 (RT)-(q)PCR: KONTROLY  KONTROLA „no-RT“  bez reverzní transkriptázy  kontaminace genomovou DNA (využití primerů vázajících se na introny)  kontaminace DNA  PCR KONTROLA „NTC“ bez DNA templátu (DNA, cDNA)  kontaminace DNA  nespecifické produkty  POZITIVNÍ KONTROLY http://bitesizebio.com/4074/the-pcr-controls-you-must-use/ 57 RT-(q)PCR: KVANTIFIKACE http://www.gene-quantification.de/strategy.html 58 RT-(q)PCR: KVANTIFIKACE http://www.gene-quantification.de/strategy.html využívá tzv. REFERENČNÍ GENY “housekeeping genes”  stabilní exprese GAPDH, b-Aktin, 18S RNA 59 RT-(q)PCR: PUBLIKOVATELNOST DAT The MIQE Guidelines - Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments Clinical Chemistry 2009, 55(4): 611-622 http://miqe.gene-quantification.info/ http://www.rdml.org/MIQE_checklist.pdf 60 RT-(q)PCR: PUBLIKOVATELNOST DAT The MIQE Guidelines - Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments Clinical Chemistry 2009, 55(4): 611-622 http://miqe.gene-quantification.info/ http://www.rdml.org/MIQE_checklist.pdf 61  „direct“ PCR • PCR bez přečištěné DNA nebo RNA 62 (RT)-(q)PCR: Modifikace  multiplex PCR • v jedné PCR směsi vícero primerových párů/prób 63  PCR ARRAY • více sad primerů ve 96j nebo 384j desce • exprese až 88 genů (96j deska) • stanovuje specifické produkty v jednotlivých jamkách desky • referenční geny • biologické dráhy  oprava DNA, buněčný cyklus, oxidativní stres, apoptóza, cytokiny & zánět, signální dráhy atd. 64  PCR ARRAY • více sad primerů ve 96j nebo 384j desce • exprese až 88 genů (96j deska) • stanovuje specifické produkty v jednotlivých jamkách desky • referenční geny • biologické dráhy  oprava DNA, buněčný cyklus, oxidativní stres, apoptóza, cytokiny & zánět, signální dráhy atd. 65  PCR čip • mikrofluidní čip • rychlejší • není nutná standardní křivka při absolutní kvantifikaci • vysoká citlivost 66  PCR čip • mikrofluidní čip • rychlejší • není nutná standardní křivka při absolutní kvantifikaci • vysoká citlivost 67Lab Chip, 2008,8, 2121-2127  PCR čip • mikrofluidní čip • rychlejší • není nutná standardní křivka při absolutní kvantifikaci • vysoká citlivost 68Lab Chip, 2008,8, 2121-2127  dPCR („digital PCR“) a ddPCR („droplet digital PCR“) • alternativní metoda ke konvenční qPCR využívaná např. pro detekci vzácných alel a sekvencí a při analýze 1 buňky • mnoho individuálních, paralelních PCR reakcí • absolutní kvantifikace • kombinace nanofluidního čipu, microarray či točící se mikrofluidní disk a TaqMan® prób http://www.bio-rad.com/de-de/applications-technologies/digital-pcr  dPCR („digital PCR“) a ddPCR („droplet digital PCR“) • alternativní metoda ke konvenční qPCR využívaná např. pro detekci vzácných alel a sekvencí a při analýze 1 buňky • mnoho individuálních, paralelních PCR reakcí • absolutní kvantifikace • kombinace nanofluidního čipu, microarray či točící se mikrofluidní disk a TaqMan® prób http://www.bio-rad.com/de-de/applications-technologies/digital-pcr  dPCR („digital PCR“) a ddPCR („droplet digital PCR“) • alternativní metoda ke konvenční qPCR využívaná např. pro detekci vzácných alel a sekvencí a při analýze 1 buňky • mnoho individuálních, paralelních PCR reakcí • absolutní kvantifikace • kombinace nanofluidního čipu, microarray či točící se mikrofluidní disk a TaqMan® prób http://www.bio-rad.com/de-de/applications-technologies/digital-pcr Experimental needs PCR method Advantages Limitations determine if a target NA sequence is present or absent in a few samples standard or conventional •easy access to equipment •minimal cost •qualitative results only •post reaction handling determine quantities of target NA in many samples real-time •can generate quantitative results •can be sequence specific •more expensive than conventional •PCR speed is mid- level determine quantities of many target NA for a few samples PCR arrays •up to 88 genes can be measured per sample at a time •one array is needed per sample •costly for many samples detect target NA in the field microfluidic chip •fast results •small size •portable •specialized equipment •costly detect very low abundance NA targets or need extremely accurate quantitation digital and drop digital •very precise absolute quantitation •specialized equipment •costly http://www.labome.com/method/Current-PCR-Methods.html 72  AFLP („Amplified fragment length polymorphism“)  Polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů Princip • metoda založená na restrikci DNA dvěma enzymy • selektivní namnožení jen některých proužků • vizualizace proužků na gelu Využití • polymorfismus DNA • genetická variabilita • fylogenetické studie 73 (q)PCR: VYUŽITÍ  AFLP („Amplified fragment length polymorphism“)  Polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů Princip • metoda založená na restrikci DNA dvěma enzymy • selektivní namnožení jen některých proužků • vizualizace proužků na gelu Využití • polymorfismus DNA • genetická variabilita • fylogenetické studie http://www.nature.com/scitable/content/outline-of-the-aflp-procedure-41047 https://botany.natur.cuni.cz/dna/index.php?option=com_content&view=article&i d=47:aflp-princip&catid=35:aflp&Itemid=55 74 (q)PCR: VYUŽITÍ  RAPD („Random Amplified Polymorphic“ DNA) • krátké nespecifické primery (8–12 nukleotidů) • není potřeba znát sekvenci celé genomové DNA nebo studovaného úseku • VYUŽITÍ  fylogeneze  DNA polymorfimus  genetický otisk  otisk mikrobiální komunity 75  RAPD („Random Amplified Polymorphic“ DNA) • krátké nespecifické primery (8–12 nukleotidů) • není potřeba znát sekvenci celé genomové DNA nebo studovaného úseku • VYUŽITÍ  fylogeneze  DNA polymorfimus  genetický otisk  otisk mikrobiální komunity http://www.majordifferences.com/2013/02/difference-between-rapd-and- rflp.html#.VDD5SBawRSM RAPD 76  SSH-PCR („Suppression subtractive hybridization“ PCR) • dovoluje namnožit pouze cDNA fragmenty, které se liší mezi kontrolou („driver“) a experimentální skupinou („test“) https://cellularphysiology.wikispaces.com/Suppression+subtractive+hybridization+ %28SSH%29 77 (q)PCR: APLIKACE o klonování DNA o sekvenace DNA o fylogenetické analýzy založené na DNA o genetická diverzita o genetický otisk o detekce genu o exprese genu a jejich funkce o mutace 78  Typy sekvencí DNA • jedinečné sekvence  geny (člověk – 80-100 000) • repetitivní sekvence  tandemové - bloky opakujících se repetitivních sekvencí uspořádaných za sebou  satelitní DNA  minisatelitní DNA  mikrosatelitní DNA  rozptýlené  SINE – krátké rozptýlené repetice  LINE – dlouhé rozptýlené repetice 79 (q)PCR: POLYMORFISMUS DNA VNTR – variabilní počet tandémových repetitivních sekvencí http://www.thenakedscientists.com/HTML/uplo ads/tx_naksciimages/dalya8_vntr_diagram.gif  Typy sekvencí DNA • jedinečné sekvence  geny (člověk – 80-100 000) • repetitivní sekvence  tandemové - bloky opakujících se repetitivních sekvencí uspořádaných za sebou  satelitní DNA  minisatelitní DNA  mikrosatelitní DNA  rozptýlené  SINE – krátké rozptýlené repetice  LINE – dlouhé rozptýlené repetice 80 (q)PCR: POLYMORFISMUS DNA VNTR – variabilní počet tandémových repetitivních sekvencí http://www.thenakedscientists.com/HTML/uplo ads/tx_naksciimages/dalya8_vntr_diagram.gif  Mikrosatelity • krátké tandemové repetice STR („short tandem repeats“) • repetice jednoduchých sekvencí SSR („simple sequence repeats“) • kódující i nekódující oblasti • hlavní zdroj vysoké proměnlivosti – sklouznutí nukleotidového řetězce během replikace („replication slippage“) • alely se liší delkou 81 Osobní stránky K. Mullise, obsahují popis objevu a principu PCR (vč. videa) http://www.karymullis.com/pcr.shtml Video o průběhu PCR http://www.youtube.com/watch?v=2KoLnIwoZKU PCR song, povedená píseň firmy BioRad http://www.youtube.com/watch?v=x5yPkxCLads PCR song, text http://bio- rad.cnpg.com/lsca/videos/ScientistsForBetterPCR/assets/BioRad_PCRsong_Ly rics.pdf PCR: UŽITEČNÉ ODKAZY I. 82 83 PCR: UŽITEČNÉ ODKAZY II. Kvantifikace qPCR http://www.gene-quantification.de Fóra, diskusní skupiny http://www.researchgate.net/topics http://www.bio.net/ www.molecularstation.com www.protocol-online.org molecularbiology.forums.biotechniques.com www.scienceforums.net www.biotechnologyforums.com www.biology-online.org 84 JAK ZJISTÍME SEKVENCI NK? 85 NK: SEKVENOVÁNÍ – „klasika“ 1) Předstupeň: PCR s použitím dvojice primerů • namnožení studovaného úseku DNA 2) Sekvenační reakce • použití pouze jednoho primeru • produkce fragmentů lišících se přesně o 1 bázi 3) Elektroforetická separace fragmentů na gelu 86 SEKVENOVÁNÍ: SANGEROVA METODA Sangerova metoda terminace řetězce • založena na terminaci replikace nového řetězce podle matrice zkoumané sekvence dideoxynukleozidtrifosfátem (ddNTP) • na 3’-uhlíku deoxyribózy chybí OH - skupina a proto k nim DNA polymeráza nemůže navázat další nukleotid • pokud během replikace dojde k náhodné inkorporaci dideoxynukelotidu (ddA, ddC, ddG, ddT), replikace se zde zastaví 87 https://www.youtube.com/watch?v=oYpllbI0qF8 http://biologie.upol.cz/metody/Sekvenovani%20DNA.htm 88 https://www.youtube.com/watch?v=oYpllbI0qF8 http://biologie.upol.cz/metody/Sekvenovani%20DNA.htm 89 SEKVENOVÁNÍ: DATABÁZE DNA 90 91  Entrez: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Class/MLACourse/Original8Hour/Entrez/ - prohledává všechny databáze asociované s NCBI („National Center for Biotechnology Information“) – např. databáze „Nucleotide“, „Gene“, „Genome“  GenBank: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ - název místa, délka sekvence, typ molekuly (DNA/RNA), nukleotidová sekvence  EMBL: http://www.embl.de/ - databáze Evropského bioinformačního institutu  http://molbiol-tools.ca/ - sekvence a jejich analýza NK: Kde najít či porovnat sekvenci? SEKVENOVÁNÍ: SANGEROVA METODA - limitace Sangerova metoda – limitace: • nutná PCR amplifikace či klonování jednotlivých DNA fragmentů • sekvenace jednotlivých DNA fragmentů (v 1 sekvenačním běhu  max. 96 vzorků - 96 kapilárové sekvenátory) • délka získané sekvence cca 650 bp • max. sekvenační výtěžek jednoho sekvenačního běhu cca 60 kb 92 SEKVENOVÁNÍ: SEKVENOVÁNÍ NOVÉ GENERACE „Next generation sequencing“: Paralelizace procesu sekvenování, kdy dochází k sekvenování tisíců až milionů sekvencí současně: 1. templátová DNA fragmentovaná na úseky několika set bází dlouhé 2. konce získaných fragmentů jsou enzymatickou reakcí zatupeny a napojeny k oligonukleotidům určité sekvence (tzv. adaptéry) 3. jednotlivé fragmenty jsou odděleně amplifikovány PCR reakcí (u některých technologií tento krok chybí) a pak v jednom kroku paralelně sekvenovány. Při tomto paralelním sekvenování se sekvenují milióny sekvencí najednou. • Délka získaných sekvencí je cca 20-700 bp. Sekvenační výtěžek jednoho běhu sekvenátoru může být až několik tisíc Gb, přičemž cena sekvenování za 1 b je až o dva řády nižší než by byla u kapilárního sekvenování Sangerovou metodou. http://web.natur.cuni.cz/zoologie/biodiversity/prednasky/GenetickeMetody VZoologii/Prednasky_2014/NextGenerationSequencing_2014.pdf 93 SEKVENOVÁNÍ: SEKVENOVÁNÍ NOVÉ GENERACE - Využití • celogenomové sekvenování, tzn. de novo sekvenování neznámých genomů • sekvenování jednotlivých chromosomů, plazmidů či mitochondrií • studium genetické variability, mutační analýzu, kvantifikaci jednotlivých alel • transkriptomovou analýzu („RNA-sequencing“) – analýza exprese kódující i nekódující RNA v genomu • studium DNA-proteinových interakcí („ChIP-sequencing“) • metagenomika (analýza biologické diverzity) – např. pro genotypizaci baktéri http://labguide.cz/sekvenovani-nove-generace/ 94 95 SEKVENOVÁNÍ: SEKVENOVÁNÍ NOVÉ GENERACE - Platformy 96 http://inovace-mbb.upol.cz/files/vyukovy-portal/portal-old/genomika_- _simkova/sekvenovani-web.pdf SEKVENOVÁNÍ: PCR v emulzi (emPCR) PCR v emulzi (emPCR) • fyzické oddělení jednotlivých fragmentů NK Čtení sekvence • sekvenování syntézou („sequencing by synthesis“) •sekvenování založeném na ligaci („ligation based sequencing“) 97 http://inovace-mbb.upol.cz/files/vyukovy-portal/portal-old/genomika_- _simkova/sekvenovani-web.pdf SEKVENOVÁNÍ: PCR v emulzi (emPCR) PCR v emulzi (emPCR) • fyzické oddělení jednotlivých fragmentů NK Čtení sekvence • sekvenování syntézou („sequencing by synthesis“) •sekvenování založeném na ligaci („ligation based sequencing“) 98 http://inovace-mbb.upol.cz/files/vyukovy-portal/portal-old/genomika_- _simkova/sekvenovani-web.pdf SEKVENOVÁNÍ: PYROSEKVENOVÁNÍ Pyrosekvenování založeno na cyklických reakcích (přidávání T, A, G, C, T, A, ...) a uvolnění pyrofosfátu v případě, že se inkorporovala specifická báze  následuje kaskáda reakcí, která na konci vede k emisi viditelného světla  před dalším cyklem - degradace neinkorporovaného nukleotidu. 99 http://inovace-mbb.upol.cz/files/vyukovy-portal/portal-old/genomika_- _simkova/sekvenovani-web.pdf SEKVENOVÁNÍ: PYROSEKVENOVÁNÍ Pyrosekvenování založeno na cyklických reakcích (přidávání T, A, G, C, T, A, ...) a uvolnění pyrofosfátu v případě, že se inkorporovala specifická báze  následuje kaskáda reakcí, která na konci vede k emisi viditelného světla  před dalším cyklem - degradace neinkorporovaného nukleotidu. 100 RNA-seq (RNA Sequencing), "Whole Transcriptome Shotgun Sequencing"("WTSS") • sekvenování RNA (total, mRNA, siRNA, miRNA atd.) http://www.labome.com/method/RNA-seq-Using-Next-Generation-Sequencing.html#ref2101 • Stanovení genové exprese • Objevení a popsání všech transkriptů • Charakterizace alternativního sestřihu (hranice exonintron) a polyadenylace http://rnaseq.uoregon.edu/ 102 • Stanovení genové exprese • Objevení a popsání všech transkriptů • Charakterizace alternativního sestřihu (hranice exonintron) a polyadenylace http://rnaseq.uoregon.edu/ Front. Plant Sci., 28 August 2012 103 Transl Lung Cancer Res 2013;2(2):87-91 104 JAK STUDUJEME INTERAKCE GENŮ A PROSTŘEDÍ? 105 NK: TRANSKRIPTOMIKA Aquatic Toxicology 67 (2004) 143–154 106 NATURE REVIEWS | GENETICS VOLUME 5 | DECEMBER 2004 | 937 107 NATURE REVIEWS | GENETICS VOLUME 5 | DECEMBER 2004 | 937 108 TRANSKRIPTOMIKA: METODY TRANSKRIPTOM  výčet a kvantifikace RNA v buňce, tkáni nebo organismu (mRNA, microRNA, siRNA, dlouhá nekódující RNA)  METODY  RT-qPCR/RT-PCR-array  RNA-seq  microarray 109 TRANSKRIPTOMIKA: DNA array a čip  DNA ARRAY a čipy • dvouřetězcové úseky molekul cDNA (komplementární DNA) vzniklé reverzní transkripcí mRNA • oligonukleotidové sondy sekvenčně specifické pro každý gen z genomu • hybridizační technika • vychází z tzv. Northern blotu  imobilizována mRNA/cDNA se hybridizuje se značenou probou reprezentující jeden gen • geny nebo fragmenty genů (cDNA, EST – „expressed sequence tag“) jsou roboticky v přesně daných souřadnicích umístěny na mikroskopické sklo (plast) 110  PRINCIP • funguje na principu specifické hybridizace  na principu párování komplementárních bází nukleotidů (spojení vodíkovými můstky) • destička (skleněná nebo silikonová) s mnoha (běžně desetitisíci, statisíci, výjimečně až miliony) vzorky jednořetězcových DNA oligonukleotidů Klin. Biochem. Metab., 14 (35), 2006, No. 2, p. 89–95.111 POSTUP: 1. Vytvoření DNA čipu  Navázáním oligonukleotidu (sondy) kovalentní vazbou na destičku 2. Příprava vzorku (cDNA)  nezbytný krok označení molekul (fluorescentní, radioaktivní) a denaturace 3. Hybridizace vzorku s čipem  nanesení vzorku na čip 4. Omytí čipu  sondy pevně přichycené kovalentní vazbou k povrchu čipu a molekuly vzorku přichycené dostatečně pevně na sondách. 5. Skenování čipu  Vícekanálový skener 6. Zpracování výsledků  podle intenzity vyzářeného světla lze určit množství komplementárních molekul přítomných ve vzorku http://www.molbio.upol.cz/stranky/vyuka/cgi/5.pdf112 POSTUP: 1. Vytvoření DNA čipu  Navázáním oligonukleotidu (sondy) kovalentní vazbou na destičku 2. Příprava vzorku (cDNA)  nezbytný krok označení molekul (fluorescentní, radioaktivní) a denaturace 3. Hybridizace vzorku s čipem  nanesení vzorku na čip 4. Omytí čipu  sondy pevně přichycené kovalentní vazbou k povrchu čipu a molekuly vzorku přichycené dostatečně pevně na sondách. 5. Skenování čipu  Vícekanálový skener 6. Zpracování výsledků  podle intenzity vyzářeného světla lze určit množství komplementárních molekul přítomných ve vzorku http://www.molbio.upol.cz/stranky/vyuka/cgi/5.pdf113 POSTUP: 1. Vytvoření DNA čipu  Navázáním oligonukleotidu (sondy) kovalentní vazbou na destičku 2. Příprava vzorku (cDNA)  nezbytný krok označení molekul (fluorescentní, radioaktivní) a denaturace 3. Hybridizace vzorku s čipem  nanesení vzorku na čip 4. Omytí čipu  sondy pevně přichycené kovalentní vazbou k povrchu čipu a molekuly vzorku přichycené dostatečně pevně na sondách. 5. Skenování čipu  Vícekanálový skener 6. Zpracování výsledků  podle intenzity vyzářeného světla lze určit množství komplementárních molekul přítomných ve vzorku http://www.molbio.upol.cz/stranky/vyuka/cgi/5.pdf114 Cell Biosci. 2012;2:26 115 NATURE REVIEWS | GENETICS VOLUME 5 | DECEMBER 2004 | 937 116 Aquatic Toxicology 67 (2004) 143–154 117 TRENDS in Biotechnology Vol.25 No.10 118 JAK VYTVOŘIT REKOMBINANTNÍ MODEL PRO (EKO)TOXIKOLOGII? 119119 REKOMBINACE DNA: REPORTÉROVÉ MODELY http://worldwide.promega.com/resources/multimedia/reporter-assays- and-transfection/introduction-to-reporter-gene-assays/ 120 REKOMBINACE DNA: REPORTÉROVÉ MODELY http://worldwide.promega.com/resources/multimedia/reporter-assays- and-transfection/introduction-to-reporter-gene-assays/ 121 http://en.wikipedia.org/wiki/Biomolecular_engineering 122 1. Promoter nebo 3’UTR responzivního elementu 2. Tvorba plazmidu a jeho namnožení (restrikční enzymy, klonování, selekce a izolace plazmidů) 3. Přenesení konstruktu (plazmidu) do buněk = transfekce http://www.activemotif.com/catalog/900/lightswitch-luciferase-assay-system 123 http://worldwide.promega.com 124 EHP 120 (2012): 990 125 REKOMBINACE DNA: JAK VYPNOUT/ZAPNOUT GEN?  “GENE KNOCK OUT”  kombinace technik vede k vyřazení genu z provozu  DNA konstrukt přenesen do buněčné kultury  u zvířat jsou embryonální kmenové buňky geneticky upraveny a vneseny do ranního stádia embrya  „GENE KNOCK-IN“ jedná se o nahrazení genu, ne o jeho vymazání  „GENE KNOCK-DOWN“ jedná se o snížení či inhibici genové exprese 126 REKOMBINACE DNA: JAK VYPNOUT/ZAPNOUT GEN?  “GENE KNOCK OUT”  kombinace technik vede k vyřazení genu z provozu  DNA konstrukt přenesen do buněčné kultury  u zvířat jsou embryonální kmenové buňky geneticky upraveny a vneseny do ranního stádia embrya  „GENE KNOCK-IN“ jedná se o nahrazení genu, ne o jeho vymazání  „GENE KNOCK-DOWN“ jedná se o snížení či inhibici genové exprese 127 128 http://www.nobelprize.org/nobel_ prizes/medicine/laureates/2007/a dvanced.html 129  “siRNA”, ribozymy, 130 JAK STUDUJEME GENO(EKO)TOXICITU? 131 GENOTOXICITA: COMET ASSAY http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-biology/cancer-research/learningcenter/cancer-research-protocols/comet-assay.html 132 GENOTOXICITA: COMET ASSAY http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-biology/cancer-research/learning- center/cancer-research-protocols/comet-assay.html http://cometassayuoc.blogspot.cz/2010/03/introduction-to-comet-assay.html 133 GENOTOXICITA: MIKROJÁDROVÝ TEST http://www.gentronix.co.uk/product/micro-nucleus-test/ 134 GENOTOXICITA: FISH – „Fluorescence in situ hybridization“ http://www.nature.com/scitable/topicpage/fluorescence-in-situ-hybridization-fish-327# 135 GENOTOXICITA: FISH – „Fluorescence in situ hybridization“ http://www.nature.com/scitable/topicpage/fluorescence-in-situ-hybridization-fish-327# 136 GENOTOXICITA: FISH – „Fluorescence in situ hybridization“ http://www.nature.com/scitable/topicpage/fluorescence-in-situ-hybridization-fish-327# 137 http://commons.wikimedia.org/wiki/File:FISH_%28Fluorescent_In_Situ_Hybridization%29.jpg 138 139