METABOLITY Analýza malých molekul v (eko)toxikologii – studium účinků – Lucie Bláhová, MU, RECETOX Schéma přednášky • Metabolity, metabolom, metabolomika • Přírodní látky • Význam vybraných metabolitů a přírodních látek • Metody stanovení – Extrakce  Separace  Detekce • Příklady – Thioly (GSH), analýza lipidů Metabolity Léčiva Nutrienty Xenobiotika Sekundární metabolity Side effect Metabolity: část systémové biologie Metabolity a malé molekuly METABOLOMIKA METABOLOM Metabolit • Produkt enzymové reakce • Vyskytuje se převážně uvnitř buňky (!) • Neakumuluje se • Má biologickou funkci (na enzymatické i transkripční úrovni) • Podobná struktura s prekurzorem • MW<1000 • Velký koncentrační rozsah • Ne příliš stabilní (rychle vzniká i zaniká) Příklad: cholesterol (prekursor)- kortizol (metabolit) steroidní hormon - řízení metabolismu živin - indikátor stresu Metabolom Soubor nízkomolekulárních produktů a meziproduktů genové exprese a enzymatické aktivity v daném čase Metabolismus Soubor všech enzymových reakcí (tzv. metabolických drah), při kterých dochází k přeměně látek a energií v organismu METABOLOM – proč? Využití metabolomu? • Množství metabolitů obecně nižší než počet genů a proteinů v buňce (S. cerevisiae 600 metabolitů MW <300 z 6000 genů) – Výjimkou sekundární metabolity – např. rostliny • Analýzy časově méně náročné – ve srovnání s analýzou makromolekul • Zaznamenatelné změny metabolitů – při nezměněné koncentraci enzymu – násobně vyšší než změny exprese nebo koncentrace proteinů – dány nejen úrovní exprese, ale i environmentálními vlivy, stádiem vývoje organizmu, biologickými cykly, aj. http://biomarkers.cardiosource.org/~/media/BioMarkers/Images/sabatinefig2.ashx Fluxome 13C Genome Transcripto me Proteome Metabolom e METABOLOM – jak? http://cancerdiscovery.aacrjournals.org/content/2/10/881.figures-only?cited-by=yes&legid=candisc;2/10/881 Klesá počet analyzovaných molekul RT-PCR DNA Microarrays Gene Chips 2D-PAGE MALDI-MS 2D-LC-MS NMR GC, LC, CE-MS MALDI, DESI- MS MSI Roste chemická komplexnost analyzovaných sloučenin METABOLOMIKA Metabolomika: Kvantitativní i kvalitativní studium metabolitů <1000 Da (metabolomu) látkové přeměny živých systémů Využití metabolomiky: • Adaptace organizmu na prostředí • Odhad toxicity látek • Vývoj nových léčiv • Hledání biomarkerů metabolismu, onemocnění, průběhu terapie • Charakterizace a identifiace buněk (savčí, rostlinné, GMO) • Forenzní medicína METABOLOMIKA - přístupy METABOLOMIKA - přístupy Metabolite target analysis: • kvantitativní i kvalitativní analýza substrátů nebo produktů metabolické dráhy, nízký LOD, náročná příprava vzorku Metabolic profiling: • semikvantitativní analýza více metabolitů s podobnými vlastnostmi (např. polární lipidy, sacharidy) Untarget metabolomic (Finger / Footprinting ): • komplexní analýza intra (finger-) a extracelulárních (foot-) metabolitů • bez nutnosti kvantifikovat a identifikovat, screening Metabonomics (definice není 100%ní!): • cílem je sledovat odpověď na podněty, např. expozice toxické látce, genetická modifikace, fyziologický stimul (farmakologie, toxikologie) Buňka, tkáň Derivatizace MS GC NMR CE MS Metabolic profiling Biologické tekutiny NMR, FT-ICR Finger/Footprinting GC HPLC Derivatizace Frakce vybraných metabolitů MS MS ECD UV Metabolite target analysis Frakce skupiny metabolitů LC Extrakt Untarget metabolomic • Srovnáváme až 1000 molekul • K většině nemáme standard • Kvantifikace – není – jen relativní změna mezi skupinami • Nutné znát hypotézu • Pečlivá a jednotná příprava vzorků a analýz – horší reprodukovatelnost • Neexistuje jednotná příprava všech skupin metabolitů (lipidomic, glycomic aj.) • Rychlost (peníze) vs. rozlišení (citlivost)? • Nutné využívat statistiku (při designu i vyhodnocení experimentu) Target metabolomics • Srovnáváme max 100 molekul • Existence databází známých molekul (Metlin) • Existuje-li standard, možná kvantifikace • Vyšší citlivost analytických metod (identifikace nízkých koncentrací) METABOLOMIKA - přístupy Mulvihill , MM and Nomura DK. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism (2014) 307/3, E237-E244. DOI: 10.1152/ajpendo.00228.2014 https://masspec.scripps.edu/ o Input data format o Peak finding o Chromatogram alignment o Data correction (missing values, empty rows..) o Data processing o Statistics - heat maps o - PCA (principle component anal.) o - CA (cluster analyses) o - descriptive statistics o Identification of metabolite (databases) Data processing http://www.elmhurst.edu/~chm/vchembook/5900verviewmet.html Základní skupiny metabolitů ! Diskutován je heterotrofní metabolismus (ne sinice, rostliny a zvláštní typy bakterií ...) METABOLITY LIPIDŮ METABOLITY LIPIDŮ Lipidy – málo polárních skupin, estery alkoholů a mastných kyselin, málo rozpustné ve vodě - Databáze Lipid MAPS http://www.lipidmaps.org/ - 37 500 biologicky relevantních lipidů (2013) • Fatty acids 5795 • Glycerolipids 7538 „fats“ • Sterol lipids 2678 „sterols“ • Prenol lipids 1200 • Sacccharolipids 1293 • Sphingolipids 4318 • Glycerophospholipids 8001 • Polyketides 6741 Nepolární lipidy Polární lipidy http://www.lipidmaps.org/ Různorodá skupina sekundárních metabol METABOLITY LIPIDŮ – dělení Funkce: •Zásobárna energie •Metabolické regulátory •Strukturní komponenty (membrány) •Elektrické izolanty (nepolární lipidy) Složení: •Polární x nepolární •Jednoduché x složené x odvozené Dělení mastných kyselin: •Délka řetězce •Počet dvojných vazeb a jejich umístění •Stereoizomerie •Regioizomerie Lisa M. J. Chromatogr.A 1218 (2011) : 5146 FOSFOLIPIDY Součást membrán • Mitochondrie, Chloroplast, Cytoplasmatická membrána • Amfifilní charakter Složení • Diacylglycerol-fosfát (může být esterifikován) • Mastné kyseliny – palmitová, oleová, arachidonová • Nejvíce prostudované a biologicky významné  metabolity kyseliny arachidonové (AA) Diacylglycerol Adukty s DNA, proteiny •Cholesterol •Oxysterol Acetyl-CoA METABOLITY FOSFOLIPIDŮ Oxidace fosfolipidů • nejčastější proces • ztráta funkčnosti membrán • enzymaticky i neenzymaticky • metabolity s fyziologickými účinky (eikosanoidy) • reaktivní metabolity http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/biology/celmem.html http://www.phschool.com/science/biology_place/biocoach/bioprop/phospho.html http://www.scielo.br/img/revistas/jbpneu/v35n12/en_a11fig03.gif FOSFOLIPIDY – enzymatická oxidace Eikosanoidy (z řec. eikosi − dvacet) 20 C, deriváty AA • Prostaglandiny PG • Tromboxany TX • Leukotrieny LT • Lipoxiny • Hydroxyeikosatetraenové kyseliny - HETE http://www.arthritis.co.za/nsaids2.htm Významné biologické funkce • Zprostředkování zánětlivé odpovědi (COX 2-PG-horečka, bolest, zánět, aspirin-COX1-PG-sekret mucinu v žaludku- ibuprofen) • Regulace krevního tlaku, koagulace, horečky, bolesti • Buněčná signalizace • Řídí činnost ledvin • Inhibice lipolýzy a sekrece trávicích šťáv CYP 450 EETs, DiHETEs (neuroprotektant) FOSFOLIPIDY – neenzymatická oxidace Isoeikosanoidy Produkty neenzymatické oxidace AA Nejstudovanější – Isoprostany • Stabilní molekuly, vznikají po ataku ROS • Nejznámější 8-iso-PGF2α (synonyma iPF2α-III, iPF2α-IV, 15-F2t-IsoP) Známé účinky 8-iso-PGF2α • vasokonstrikce • inhibice shlukování krevních destiček • účast při zánětlivých procesech Využití • biomarker oxidativního stresu a pracovní expozice • biomarker neurodegenerativních a kardiovaskulárních onemocnění • řízení terapeutického zásahu http://pvac.vscht.cz/ustav/vyzkumne-projekty/biomarkery-oxidacniho-stresu FOSFOLIPIDY – neenzymatická oxidace malé reaktivní aldehydy Konečné produkty oxidace AA MDA – malondialdehyd (MW 72.07) HNE – 4-hydroxynonenal (MW 156.22) ONE – 4-oxononenal (MW 155.22) ACR – acrolein (MW 56.06) • koncové produkty oxidace i potravních lipidů • reaktivní malé molekuly – tvorba aduktů s DNA, s peptidy, s GSH („mercapturomika“) • biomarkery oxidativního stresu in vivo a vnější expozice • biologické a toxické účinky http://pvac.vscht.cz/ustav/vyzkumne-projekty/biomarkery-oxidacniho-stresu DALŠÍ METABOLITY LIPIDŮ – důležité biomarkery Cholesterol • Součást membrán živočichů, prekurzor steroidních hormonů a žlučových kyselin Oxysteroly (7b-hydroxycholesterol) • produkt lipidní peroxidace cholesterolu, MW 402.7 • biomarker oxidativního stresu a různých onemocnění (diabetes, atherosclerosis, liver diseases, alzheimer) • vysoká koncentrace v plasmě • biologické účinky: apoptoza, agregace destiček, metabolismus sfingolipidů, cytotoxicita t-HODE (hydroxyoctadecadienoic acid) • produkt oxidace kyseliny linoleové C:20 (LA), • biomarker antioxidační kapacity a oxidativního stresu in vivo HEL (hexanoyl-lysine adduct) • Adukt lipid hydroperoxidu s lysinem, produkt peroxidace LA nebo AA • biomarker lipidní peroxidace, nalezen v modifikovaných LDL (atheroscleroza) a v moči Příklad: Analýza metabolitů – lipidy Příklad: Analýza metabolitů – lipidy Extrakt, tkáň Bioinformatika (korekce dat, analýza dat-PCA, visualizace, interpretace) Extrakce: různá pro různě polární lipidy, aditiva podporující rozpustnost, nutné antioxidanty, práce ve skle, inertní atmosféra N2, -80°C, využití interních standardů Analýza: „Shotgun“ MS (bez separace), UHPLC MS, SFC MS Detail – viz další snímek Bioinformatika (korekce dat, analýza dat-PCA, visualizace, interpretace) METABOLITY PEPTIDŮ METABOLITY PEPTIDŮ Databáze metabolitů HMDB (www.hmdb.ca) and METLIN (metlin.scripps.edu/) databases METABOLITY PEPTIDŮ Aminokyseliny a jejich deriváty: Proteinogenní (20) 1) funkce strukturní (proteiny) 2) další funkce - př. přenos vzruchu v CNS - glycin, kyselina asparagová, kyselina glutamová Neproteinogenní (1000) – specifické funkce (signální, zásobárna org. N, ochrana, neznámé fce) * b-alanin, N-methyl-d-asparagová kyselina NMDA (stimulátor mozkových receptorů), * GABA (přenos vzruchu) Metabolity aminokyselin: methylglycin (=sarkosin - antinádorové účinky); kreatin (derivát glycinu); acetylcholin (mediátor vzruchu), cholin, ethanolamin (derivát serinu); serotonin, melatonin (derivát tryptofanu, regulační funkce); histamin (derivát histidinu); hormony dřeně nadledvinek – př. adrenalin a štítné žlázy (deriváty tyrosinu); 3-nitrotyrosin, o-tyrosin, karboxymethyl nebo MDA adukt lysinu (biomarkery oxidativního stresu), močovina (konečný metabolit degradace aminokyselin) adrenalin METABOLITY PEPTIDŮ příklad Moč – změny v metabolomickém profilu – gastric cancer x healthy controls •Citrátový cyklus (2-oxoglutarate, malic acid, succinic acid, citric acid) •Cyanoamino acid metabolism (glycine, alanine) •Primary bile acid biosynthesis (glycine, taurine, glycocholic acid) •Arginine and proline metabolism (urea, L-proline) http://cnx.org/resources/c2f3048fbb77b49612cd1cf311884b257a3375c3/Figure_07_06_01.jpg METABOLITY PEPTIDŮ příklad Konjugáty s peptidy: Glykosilace, Cysteinylace, Glutathionylace, Oxidační produkty (karboxymethyl), Ubiquitace, Adukty s reaktivními aldehydy ANALÝZY peptidů – viz přednášky (proteiny) Příklad - kvantifikace oxidovaných proteinů - homogenizace- 2Dgel elektroforéza - immunoblotting nebo afinitní kolony- vyjmutí skvrn - trypsin - redukce/derivatizace/značení biotinem-protein indentifikace pomocí MS (fingerprinting) - statistické zpracování dat DALŠÍ METABOLITY (sacharidy, nukleotidy) METABOLITY SACHARIDŮ Jednoduché sacharidy: Příklad: Glukóza • Rozpustná ve vodě, zdroj energie, konstantní hladina v krvi • Stanovení: enzymaticky, spektrofotometricky, amperometricky Deriváty sacharidů: Příklad: Kyselina glukuronová • Konjugační agens v detoxikačních reakcích Konjugáty sacharidů – glykoproteiny. glykopeptidy a glykolipidy: Stanovení obtížné (mnoho struktur s různými chemickými vlastnostmi, často větvené struktury, nízké koncentrace) Příklad konjugujícího sacharidu: N-acetylglukosamin, glukóza, galaktóza, sialové kyseliny, chondroitin sulfát deriváty • Účinky: účastní se imunitních reakcí, buněčné diferenciace, markery nádorových onemocnění, přítomné v buněčné membráně, možná léčiva • Stanovení: LC/MS, immunohistochemie, ELISA, microarray, elektroforéza aj. Cummings, R.D., Pierce, J.M. (2014) The Challenge and Promise of Glycomics,, Chemistry & Biology METABOLITY SACHARIDŮ Stanovení N-glykanů v protilátkách: BioPharm International 28/12 (2015) LC – MS nebo FLD Srovnání GU (glu jednotka) píku s GlycoBase Návrh struktury a kvantifikace METABOLITY NUKLEOTIDŮ nukleotidy: • Adeninové nukleotidy a koenzymy (ATP, ADP, AMP, NADPH, NADH) • Adukty bazí (8-oxodG, 8-OH-dA, dT-glycol, and 5-hydroxy-methyl-dU, adukty s MDA-M1dG) léčiva na bázi nukleotidů: • 6-aza-uridin (cytostatika)-inhibice DNA syntézy • 5-fluorouracil (antimetabolit, analog pyrimidinu) M1dG DALŠÍ “malé molekuly” v ORGANIZMU MALÉ MOLEKULY V ORGANIZMU • Přírodní látky malé oligoeptidy, biogenní aminy, alkaloidy, polyfenoly, barviva, glykosidy, terpenoidy, sinicové toxiny, mykotoxiny, antibiotika, vonné látky • Další (ne v této přednášce) • Farmaka - antibiotika, analgetika, cytostatika • Nutrienty - vitaminy, cukry, mastné kyseliny • Environmentální látky potravinová aditiva, pesticidy, cigaretový kouř Kromě endogenních metabolitů mohou i cizorodé malé molekuly modulovat procesy na všech úrovních (fyziologické, buněčné a molekulární). PŘÍRODNÍ LÁTKY - příklady Biogenní aminy • Dekarboxylace AA, Efedrin, Histamin Alkaloidy • Heterocykly – Nikotin Anatoxin A Polyfenoly • Flavonoidy – antioxidanty, pigmenty, UV ochrana, fytoestrogeny Oligopeptidy • Cyanobakteriální toxiny (microcystin) Nicotin Anatoxin A Microcystin Efedrin Flavonová struktura • Cyanobakteriální toxiny (domoic acid, BMAA) • Rostlinný původ (L-DOPA, BOAA) neurotoxické  kompetice s mediatory vzruchu inkorporace do proteinů  nefunkční proteiny (patologie) Vitamíny • vit E (tokoferoly-lipid) • vit C (kys. askorbová-sacharid) BMAA BOAA Neproteinogenní aminokyseliny Vit C PŘÍRODNÍ LÁTKY - příklady METODY STUDIA METABOLOMU Stanovení metabolitů  Kultivace Zastavení metabolismu  Vzorkování  Extrakce  Derivatizace  Zakoncentrování (SP(M)E)  Separace (GC, LC, CE, TLC)  Analýza (NMR, MS, DAD, FTICR, MALDI)  Vyhodnocení  Statistická analýza PCA - principal component analyses, CA - clustre analyses, heat map Metabolit x Matrice (vzorek) Matrice: krev (rozpuštěné proteiny, lipidy, soli, sacharidy, suspendované buňky) plasma (centrifugací oddělené jen buňky (heparin, EDTA) sérum (oddělené buňky a srážecí proteiny, cca 5%) moč (soli, močovina, metabolity ve volné formě - FA,) mléko (lipidy, proteiny, sacharidy) tkáně (buňky, proteiny, lipidy, sacharidy) dechový kondenzát (voda, částice) sliny (99% voda, dále enzymy, soli, glykoproteiny) mozkomíšní mok (podoba s plasmou, buňky, proteiny, sacharidy) buněčný pelet buněčné médium Metabolit: nízkomolekulární látka nízká a variabilní koncentrace v čase v přítomnosti komplexní matrice volná forma, konjugovaná nebo vázaná na proteiny (glucuronid, sulfát) velká fyzikálně chemická variabilita PŘÍPRAVA VZORKU EXTRAKCE Zastavení buněčného metabolismu (t=s) tzv. metab. zhášení (quenching) Vzorkovací technika (tkáň, extracelulární médium) Uvolnění analytu (homogenizace, rozbití, odstranění buněk) Přečištění, zakoncentrování (SPE, LLE) Derivatizace Odstranění makromolekul, homogenizačního roztoku Výměna rozpouštědel Separace (LC, CE, GC) Homogenizace Musilová J. Chem. Listy 105, 745-751 (2011) Odstranění matrice Odstranění makromolekul • Klíčové je odstranění zejména peptidů/proteinů a lipidů • Proteiny – Srážení – Hydrolýza (6N HCl, teplota, enzymaticky, mikrovlnná extrakce) – Ultrafiltrace – Centrifugace • Lipidy – Gelová permeační chromatografie – Extrakce (LLE) – Vymražení Odstranění homogenizačního roztoku • Lyofilizace • Sušárna • Centrifugace za vakua Přečištění - Zakoncentrování LLE - extrakce kapalina-kapalina • extrakce širokého množství látek, jednoduchá • časová náročnost, variabilní výtěžnost, spotřeba materiálu-odpad SFE - superkritická fluidní extrakce CO2 v nadkritickém stavu, kapalina s vlastnostmi plynu (viskozita, difuze), recyklace (Elektro)dialýza - koncentrační rozdíl nebo rozdíl el. potenciálu na polopropustné membráně Reverzní osmoza, ultrafiltrace - využití hydrostatického tlaku a selektivní membrány TLC – tenkovrstvá kapalinová chromatografie – využití separace tříd lipidů na tenké vrstvě sorbentů, např. úprava před MALDI-MS Přečištění – Zakoncentrování: SPE SPE - extrakce na tuhé fázi – často užívaná metoda (!) • selektivita, automatizace, reprodukovatelnost, časová nenáročnost, malá spotřeba rozpouštědel, miniaturizace, odsolení, výměna rozpouštědel, zakoncentrování, možnost frakcionace • různá kvalita sorbentu, ztráty analytu sorbcí nebo předčasnou elucí při promytí, horší reprodukovatelnost mezi laboratořemi, kolonky na jedno použití Kondicionace Aplikace vzorku Promytí, úprava pH Sušení Eluce Oplach rozpouštědlem, odstranění nečistot z výroby, příprava na solvataci Rychlost Nemusí se vždy využít, odstraní matrici, pomůže odstranit lipidy Odstranění nečistot bez ztráty analytu (voda); možné vysoušet inertním N2 Eluce rozpouštědlem – přerušení vazby analytu a sorbentu Přečištění - Zakoncentrování: SPE SPE výběr kolony (objem vzorku, vlastnosti matrice a analytu) Nepolární interakce: • Reverzní fáze, na pevné fázi navázány uhlovodíkové řetězce (C18, Ph, CN) • Analyty - protonované nebo neutrální molekuly, aromáty, alifatické řetězce • Eluce - nepolární až středně polární rozpouštědla Polární interakce: • Normální fáze, pevná fáze (silikagel) s modifikacemi • Analyty - aminy, alkoholy, fenoly, karboxylové kyseliny, aromatické uhlovodíky, heterosloučeniny • Eluce - středně polární až polární rozpouštědla Iontově výměnné interakce: • Nabitý povrch částice (alkylsulfonáty, tetraalkylamoniová sůl) • Analyty-organické kyseliny, mastné kyseliny • Eluce – rozpouštědlo s daným pH Afinitní interakce: • Imobilizovaný ligand (protilátky) reagující s analytem • Analyty – léčiva, potravinářství Mix interakcí: • Reverzní fáze se silnými/slabými kationtově/aniontově výměnnými skupinami Extrakce Extrakce –vliv postupu na analýzu - příklad Amitriptyline (antidepresivum, pKa 9.4, solubility 9.7 mg/L) v plasmě Extrakce –vliv extrakčního postupu na analýzu - příklad Amitriptyline (antidepresivum, pKa 9.4, solubility 9.7 mg/L) v plasmě http://www.chromatographyonline.com/lcgc/article/articleDetail.jsp?id=564645&pageID=2 srážení kyselinou nepolární interakce mix interakcí – selektivní pro kationty Derivatizace • nezbytná pro GC • stabilizuje molekuly • vnáší chromo/elektrofory do molekuly analytu • mění polární látky na více lipofilní • zvyšuje sensitivitu signálu v MS 1. androsterone 2. dehydroepiandrosterone (DHEA) 3. 17-α-estradiol 4. estrone 5. 17-β-estradiol 6. testosterone 7. derivatization by-product Příklad: Steroid Hormones v moči GC/MS derivatizace „Silylation“ Více : Hanbook of sample preparation (2010) ISBN 978-0-470-09934-6 SEPARACE A ANALÝZA Separace Chromatografie - dělení látek ze směsi mezi stacionární a mobilní fázi oddělí i isomery (různá struktura), isobary (různé molekuly) Elektroforéza - dělení na základě pohyblivosti nabitého analytu nebo micel v kapalině v elektrickém poli (CZE, MEKC) vhodné pro látky s nábojem (organické kys., nukleotidy), Výhoda: měření obsahu látek v malém objemu Iontová mobilita - dělení iontů v plynné fázi na základě různé pohyblivosti v elektrickém poli vhodné pro směsi malých molekul (např. isomery) až po megadalton proteinové complexy Uspořádání HPLC Uspořádání GC Separace Mobilní fáze Stacionární fáze tR retenční čas látky zdržující se v systému MF vs. SF tM retenční čas látky, která se pohybuje spolu s MF bez zdržení FM objem mobilní fáze za čas VM mrtvý objem (FM*tM) • Náboj – ionex • Hydrofobicita – reverzní fáze, normální fáze, HILIC • Biospecifická afinita – afinitní kolona • Velikost a tvar molekuly – gelová kolona (sephadex, sepharoza) • Plyn • Kapalina • Zkapalněný plyn • gradient vs. Isokratika LC - separace Princip kapalinové chromatografie: http://chemwiki.ucdavis.edu LC - separace Stacionární fáze - podobné principy s SPE - materiál více homogenní, malé částice (micrometry) - opakované použití (vs. SPE – single use only) Ionex kation-anion exchange; eluce zvýšení iontové síly, změna pH Reverzní fáze hydrofobní povrch; eluce zvýšením hydrofobicity, nejvyužívanější stacionární fáze LC - separace Afinitní kolona Specifický povrch; biochemické interakce, eluce nízkým pH, vyšší koncentrace soli, často v sérii s další kolonou Gelová kolona Náplň tvoří silikagel nebo polymery, velké molekuly obtečou, malé se zdrží difúzí v pórech. HILIC, NP kolona Hydrofilní polymery nebo silikagel s různými polymery, eluce zvýšeným podílem vody (př. dělení aminokyselin, sacharidů) LC - separace Využití více kolon Například 2D - LC uspořádání nejprve iontově výměnné a pak reverzní fáze (využití např. v proteomice) Chirální kolona Separuje enantiomery, využití například ve farmakologii GC – separace MF: inertní plyn, N2, Ar, He, CO2, isokratika (konst. teplota plynu), gradient (teplotní gradient) SF: kolonky (Al, Cu, Ni, sklo), 1-5 m se sorbenty (silikagel, alumina, active carbon) Analyt: těkavá ale teplotně stabilní látka, často nutná derivatizace, nízký limit detekce Ve spojení s MS v posledních letech velmi využívaná v metabolomice  knihovny hmotnostních spekter (u LC – různá spektra za různých podmínek: tvorba knihoven omezená) Analyzátory - Detektory • fotometrický detektor – absorpce fotonů chromoforem (metabolity s dvojitými vazbami, aromatické sloučeniny, některé heteroatomy) • fluorescenční detektor – emise fotonů z „excitovaných molekul“ (PAH a jejich deriváty, nebo metabolity po konjugaci – vnesení fluoroforu) • elektrochemický detektor – změna elektrické veličiny po elektrochemické reakci látky v cele detektoru s elektrodami (látky lehce oxidovatelné, redukovatelné, fenoly, aromatické aminy, peroxidy, merkaptany, ketony, aldehydy, konjugované nitrily, aromatické halogenované sloučeniny) Analyzátory – Detektory – Hmotnostní detekce Nejvyužívanější - targeted metabolomics: (LC)-MS - untargeted metabolomics: vysokorozlišovací MS (Orbitrap, QTOF) Obecné principy MS analyzátorů separace iontů dle jejich doby letu, zakřivení dráhy letu, oscilací, frekvencí cyklického pohybu a to v elektrických, elektromagnetických a nebo magnetických polích konečná detekce – řada principů (měření hodnoty iontového proudu, detekce emitovaných částic-scintilace, elektronové násobiče, fotonásobiče) softwarové zpracování  vyhodnocení  záznam „intenzity“ v čase (pík)  Vznik iontů (zdroje iontů) PI fotoionizace EI elektronová ionizace - malé nepolární molekuly, spojení s GC ESI elektrosprej – spojení s CE, LC DESI desorpce elektrosprejem – bez separace APCI chemická ionizace APPI fotoionizace UV zářením -hydrofobní látky – steroidy MALDI desorpce a ionizace laserem za nebo bez účasti matrice Analyzátory TOF napětí urychluje ionty, m/z malé, t krátký, vhodné pro analýzy směsí, ve spojení s MALDI identifikace proteinů, vysokorozlišovací detekce OrbiTrap ionty oscilují v elektrostatickém poli a vytváří zaznamenatelný proud úměrný jejich m/z, vysokorozlišovací Kvadrupoly změna radiofrekvenčního pole na elektrodách vytváří filtr pro dané m/z, ionty s daným m/z se pak dělí v prostoru, omezený hmotnostní rozsah Lineární a sférické iontové pasti podoba s kvadrupoly, ionty zakoncentrovány a izolovány ne v prostoru, ale v čase Analyzátory – Detektory – Hmotnostní detekce Analyzátory – další detektory NMR - Nukleární magnetická resonance Zlatý standard 1H-NMR sleduje odezvy jader s nenulovým magnetickým momentem v silném magnetickém poli a jejich interakci s vysokofrekvenčním elektromagnetickým vlněním nedestruktivní technika • minimální příprava vzorku před analýzou• snadná identifikace neznámých sloučenin • možnost měření in vivo • kvantifikovatelná • nevyžaduje derivatizaci vyšší požadavky na množství vzorku • nízká citlivost FTICR – Iontová cyklotronová rezonance s Fourierovou transformací ionty v cele v silném magnetickém poli se pohybují v cyklech s frekvencí úměrnou jejich m/z, záznam frekvence se převádí FR na hmotnostní spektrum ultracitlivá MS • spektra s nejvyšším rozlišením a přesností • identifikace tisícovek metabolitů bez předchozí separace nárok na prostor a vakuum • vysoká cena Metabolomika Metabolomika – MS záznam Příklad: metabolity Trazodonu (antidepresivum a sedativum, vedlejší účinky poškození jater) konjugované s GSH Drug Metabolism and Disposition - http://dx.doi.org/10.1124/dmd.107.019471 Chromatogram - scan: intenzita všech iontů metabolitů (Q1) v závislosti na čase Spectrum: Intenzita prekurzorového iontu M6 (Q1) a produktových iontů M6 (Q3) MSI – hmotnostně spektrometrické zobrazování (farmacie, medicína, hledání biomarkerů, objasnění biochemických pochodů) Zobrazovací techniky detekce Info o molekulách (Optická mikroskopie) (procházející “viditelné” záření) (barvení: chemické reakce např. s proteiny..) Elektronová mikroskopie elektronů Jen prvková analýza Rentgenová spektroskopie rentgen. záření Jen prvková analýza Autoradiografie fotonů (IR) Funkční skupiny Pozitronová emisní tomografie g-záření Značené molekuly Fluorescenční mikroskopie fotonů (UV, VIS) Značené molekuly Hmotnostní spektrometrie (MALDI-MSI, DESI- MSI) (an)organické ionty Ano Fujimura, Y., Miura, D. Metabolites 2014, 4(2), 319-346 Analyzátory zobrazovací techniky Fujimura, Y., Miura, D. Metabolites 2014, 4(2), 319-346 MSI Př. Analýza metabolitů lipidů v mozku - MALDI-MSI Imunoanalýza (immunoassays) Reakce antigenu s protilátkou, kdy enzymově značené (ALP, HRP) nebo radioaktivně značené (125 I) antigeny nebo protilátky se měří pomocí fluorescence/absorbance/chemiluminiscence po reakci dodaného substrátu s enzymem (nebo v případě radioaktivního značení měřením scintilace) . Analyt: steroidy, hormony, (glyko)lipidy, peptidy, sekundární metabolity Protilátky polyklonální: po imunizaci zvířete, protilátky proti různým epitopům, silná afinita Protilátky monoklonální: produkce buněčnými liniemi, proti jednomu epitopu, možná krosreaktivita Kompetitivní EIA, RIA (enzyme) radioimmunoassay ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay Imunoanalýza (immunoassays) Praktické poznámky, validace Výběr vhodného blanku: Kontrolní vzorek: čistá voda nebo arteficiální „tkáň (arteficiální moč, voda z „čisté“ lokality), rozpouštědlo (vyloučení kontaminace během procesu), instrumentální blank (chování vzorku během analýzy, opakované měření mezi vzorky) Výběr vhodné metody extrakce a analýzy: Selektivita: schopnost nalézt a kvantifikovat analyt v matrici Accuracy a Precision: měření známé koncentrace analytu v replikátu Spike recovery: zjištění změny známé koncentrace analytu (surrogate standard) způsobené procesem extrakce, analýzy Kvantifikace: Vhodná detekce (MS, DAD, ECD) Kalibrace: interní, externí standard v čisté matrici nebo rozpouštědle Snížení vlivu matrice: nízký nástřik, přítomný interní standard, standardní přídavek analytu Další parametry kvantifikace: LOD, LOQ, Linearita kalibrace, Quality control, Příklady stanovení metabolitů (oligopeptidy a lipidy) Analýza metabolitů – thioly (příklad) Stanovení: thioly Stanovení GSH/GSSG (cytosol) a CyS/CySS (plasma), GSH: antioxidant, kofaktor peroxidáz, reverzibilní oxidace na GSSG, konjugační agens pro xenobiotika i endogenní látky (chrání peptid před oxidací vratným navázáním na cystein), správný poměr GSH/GSSG důležitý pro homeostázu • Homogenizace-redukce S=S z peptidu (DTT)-srážení proteinů kyselinoukonjugace-SH skupiny (NEM, DTNB, DansylCl, IAA)- chromatografie-MS, spektrofotometrie, fluorometrie, elektrochemická detekce • ELISA • Příklad stanovení volného GSH a GSSG ve tkáni Modelový příklad Vliv nanončástic Cd po respirační expozici u myší – Expozice 13 týdnů – 5 myší: Kontroly (K), dvě „dávky” Cd (D1, D2) – Vyhodnocení fyziologických a toxikologických parametrů • Př.: peroxidace lipidů, změny enzymové aktivity, GSH / GSSG Bláhová (2014) Anal Bioanal Chem 406:5867–5876 Bharavi K et al. Indian J Pharmacol 2011;43:45-9 Modelový příklad – výzkumná studie Ukončení experimentu: na co dát pozor? • VZORKOVÁNÍ – Organizace odběrů • 3 skupiny, zpracovávat “současně” nebo „náhodně“ – Výběr tkání pro analýzu • Respirační cesta  primárně plíce; pak orgány citlivé k Cd (ledviny, prostata, játra, kosti) – Rychlost zpracování • Velká rychlost nutná ! Malé molekuly - rychlý turnover – Celý orgán ihned do tekutého dusíku – Udržování a transport • Stále v mraženém stavu – 80°C Bláhová (2014) Anal Bioanal Chem 406:5867–5876 Modelový příklad – výzkumná studie Zpracování vzorku: na co dát pozor? • HOMOGENIZACE – Odběr části (reprezentativní alikvot) • zmrzlá tkáň • vážení orgánu – Přidání homogenizačního roztoku • kontrola pH, iontové síly – vodný pufr (GSH-GSSG dobře rozpustné ve vodě) • práce v ledu(!) – Homogenizace • vysokorychlostní třepání (s) • stálé chlazení Bláhová (2014) Anal Bioanal Chem 406:5867–5876 Další úpravy vzorku: na co dát pozor? • EXTRAKČNÍ KROKY – Vhodné pH • Zajištěno alkalickým pufrem (použit již pro extrakci) – Reakce – co nejméně kroků, přesné pipetování • Přidání INTERNÍHO STANDARDU (izotopicky značený GSH a GSSG) • Přidání konjugačního činidla: blokování reaktivních –SH skupin (DTNB) – zabrání oxidaci během extrakce • Konjugace (T-lab, pH vyšší – podmínky vhodné pro rekaci) – Vysrážení proteinů • Přidání kys. sulfosalycilové (pH nízké) • Srážení (opět chlazení) • Centrifugace (opět chlazení) – Ředění vzorku • Snížení “vysoké” koncentrace GSH a zachování detekovatelnosti přirozeně „nízké“ koncentrace GSSG • Menší vliv matrice po ředění • Analyt rozpuštěn v MF, lepší dělení při chromatografii – Uchování k analýze -80°C Modelový příklad – výzkumná studie Bláhová (2014) Anal Bioanal Chem 406:5867–5876 Modelový příklad – výzkumná studie Analýza: na co dát pozor? – Typ separace – LC, GC, bez separace – Výběr kolony • modifikovaná C18 (analyty jsou polárnější) – Detekce • elektrochemická (redoxní reakce na -SH) • ELISA • UV-VIS (detekce barevného konjugátu GSH-DTNB , ne! GSSG) • hmotnostní detekce (GSH-DTNB (konjugovaný GSH), 13C-15NGSH-DTNB (konjugovaný interní standard GSH), GSSG a GSSG – I.S.) – Vyhodnocení (kalibrace s int. standardy) – Množství analytu: GSH (GSSG)/mg proteinů, GSH (GSSG)/mg tkáně; poměr GSH/GSSG Bláhová (2014) Anal Bioanal Chem 406:5867–5876 Modelový příklad – výzkumná studie Vyhodnocení Fig. 6 Content of GSH (a), content of GSSG (b), and GSH/ GSSG ratio (c) in lung of mice after chronic exposure (13 weeks) to CdO nanoparticles at dose 1 (D1) and dose 2 (D2). Numbers with asterisk (*) in the graph indicate significant differences compared to the control variant within the respective week (p<0.05; N=5 animals) Bláhová (2014) Anal Bioanal Chem 406:5867–5876 • Student(ka) by měl(a) znát – Co je to metabolomika, metody stanovení metabolomu – Co jsou to metabolity? Jaké existují typy a skupiny? Významné metabolity lipidů, AA, NA – Jaké jsou klíčové kroky v jejich analýze? Principy metod extrakce, separace a detekce – U vybrané látky navrhnout a diskutovat přístup k analýze z biologického vzorku Shrnutí