Tkáně/organismus
Metody studia tkání a orgánů
Dráhy škodlivého účinku
Klára Hilscherová
RECETOX
Obsah přednášky
Tři tematické bloky
1. Dráhy škodlivých účinků
(Adverse outcome pathways)
2. Metody analýzy tkání
3. Transgenní organismy
OrganismusChemikálie
Škodlivé účiky
Mortalita
Inhibice růstu
Ovlivnění reprodukce
Malformace
Změny chování
…
+
Tradiční přístupy – Hodnocení škodlivého účinku na úrovni organismu
Hodnocení toxicity chemických látek
• Údaje o toxicitě existují pouze pro několik set z desítek tisíc látek, které jsou vyráběny/prodávány
• Zásadní nedostatek informací ohledně potenciálních rizik řady látek
• Rostoucí požadavky regulatorních orgánů na toxikologická data pro velký počet látek – nemožné
získat tradičními postupy Snaha o efektivnější, rychlejší a levnější přístupy k
hodnocení bezpečnosti/rizika látek
Současné hodnocení nebezpečnosti – často k dispozici především krátkodobé, akutní testy, nebo jen
základní dlouhodobější (mortalita, růst, reprodukce)
využívány extrapolace – z akutních na chronické účinky, mezi druhy
- používány faktory nejistoty – problematické – nemožno predikovat dlouhodobější subletální účinky z
akutních testů, neznáme mechanismy
Organismus
Škodlivé účiky
Mortalita
Inhibice růstu
Ovlivnění reprodukce
Malformace
Změny chování
…
+
Tradiční přístupy – Hodnocení škodlivého účinku na úrovni organismu
+10^4 Látek HTS
Chemicko-biologické interakce
Informace o mechanismech
Interakce s receptory
Ovlivnění signálních drah
Aktivity enzymů
Ovlivnění buněčných procesů
…
Hodnocení toxicity chemických látek
Nové přístupy - Hodnocení účinků na nižších úrovních biologické organizace
- Ex vivo / in vitro / In chemico / In silico metody
- ovlivnění genů, proteinů, buněčných funkcí, biomarkerů
- Testování s vysokou propustností (HTS – high throughput screening)
?
5
Hodnocení relevantních účinků
Hodnocení rizik
C2Cl3
Cl
ClC
C2Cl3
Cl
ClC
Cl
Cl
ClCl
Cl
Cl
Cl
ClCl
Cl
Cl
Cl
Cl
OH
OH
OH
Cl
Cl
OH
Cl
Cl
ClCl
Cl
Cl
Cl
ClCl
Cl
Cl
C2Cl3
Cl
ClC
C2Cl3
Cl
ClC
Cl
Cl
ClCl
Cl
Cl
Cl
ClCl
Cl
Cl
Cl
Cl
OH
OH
OH
Cl
Cl
OH
Cl
Cl
ClCl
Cl
Cl
Cl
ClCl
Cl
Cl
Inventarizace chemických látek
C2Cl
3
C
l C
l
C
C2Cl
3
C
l C
l
C
C2Cl
3
C
l C
l
C
C2Cl
3
C
l C
l
C
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l C
l
C
l
C
l
C
l
O
H
O
H
O
H
C
l
C
l
O
H
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l C
l
C
l
O
H
C2Cl
3
C
l C
l
C
C
l
C
l
O
H
O
H
C
l
C
l
O
H
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l C
l
C
l
C
l
C
l
O
H
O
H
C
l
C
l
O
H
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l C
l
C
l
O
H
C
l
C
l
O
H
O
H
O
H
C
l
C
l
O
H
C
l
C
l
O
H
O
H
C
l
C
l
O
H
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l
C
l C
l
C
l
O
HC
l
C
l
O
H
In Vitro
charakterizace:
Molekulární interakce,
Buněčné odpovědi
Existující znalosti
data ohledně expozice,
toxicity, SAR, QSAR
Efektivně cílené
In Vivo Testy
Proces
Prioritizace
Výzkum:
Doplnění
informací
Biologické dráhy, jejichž narušení vede ke škodlivým účinkům látek
Dráhy toxicity
Receptory / Enzymy / atd.
Přímé molekulární interakce
Regulace signálních drah /
Transcriptomika, Proteomika
Buněčné procesy
Tkáň / Orgán / Organismus Tox Endpoint
Chemická látka
Biologic
Inputs
Normal
Biologic
Function
Adverse
effect
Mortality
Cell
Injury
Adaptive Stress
Responses
Early Cellular
Changes
Exposure
Tissue Dose
Biologic Interaction
Perturbation
Low Dose
Higher Dose
Higher yet
Nový přístup: Aktivace drah toxicity
Biologic
Inputs
Normal
Biologic
Function
Cell
Injury
Adaptive Stress
Responses
Early Cellular
Changes
Exposure
Tissue Dose
Biologic Interaction
Perturbation
Low Dose
Higher Dose
Higher yet
NAS Report: Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and A Strategy
Molekulární
iniciační událost
(Molecular
Initiating Event)
Škodlivý účinek
Nový přístup: Aktivace drah toxicity
Adverse
effect
Mortality
Dráha škodlivého účinku (Adverse Outcome Pathway)
a Chemické Extrapolace
Buněčné
odpovědi
Tkáň/
Orgán
Jedinec
Změna
struktury
buněk,
buněčných
funkcí
Změna
struktury tkání
(patologie),
funkcí
Změna
Funkce,
Chování,
Patologické
poškození
Buněčné
Cíle
Dráha toxicity
Dráha škodlivého účinku
Receptory,
Enzymy,
Iontové kanály,
Membránové
proteiny,
atd.
Chemická
látka
(Metabolity))
Testovány
sady látek pro
extrapolace v
rámci
databází
(QSAR;
Kategorizace;
Analogie) –
identifikace
vlastností
látek, které
jim umožňují
narušovat
buněčné cíle
Dráha škodlivého účinku (Adverse Outcome Pathway) = sled událostí od počátečního
(iniciačního) bodu přes dráhu toxicity (Toxicity Pathway) ke škodlivému účinku
Toxická dráha/dráha toxicity (Toxicity Pathway) = dráha buněčné odpovědi, která
pokud je dostatečně silně narušena, povede k negativním zdravotním účinkům
Vývoj a Rámec AOP / MOA
Mezinárodní spolupráce – vývoj rámců a modelů
OECD – Dráha škodlivého účinku (Adverse Outcome Pathway, AOP)
WHO – Mechanismy účinku (Mode of action, MOA)
• Koncept rozvíjen/podporován v rámci OECD, USEPA, EC-JRC, USFDA, WHO, US Army
• OECD Guidance document & a template for developing and assessing adverse outcome
pathways (No. 184)
• Pravidla pro vývoj, hodnocení a schvalování AOP
• Formální proces
• Vývoj & podpora informačních nástrojů pro rychlé, široce dostupné sdílení již vytvořených
AOP a pro budování nových AOP
• => Inspirace sociálními médii, crowd-sourcing
Gerald T. Ankley et al. (2010) Adverse outcome pathways: A conceptual framework to
support ecotoxicology research and risk assessment. Environmental Toxicology and
Chemistry Volume 29, Issue 3, pages 730–741, March 2010
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/etc.34/pdf
Cíle a využití AOP konceptu
• porozumět toxicitě látek na molekulární
úrovni
• Používat co nejméně pokusných zvířat
(principy 3R)
• Postavit prediktivní modely
• Skríning a prioritizace
• Studovat a hodnotit mnoho látek –
zaměřit se na chybějící informace
• kombinovat High-throughput screening
s počítačovými modely
• Zlepšit možnosti využití informací a dat
o mechanismech účinku pro hodnocení
rizik a regulační účely
Cancer
ReproTox
DevTox
NeuroTox
PulmonaryTox
ImmunoTox
in vitro testing
Bioinformatics/
Machine Learning
Hlavní principy AOP
Molekulární iniciační událost (Molecular Initiating Event)
interakce látky s biologickým systémem na makromolekulární úrovni
12
Ankley et al. 2010
Klíčové události (key events)
• mezikroky, které jsou toxikologicky relevantní a vedou k škodlivému účinku
• jsou základem pro formulování hypotéz a testování => musí být experimentálně
kvantifikovatelné
 Molekulární iniciační událost nebo klíčové události (Key Events) – měřitelné in
vitro - lze je zpravidla hodnotit pomocí rychlých skríningových metod
 Kauzální důkazy pro in vivo účinky
 AOP zahrnuje účinky na populační úrovni
Dráha škodlivého účinku
Adverse Outcome Pathway
Chemical
Organism
Response
Population
Response
In vivo
Lethality
Impaired
Development
Impaired
Reproduction
Altered Sex Ratio
Extinction
Adverse Outcome
Chemical
Organism
Response
Population
Response
In vivo
Lethality
Impaired
Development
Impaired
Reproduction
Altered Sex Ratio
Extinction
Organism
Response
Chemical
Property
Receptor/Ligand
Interactions
DNA Binding
Protein Oxidation
Adverse Outcome
Macro-
Molecular
Interaction
Dráha škodlivého účinku
Adverse Outcome Pathway
Chemical
Organism
Response
Population
Response
In vivo
Lethality
Impaired
Development
Impaired
Reproduction
Altered Sex Ratio
Extinction
Organism
Response
Chemical
Property
Receptor/Ligand
Interactions
DNA Binding
Protein Oxidation
Adverse Outcome
Macro-
Molecular
Interaction
Cellular
Response
Gene Activation
Protein Production
Altered Signaling
Dráha škodlivého účinku
Adverse Outcome Pathway
Chemical
Organism
Response
Population
Response
In vivo
Lethality
Impaired
Development
Impaired
Reproduction
Altered Sex
Ratio
Extinction
Organism
Response
Chemical
Property
Receptor/Ligand
Interactions
DNA Binding
Protein Oxidation
Adverse Outcome
Macro-
Molecular
Interaction
Cellular
Response
Gene Activation
Protein
Production
Altered Signaling
Organ
Response
Tissue Effect
Altered Physiology
Disrupted Homeostasis
Altered Development / Function
Dráha škodlivého účinku
Adverse Outcome Pathway
Chemical
Organism
Response
Population
Response
In vivo
Lethality
Impaired
Development
Impaired
Reproduction
Altered Sex
Ratio
Extinction
Macro-
Molecular
Interaction
Cellular
Response
Organ
Response
Organism
Response
Tissue Effect
Chemical
Property
Receptor/Ligand
Interactions
DNA Binding
Protein Oxidation
Gene Activation
Protein
Production
Altered Signaling
Altered Physiology
Disrupted Homeostasis
Altered Development / Function
In silico, In chemico, In Vitro, Ex vivo
Adverse Outcome
propojení informací o interakcích chemikálií s biologickými systémy (makromolekulami, buňkami,
tkáňemi…) s informacemi o relevantních biologických odpovědích, které vedou ke škodlivému
účinku (in vivo)
Dráha škodlivého účinku
Adverse Outcome Pathway
• série definovaných a kauzálně spojených událostí napříč různými úrovněmi biologické organizace, které vedou k
poškození zdraví nebo (eko)toxicitě
• Využití existujících znalostí a informací k propojení dvou ukotvujících bodů: Molekulární iniciační událost (Molecular
Initiating Event, MIE) a Škodlivý účinek (Adverse Outcome, AO) přes sérií mezikroků, tzv. Klíčové události (Key Events)
• AOPs umožňuje propojit výsledky z in vitro studií a in vitro screeningu se škodlivými účinky na úrovni organismu
nebo populací
Chemical
Macro-
Molecular
Interaction
Cellular
Response
Organ
Response
Organism
Response
Population
Response
Molecular
Initiating
Event
Key
Event 1
Key
Event 2
Adverse Outcome
Tissue Effect
Key
Event 3
Chemical
Property
Receptor/Ligand
Interactions
DNA Binding
Protein Oxidation
Gene Activation
Protein
Production
Altered Signaling
Altered Physiology
Disrupted Homeostasis
Altered Development / Function
Lethality
Impaired
Development
Impaired
Reproduction
Altered Sex
Ratio
Extinction
Dráha škodlivého účinku (Adverse Outcome Pathway)
In silico, In chemico, In Vitro, Ex vivo In vivo
Chemical
Macro-
Molecular
Interaction
Cellular
Response
Organ
Response
Organism
Response
Population
Response
Molecular
Initiating
Event
Key
Event 1
Key
Event 2
Adverse Outcome
Tissue Effect
Key
Event 3
Chemical
Property
Receptor/Ligand
Interactions
DNA Binding
Protein Oxidation
Gene Activation
Protein
Production
Altered Signaling
Altered Physiology
Disrupted Homeostasis
Altered Development / Function
Lethality
Impaired
Development
Impaired
Reproduction
Altered Sex
Ratio
Extinction
Dráha škodlivého účinku (Adverse Outcome Pathway)
Dráha Toxicity (Toxicity Pathway)
Mechanismus účinku (Mode of Action)
In silico, In chemico, In Vitro, Ex vivo In vivo
• série definovaných a kauzálně spojených událostí napříč různými úrovněmi biologické organizace, které vedou k
poškození zdraví nebo ekotoxicitě
• Využití existujících znalostí a informací k propojení dvou ukotvujících bodů: Molekulární iniciační událost (Molecular
Initiating Event, MIE) a Škodlivý účinek (Adverse Outcome, AO) přes sérií mezikroků, tzv. Klíčové události (Key Events)
• AOPs umožňuje propojit výsledky z in vitro studií a in vitro screeningu se škodlivými účinky na úrovni organismu
nebo populací
• Identifikace interakce látky s biologickým systémem na makromolekulární úrovni – Kotva 1 = MIE
• Identifikace konečného důsledku vyvolaného MIE – Kotva 2 = AO
• Identifikace jednotlivých mezikroků na základě známých / dostupných informací o AO
Vývoj AOP
Konkrétní AOP: vždy 1 molekulární iniciační událost (MIE) => 1 dráha škodlivého účinku (AOP)
• stejná MIE může vést k jinému AO => vždy nutno definovat jako zvláštní AOP
• dvě různé MIE mohou vést ke stejnému AO => vždy nutno definovat jako zvláštní AOP
• počet definovaných klíčových událostí (KE) není omezen
MIE, KE, AO – mohou být sdíleny mezi různými AOPs => syntéza, propojení informací do jednoho celku
AOP Hodnocení
• Completeness (reliability & robustness)
• Qualitative Understanding
• Weight-of-Evidence supporting AOP (Bradford-Hill criteria)
• Quantitative Understanding
Reproductive
Impairment
Dráha škodlivého účinku
(Adverse Outcome Pathway)
ER-zprostředkované narušení reprodukce
Měření napříč různými úrovněmi biologické organizace
In vivo
INDIVIDUAL
Sex
reversal
Altered
behavior
Reprod.
In vivo
INDIVIDUAL
Skewed
Sex
Ratios
Yr Class
POPULATION
Dráha škodlivého účinku
(Adverse Outcome Pathway)
ER-zprostředkované narušení reprodukce
Měření napříč různými úrovněmi biologické organizace
Sex
reversal
Altered
behavior
Reprod.
In vivo
INDIVIDUAL
Skewed
Sex
Ratios
Yr Class
POPULATION
Gonad
Ova-testis
Sex-
reversed
Gonad
Fecundity
TISSUE/ORGAN
Dráha škodlivého účinku
(Adverse Outcome Pathway)
ER-zprostředkované narušení reprodukce
Měření napříč různými úrovněmi biologické organizace
Liver
Altered
gene products
Gonad
Ova-testis
Sex-reversed
Fecundity
Sex
reversal
Altered
behavior
Repro.
In vivo
TISSUE/ORGAN INDIVIDUAL
Skewed
Sex
Ratios
Yr Class
POPULATION
Dráha škodlivého účinku
(Adverse Outcome Pathway)
ER-zprostředkované narušení reprodukce
Měření napříč různými úrovněmi biologické organizace
Liver Cells
Altered Protein
Expression
(marker)
(effect)
Vitellogenin
Liver
Altered
gene products
Gonad
Ova-testis;
Sex-reversed;
Fecundity
Sex
reversal;
Altered
behavior;
Repro.
Adverse Outcome Pathway
ER-mediated Reproductive Impairment
Measurements across levels of biological organization
In vivo
CELLULAR
Response
TISSUE/ORGAN INDIVIDUAL
Skewed
Sex
Ratios;
Yr Class
POPULATION
Receptor
Binding
ER-
Chemical
Binding
Liver Cells
Altered Protein
Expression
(marker)
(effect)
Vitellogenin
Liver
Altered
gene products
(timing, amt)
Gonad
Ova-testis
Sex-reversed
Fecundity
Sex
reversal
Altered
behavior
Reprod.
In vivo
MOLECULAR
Target
CELLULAR
Response
TISSUE/ORGAN INDIVIDUAL
Skewed
Sex
Ratios
Yr Class
POPULATION
Dráha škodlivého účinku
(Adverse Outcome Pathway)
ER-zprostředkované narušení reprodukce
Měření napříč různými úrovněmi biologické organizace
QSAR
focus
area
Chemicals
Receptor
Binding
ER
Binding
Liver Cells
Altered
Protein
Expression
Vitellogenin
Liver
Altered
proteins
Gonad
Ova-testis
Sex-
reversed
Fecundity
Sex
reversal
Altered
behavior
Repro.
In vivo
MOLECULAR
Target
CELLULAR
Response
TISSUE/ORGAN INDIVIDUAL
Skewed
Sex
Ratios
Yr Class
POPULATION
In vitro Assay
focus area
Toxicity Pathway
Adverse Outcome Pathway
Dráha škodlivého účinku
(Adverse Outcome Pathway)
ER-zprostředkované narušení reprodukce
Měření napříč různými úrovněmi biologické organizace
QSAR
focus
area
Chemicals
Receptor
Binding
ER
Binding
Liver Cells
Altered
Protein
Expression
Vitellogenin
Liver
Altered
proteins
Gonad
Ova-testis
Sex-
reversed
Fecundity
Sex
reversal
Altered
behavior
Repro.
In vivo
MOLECULAR
Target
CELLULAR
Response
TISSUE/ORGAN INDIVIDUAL
Skewed
Sex
Ratios
Yr Class
POPULATION
In vitro Assay
focus area
Risk Assessment RelevanceToxicological Understanding
Dráha škodlivého účinku
(Adverse Outcome Pathway)
ER-zprostředkované narušení reprodukce
Měření napříč různými úrovněmi biologické organizace
Ankley et al. 2010
Využití dráhy škodlivého účinku
Základ pro:
Extrapolace mezi chemickými látkami
Extrapolace mezi druhy
Extrapolace mezi úrovněmi biologické organizace
Definování parametrů charakterizace rizika, které potřebujeme zjistit:
- Prioritizace chemických látek pro další testování
(využití QSAR modelování)
- Detailnější hodnocení rizika (např. stanovení referenční
dávky, koncentračních limitů)
Typ potřebné informace se liší i dle akceptovatelné míry nejistoty
ER Binding ERTransctivation
VTG mRNA
Vitellogenin Induction
Sex Steroids
AlteredReproduction/Development
Molecular Cellular Organ Individual
Chemical 3-DStructure/Properties
Chemical 2-DStructure
Structure
ER Binding ERTransctivation
VTG mRNA
Vitellogenin Induction
Sex Steroids
AlteredReproduction/Development
Molecular Cellular Organ Individual
Chemical 3-DStructure/Properties
Chemical 2-DStructure
Structure
ER Binding ERTransctivation
VTG mRNA
Vitellogenin Induction
Sex Steroids
AlteredReproduction/Development
Molecular Cellular Organ Individual
Chemical 3-DStructure/Properties
Chemical 2-DStructure
Structure
ER Binding ERTransctivation
VTG mRNA
Vitellogenin Induction
Sex Steroids
AlteredReproduction/Development
Molecular Cellular Organ Individual
Chemical 3-DStructure/Properties
Chemical 2-DStructure
Structure
ER Binding ERTransctivation
VTG mRNA
Vitellogenin Induction
Sex Steroids
AlteredReproduction/Development
Molecular Cellular Organ Individual
Chemical 3-DStructure/Properties
Chemical 2-DStructure
Structure
ER Binding ERTransctivation
VTG mRNA
Vitellogenin Induction
Sex Steroids
AlteredReproduction/Development
Molecular Cellular Organ Individual
Chemical 3-DStructure/Properties
Chemical 2-DStructure
Structure
ER Binding ERTransctivation
VTG mRNA
Vitellogenin Induction
Sex Steroids
AlteredReproduction/Development
Molecular Cellular Organ Individual
Chemical 3-DStructure/Properties
Chemical 2-DStructure
Structure
ER Binding ERTransctivation
VTG mRNA
Vitellogenin Induction
Sex Steroids
AlteredReproduction/Development
Molecular Cellular Organ Individual
Chemical 3-DStructure/Properties
Chemical 2-DStructure
Structure
ER Binding ERTransctivation
VTG mRNA
Vitellogenin Induction
Sex Steroids
AlteredReproduction/Development
Molecular Cellular Organ Individual
Chemical 3-DStructure/Properties
Chemical 2-DStructure
Structure
ER Binding ERTransctivation
VTG mRNA
Vitellogenin Induction
Sex Steroids
AlteredReproduction/Development
Molecular Cellular Organ Individual
Chemical 3-DStructure/Properties
Chemical 2-DStructure
Structure
ER Binding ERTransctivation
VTG mRNA
Vitellogenin Induction
Sex Steroids
AlteredReproduction/Development
Molecular Cellular Organ Individual
Chemical 3-DStructure/Properties
Chemical 2-DStructure
Structure
ER Binding ERTransctivation
VTG mRNA
Vitellogenin Induction
Sex Steroids
AlteredReproduction/Development
Molecular Cellular Organ Individual
Chemical 3-DStructure/Properties
Chemical 2-DStructure
Structure
ER Binding ERTransctivation
VTG mRNA
Vitellogenin Induction
Sex Steroids
AlteredReproduction/Development
Molecular Cellular Organ Individual
Chemical 3-DStructure/Properties
Chemical 2-DStructure
Structure
ER Binding ERTransctivation
VTG mRNA
Vitellogenin Induction
Sex Steroids
AlteredReproduction/Development
Molecular Cellular Organ Individual
Chemical 3-DStructure/Properties
Chemical 2-DStructure
Structure
ER Binding ERTransctivation
VTG mRNA
Vitellogenin Induction
Sex Steroids
AlteredReproduction/Development
Molecular Cellular Organ Individual
Chemical 3-DStructure/Properties
Chemical 2-DStructure
Structure
Knihovny drah toxicity (Toxicological Pathways)
Receptor/Ligand
Interaction
•Gene
Activation
•Protein
Production
•Gonad
Development
•Altered Hormone
Levels
Impaired
Reproduction
Molecular Cellular Organ Individual
Chemical 3-
D
Structure/
Properties
Chemical
2-D
Structure
Structure
Mapování toxických drah, které vedou ke
škodlivému účinku
OECD-sponsorovaná AOP znalostní databáze
(AOP Knowledgebase)
• Effectopedia (OECD)
• AOP Xplorer (US Army Corps of Engineers)
• Intermediate Effects DB (JRC)
• AOP Wiki
• https://aopkb.org/aopwiki/index.php/Main_Page
• Platforma odvozená od Wiki - pro vývoj a sdílení AOPs
• Společný projekt Evropské komise - JRC a U.S. Environmental
Protection Agency (EPA)
• Editace možná pouze členy OECD AOP projektu
• http://www.effectopedia.org/ -> odkaz na program pro spuštění
Effectopedia
• Vizuální znázornění AOPs v biologickém kontextu:
– Druh organismu, Životní stádium, Pohlaví, Trvání expozice, …
• Kvantitativní vztahy
• ADME (Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion)
• Otevřená platforma
• Není nutný formální souhlas pro přispěvatele
• Kredit pro autory i recenzenty/editory
• Možno vkládat i fragmenty informací, nejen celé AOPs
• Propojení s AOP Wiki & jinými (Export<->Import)
34
Human/ecological Relevance/
Cost/Complexity
Throughput/
Simplicity
High-Throughput Screening Assays
10s-100s/yr
10s-100s/day
1000s/day
10,000s-
100,000s/day
LTS HTSMTS uHTS
batch testing of chemicals for pharmacological/toxicological endpoints using
automated liquid handling, detectors, and data acquisition
Gene-expression
35
High Throughput Screening
96-, 384-, 1536 Well Plates
Assay Target Biology (e.g.,
Estrogen Receptor)
HTS Robotic Platform
Pathway
Chemical Exposure
Cell Population
HTS: High Throughput Screening
ToxCast = Toxicity Forecaster – Predikce toxicity
• 1192 rychlých, automatizovaných screeningových testů (in vitro)
• Vybudování statistických počítačových modelů k predikci
potenciální toxicity chemických látek
• Fáze 1: Screening více než 300 dobře charakterizovaných
chemických látek
• Fáze 2: dalších 700 chemických látek s širokým záběrem struktur
• Následují další fáze - v současné době údaje pro více než 9076
látek
• Dlouhodobý, nákladný projekt (multi miliony dolarů)
http://www.epa.gov/ncct/toxcast/
⇒ dostupnost dat - iCSS Dashboard
http://actor.epa.gov/dashboard/
http://www.epa.gov/ncct/toxcast/data.html
http://actor.epa.gov/dashboard/
Chemical Universe
>100,000
Chemicals with likely
exposure potentialMixtures
HTS Chemical
Library
Chemicals w/o HTS
or structural
similarity
Active chemicals and
structural neighbors
AOP / MOA Targeted
High-throughput testing
High, Medium, Low
priority bins
Inactive chemicals and
structural neighbors
Structural neighbors
to HTS library
Very Low
priority bin
Detailed Exposure and
Toxicokinetics Evaluation
Initial Exposure
Evaluation:
Use Categories
Prioritizace dle
míry rizika
Structure Similarity
Modeling
Histologie – nauka o tkáních, studium tkání
(z řečtiny: histos = tkáň, logos = nauka)
Využití:
• zkoumání (patologických) změn tkáně
• pomocí histochemických technik lze prokázat přítomnost látek v
buňkách a tkáních
V ekotoxikologii:
• drobnější organismy (bezobratlí) – často fixace a histologie celých
jedinců
• obratlovci, větší organismy – odběr a zpracování vybraných tkání
• odebrané vzorky/tkáně z exponovaných organismů vs. kontroly
• organismy či tkáně organismů z prostředí s různým stupněm a typem
znečištění/ stresorů
• histologie celých jedinců či výběr relevantních orgánů
(jater, gonád, plic, ústního ústrojí)
Tkáň
• soubor morfologicky podobných buněk, které plní určitou funkci
• buňky tvořící tkáň mohou být stejného typu, nebo existují tkáně tvořené
buňkami tvarově i funkčně rozdílnými
Typy tkání:
• epitelová (krycí)
• pojivová
* vazivo
* kost
* chrupavka
• svalová
* hladká
* příčně pruhovaná
• nervová
* neurony
* neuroglie
• tekutá
* krev
* míza
epitel
kolagenové
vazivo měkkýše
krev
Postup při přípravě preparátu
• Odběr tkáně/ vzorku
• Fixace - fixační činidla
• Zalévání
• Krájení
- tkáně prosycené parafínem
- zmrzlé tkáně
• Barvení
• Mikroskopická analýza
Odběr materiálu/tkáně
– Ze živého organismu (BIOPSIE)
– Z mrtvého organismu (NEKROPSIE)
– Nutná rychlá fixace tkáně, aby nedošlo k autolýze (rozklad vlivem vlastních enzymů a
působením bakterií) - uložení ve fyziologickém roztoku nebo v lednici autolýze
NEZABRÁNÍ
Postup:
– oddělení vzorku - velikost tkáňového bločku max. 1cm3 ( cca do velikosti 1 × 1 ×
0,5 cm pro světelnou mikroskopii )
– v případě potřeby oplach v fyziologickém roztoku
– FIXACE - ihned po odběru !!!
– pečlivé označení vzorku
MOŽNOSTI ZPRACOVÁNÍ
o fixace a zalití tkáně do parafinu nebo jiného média
o zpracování tkáně ve zmrzlém stavu: zmrazení tkáně a vakuové vysušení ve
zmrzlém stavu – pouze drobné kousky tkání
POSTUP PRO
ZALITÍ DO PARAFINU
• fixace tkáně
• odvodnění tkáně (alkohol)
• projasnění tkáně (xylen)
• prosycení tkáně parafinem
• zalití do parafinu
• krájení bloků a natažení na podložní sklo
fixace odvodnění projasnění
prosycení
parafinem
zpravidla
formol
alkohol ve
vzestupné
koncentraci
xylen parafin
Fixace
• zastaví metabolické děje v buňce jejich zpomalením nebo denaturací enzymů
• rychlá a šetrná - bránící autolýze tkání
• Fyzikální metody:
» Teplo (mikrovlnná trouba)
» Zmražení a vysušení za nízké teploty (tekutý dusík – 170 oC)
- při histologickém průkazu citlivých látek (např. enzymy)
• Chemické metody:
» Imerzní (ponoření do fixační tekutiny)
» Perfuzní (nástřik cév)
• Podmínky fixace
– rychlost - odběr, dobrý průnik fixačních prostředků do tkáně – do celého vzorku,
velikost vzorku (1cm2, 1mm2)
– co nejlepší zachování struktury
– zachování barvitelnosti tkáně
Fixační činidla - Fixační tekutiny - Chemická fixace
Formaldehyd 4% =
10% neutrální formol
40% roztok formaldehydu ve vodě
(nasycený roztok) = 100% formol
Bouinova tekutina
(žlutá)
trinitrofenol, formol, kys.octová
- proniká rychle, tkáň se po fixaci barví
Susa chlorid rtuťnatý, chlorid sodný,
kys.octová, kys.trichloroctová,
formol
Zenkerova tekutina
(oranžová)
chlorid rtuťnatý, dvojchroman
draselný, síran sodný, kys. octová
Carnoy ethanol, chloroform, kys.octová
Methacarn methanol, chloroform, kys.octová
DALŠÍ ZPRACOVÁNÍ TKÁNÍ
Podstatnou část hmotnosti a objemu tkáně tvoří voda – nemísitelná s parafinem – nutno
tkáň odvodnit a prosytit parafinem
1. odvodnění - alkohol ve vzestupné koncentraci
EtOH (60%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%)
Alkohol není rozpouštědlem pro parafin, je třeba ho z tkáně odstranit látkou, která
by byla schopna napomoci prosycení tkáně parafinem – xylen. Mezistupeň v
podobě odvodnění alkoholem není možné vynechat. Xylen je nemísitelný s vodou
a nemůže tedy sloužit k odvodnění.
2. projasnění = prosycení rozpouštědlem zalévacího
media (xylen, toluen, aceton)
– zpravidla postupně tři lázně xylenu
3. prosycení parafinem - tkáň prosytíme v rozpuštěném
parafinu - teplota do 58oC
odvodňovací automat
Zalévání do média
https://www.youtube.com/watch?v=h9cxu1UiH2U
https://www.youtube.com/watch?v=FaOWA-y9UKI
• zalití tkáně do zalévacích médií, které ji zpevní a vytvoří homogenní blok vhodný ke krájení pro
zhotovení dostatečně tenkých a kvalitních řezů pro studium
• tkáň prosycená parafínem se zalévá do forem rozpuštěným parafínem
• zalévání do jiných médií – celoidinu (nitrocelulózy), celoidin – parafinu
• zalévání do médií rozpustných ve vodě – želatiny, celodalu, vosků rozpustných ve vodě
• v elektronové mikroskopii - zalévání do epoxidových
nebo polyesterových pryskyřic
• tkáň je třeba vhodně orientovat, pečlivé značení vzorku
• zalévací automaty - parafín udržován v tekutém stavu
(ohřívací box a zalévací komůrky stálé teploty). Součástí
chladící deska - zajišťuje rychlé tuhnutí vzorku.
Krájení na mikrotomech
• Tkáň je třeba nakrájet na řezy o tloušťce
jedné vrstvy buněk, tedy 4−10µm
- tkáň průhledná a dobře studovatelná
• mikrotom = přístroj na řezání jemných vrstev preparátů pro mikroskop
• pro světelné mikroskopické studium bývají řezy tlusté 4 - 20 µm, pro elektronové
mikroskopy zpravidla 100 nm a tenčí
• tloušťka řezu se upravuje podle tkáně, která se krájí (např. podle její tvrdosti), běžně
se používá tloušťka okolo 5 µm
• sáňkový, rotační, diskový, ultramikrotom, laserový mikrotom, atd. (poslední dva
využití zejména pro elektronovou mikroskopii), zmrazovací mikrotomy – liší se
podle způsobu ovládání – pohyblivosti nože a dalších parametrů
• některé mikrotomy mohou být poloautomatické (elektronické řízení tloušťky,
automatické provedení určitého počtu řezů …)
KRÁJENÍ na mikrotomu
https://www.youtube.com/watch?v=KnMdSgd5mts
rotační
laserové
NATAHOVÁNÍ PREPARÁTŮ
• preparáty nakrájené na mikrotomech se umísťují na podložní skla k dalšímu
zpracování
• nakrájené řezy se dávají do teplé vodní lázně, kde se řez roztáhne a následně
se zanořením podložního skla a jeho vyzvednutím s preparátem na toto sklo
natáhne a přilne
• nebo se na podložní sklo umístěné na speciální zahřívací plotně kápne voda a
do ní se umístí preparát (z parafinového bloku ukrojená tkáň), který se
natáhne a po odpaření vody přilne na sklo
• použití speciálních podložních skel, aby na nich tkáně držely
Zpracování tkáně ve zmrzlém stavu
• používá se zpravidla u „čerstvých“ tkání, ale je možné zpracovávat i tkáně
fixované, záleží na typu tkáně
• krájení zmrazených tkání - zmrazovací mikrotom, kryostat = speciálně
upravený mikrotom pro práci v hlubokém mrazu při teplotě okolo
-15 až -22 ºC, tloušťka řezů obvykle 7 μm.
• tkáň se zmrazí a následně se zmražená krájí
• vyšetření zmražené tkáně - v případě potřeby rychlé diagnostiky, nebo když
je třeba tkáň zpracovat šetrně, aby nedošlo k porušení její struktury
(chemické stavby) použitím postupů a chemikálií, které se používají při zalití
do parafinu nebo jiných médií
• Průkaz enzymů
• Barvení a studium lipidů
• Imunohistochemie
Barvení
• Umožňuje rozlišení jednotlivých součástí buněk a tkání pro mikroskopickou
analýzu - u neobarveného preparátu nerozeznáme jednotlivé složky tkáně,
díky malé odlišnosti lomivosti světla
• Většina barviv je rozpustná ve vodě, proto je třeba z řezů odstranit parafin a
znovu je zavodnit, aby bylo možno tkáně barvit.
• Různé druhy barviv používáme podle toho, co potřebujeme obarvit.
Základní rozdělení:
• barviva zásaditá (barví jádra)/ kyselá (barví cytoplazmu)
• přirozená (př. hematoxylin, šafrán)/umělá (anilín).
• Barvící automaty - sestava lázní pro odparafinovaní, barvení, odvodnění a
projasňování preparátů. Koše se skly jsou přenášeny z jedné lázně do druhé
podle předem nastaveného času barvení a odkapávání. Čas barvení se
nastavuje do 12 minut a je stejný pro každou lázeň. Obarvení preparátu závisí
na typu reagencií a na počtu použitých identických lázní. Většina automatů několik
vzorků najednou podle různých barvících protokolů (zpracování až 600
skel za hodinu).
Hematoxylin - eosin
• Hematoxylin barví kyselé součásti buňky
(bazofilní struktury)
– DNA, RNA, tj. jádro, jadérko, ribozomy a
granulární endoplasmatické retikulum
- tmavá – modrá až černá barva
• Eosin barví zásadité struktury buňky (acidofilní, eosinofilní)
– hlavně proteiny, tj. cytoplasmu, mitochondrie, hladké endoplasmatické
retikulum a kolagen v mezibuněčné hmotě
- růžová až fialová barva
Hematoxylin – eosin
https://www.youtube.com/watch?v=0ZHGq6flt6Y
https://www.youtube.com/watch?v=2D0rj0m6dVs
Barvení parafínových řezů
• Odparafínování
• Zavodnění
• Barvení hematoxylinem
• Praní v tekoucí vodě
• Barvení eosinem
• Odvodnění
• Projasnění
• Montování
srdeční sval
ledviny
Výsledky barvicích metod
Barvení Barvivo Jádro Kolagen Svaly Poznámka
Hematoxylin-eosin Hematoxylin
Eosin
modré až
černé
růžový růžové
Weigert – van
Gieson
Weigertův
hematoxylin
Saturnová červeň
Trinitrofenol
hnědé červený žluté místo Saturnové červeni se
používá také kyselý
fuchsin, žluté -vše kromě
kolagenu
AZAN Azokarmín
Anilínová modř
Oranž G
červené modrý oranžově
červené
červené - erytrocyty
modrý - mucin
Modrý Massonův
trichrom
Hematoxylin
Kyselý fuchsin
Anilínová modř
modré až
černé
modrý červené červené - erytrocyty
modrý - mucin
Žlutý Massonův
trichrom
Hematoxylin
Erytrosin
Šafrán
modré až
černé
žlutý červené červené – erytrocyty
možno použít i kyselý fuchsin a
Tuchecht gelb
Zelený Massonův
trichrom
Hematoxylin
Kyselý fuchsin
Světlá zeleň
modré až
černé
zelená červené červené - erytrocyty
Impregnace Ag AgNO3 hnědý šedo-černé retikulární vlákna - černá
Heidenhainův
železitý
hematoxylin
HŽH
Heidenhainův
železitý
hematoxylin
hnědé až
černé
šedo-černé
AZAN
• Azokarmín barví jádra červeně
• Anilínová modř barví kolagenní vlákna modře
• Oranž G barví cytoplasmu buněk a svaly oranžově
• Erytrocyty jsou červené
Weigert – van Gieson
• Weigertův hematoxylin barví jádra šedě
• Saturnová červeň (nebo kyselý fuchsin) barví kolagenní vlákna
červeně
• Kyselina pikrová barví cytoplasmu buněk a svalovinu žlutě
Histochemie
- pomocí chemické reakce prokazuje ve vzorku přítomnost látek (např.
enzymatická aktivita) – selektivní barvení
- popisuje morfologii buněk, chemické látky v buňkách
prokazuje přítomnost např. polysacharidů, lipidů, enzymů
Imunohistochemie - aplikace imunologických metod při studiu tkání nebo buněk
technika barvení histologických preparátů, která umožňuje znázornit přítomnost
konkrétní látky pomocí specifických protilátek.
Imunochemické barvení:
1) navázání protilátek proti konkrétním strukturám
2) použití protilátky se značkou (např. s enzymem peroxidázou), které se váží na
protilátky z prvního kroku
3) inkubace se substrátem, který enzym přeměňuje na nerozpustný barevný produkt
pozorovatelný pod mikroskopem – detekce cílové struktury
• Imunohistochemické barvení – např. detekce estrogenových a
progesteronových receptorů
molekulární metody...ISH
ISH = in situ hybridizace
• použití značených sond, které se naváží (hybridizují) na
odpovídající (komplementární) úseky nukleových kyselin
• sondy značené barvivem (CISH) či fluorescenčním
barvivem (FISH)
Trvalý preparát
• Po obarvení se z tkáně znovu odstraní voda
• Trvalý preparát se připraví přilepením krycího skla pomocí
montovacího media – např. kanadského balzámu (má stejný lom
světla jako sklo) nebo umělých pryskyřic
Po zaschnutí vznikne TRVALÝ PREPARÁT
K některým barvícím přístrojům jsou připojeny rovnou i montovací
automaty, kdy jsou pomocí robotického systému přikládány krycí
sklíčka na obarvené preparáty.
Montovací médium = látka dokonale průhledná s vysokým indexem lomu:
Nemísitelné s vodou - rozpouštějí se v xylenu (př. kanadský balzám,
cedrový olej nebo syntetické pryskyřice) a je nutné preparáty
odvodnit a prosytit.
Mísitelné s vodou - př. glycerin, glycerinová želatina, sirup z arabské
gumy
Postup
Parafínové řezy Kryostatové řezy
Fixace Zmražení při – 170 oC
Vypírání
Odvodnění řadou alkoholů
Prosycení rozpouštědlem
Zalití do parafínu
Krájení Krájení v kryostatu
Nalepení řezů na podložní sklo Nalepení řezů na podložní sklo
Odparafínování a zavodnění Někdy krátká fixace
Převedení do vody
Barvení, histochemická reakce Zejména histochemické reakce
Odvodnění a projasnění Někdy odvodnění a projasnění
Montovací medium zpravidla
bezvodé
Bezvodé medium nebo glycerin -
želatina
Intersex - pohlavní orgány pakaprovce severního (Catostomus commersoni)
Vlevo a vpravo – vaječník a varle ryb z referenční lokality
Uprostřed – intersexová tkáň ryby odebrané pod výpustí ČOV 62
Ryby – histologie gonád
Obojživelníci – histologie gonád
vaječník
varlata
intersex
Mikroskopie
Světelná mikroskopie
• Objektiv – hlavní, tvoří obraz předmětu - skutečný zvětšený a převrácený
• Okulár – zvětšuje obraz 5-25x, koriguje optické vady čoček objektivu
předmět umísťujeme před předmětové ohnisko - paprsky (světla/elektronů)
vystupují od předmětu do čočky, lámou se a vytvářejí zvětšený obraz.
• Rozlišovací schopnost - nejmenší vzdálenost mezi dvěma body, při které
je ještě dovedeme rozlišit jako dva samostatné objekty
• Rozlišovací schopnost oka (0,2 mm)
• Světelná mikroskopie (0,2 μm) - zvětšení = objektiv x okulár (max. 1500-2000x)
Fluorescenční (luminiscenční) – látky po absorpci UV-záření vydávají barevné viditelné záření, přírodní
nebo po navázání fluorochromů
Elektronová mikroskopie (1-0,2 nm)
Vlnová délka příslušející urychlenému elektronu je
přibližně 0,005nm => rozlišovací schopnost 0,0025nm
Prakticky 350 000 – 500 000 x víc než oko
Špičkové přístroje až 800 000 – 1 000 000 x
Obraz buď pozorován přímo nebo projektován na:
• fluorescenční stínítko
• fotografickou desku
• prostřednictví kamery na monitor
Elektronový mikroskop
• místo světla (fotonů) tok elektronů ve vakuu, místo optických čoček elektromagnetické
• vlnové délky urychlených elektronů o mnoho řádů menší než fotonů viditelného světla -> mnohem vyšší
rozlišovací schopnost - mnohem vyšší zvětšení
• řezy krájené na ultramikrotomu
• studium cytologických detailů
Transmisní elektronový mikroskop (TEM)
– nepohyblivý elektronový svazek, detekce elektronů prošlých
vzorkem (TE) na fluorescenčním stínítku nebo detektorem
– elektrony přímo prostupují tenkým řezem (nm) a jsou
detekovány (vnitřní struktury, atomy)
• Zpracování tkáně
– Odběr (velikost vzorku max 1mm2)
– Fixace dvoustupňová
– Odvodnění (aceton)
– Prosycení (směs epox. pryskyřice s tužidlem)
– Vytvrzení a zalití (epoxidové pryskyřice, metakryláty)
– Krájení (ultramikrotomy – 30 – 60nm)
– Přenesení na nosné terčíky
– Kontrastování (uranyl acetát)
Rastrovací/scanovací elektronový mikroskop (SEM)
– povrch vzorku rastrován pohyblivým svazkem elektronů, zobrazení povrchu vzorku pomocí
sekundárních elektronů (SE), odražených elektronů (BE), případně signálu z jiných detektorů
– úzký svazek elektronů projíždí preparát, odražené elektrony na stínítku dávají plastický obraz
TEM
Pučení kvasinek
Bakterie E. coli
Světelný mikroskop
TEM SEM
SEM
Světelný mikroskop
oko Drosophily
TEM – golgiho aparát TEM - mitochondrie
SEM – krevní buňky SEM – pylová zrna
Transgenní organismy
• Transgenní modely jsou vyvinuty vložením jednotlivých nebo
více genů z jednoho druhu do DNA jiného druhu
• Organismy s novým genem v genomu (transgen)
• ve svém genomu obsahují nové geny, nebo geny pozměněné
metodami rekombinantní DNA
• Geneticky modifikované
Vektory
• molekuly DNA, které zajistí vstup příslušného genu do buňky
• Plazmidy
• Bakteriofágy
Transgenní organismy v ekotoxikologii
• zejména ryby a obojživelníci – jejich embrya
• geny jsou vpraveny do oplodněných vajíček pomocí
mikroinjekce DNA nebo elektroporace
• není potřeba implantovat embrya – vnější vývoj
• geneticky modifikované - biosensory znečištění prostředí –
fluorescence v reakci na určitý typ znečištění
• výzkum mechanismů působení polutantů
• Krok 1 – konstrukce transgenu
– 3 části:
• Promotor
• Gen, který má být exprimován
• Terminální sekvence
• Krok 2 – Vnesení cizího genu do organismu
– do oplodněných vajíček
– mikroinjekce DNA
– elektroporace
Transgenní organismus má záměrně introdukovaný gen
jiného druhu – vložen v procesu transgeneze
Vývoj transgenních organismů
• Ryby/obojživelníci mají velká a průhledná vajíčka,
která umožňují relativně snadný přenos genů.
• Většina rybích vajíček injektována do hodiny po oplodnění, protože
jsou vypuštěna ze samic (externí vývoj) a první dělení probíhá hodinu
po oplodnění
• Obtížné injekce do vajíček některých druhů (např. lososovitých ryb) –
mají tvrdý vnější obal (chorion)
• Externí vývoj – v akváriích s regulovanou teplotou
• Míra přežití (survival rates) rybích embryí po mikroinjekci (35%–80%)
je mnohem vyšší než u savců, s tím že 10%–70% ryb je transgenních
• Transgenní jedinci dále chováni – další generace, případně křížení s
netransfekovanými – vytvoření stabilních transgenních linií
Transgenní ryby
• Hodně využívané druhy:
medaka japonská (Oryzias latipes), dánio pruhované (Danio rerio)
• geneticky modifikovány pro využití jako biosenzory environmentálních polutantů
(např. estrogenů) s použitím promotoru indukovatelného estrogeny (promotor
vitellogeninu), který reguluje expresi genu GFP (zelený fluorescenční protein)
GFP Transgenní Medaka (Oryzias
latipes)
- s promotorem indukovatelným
cyp1a induktory
- citlivý sensor a biologický
indikátor přítomnosti TCDD a
dalších persistentních organických
látek
Transgenní bakterie/kvasinky běžně používány jako detektory
znečištění životního prostředí a toxického potenciálu
– reporterové geny pod kontrolou promotorů,
které reagují na přítomnost určitého typu látek
Detekce:
• Těžkých kovů
• Alkylfenolů, bisfenolu A
• Látek s aktivitou
dioxinového typu
• Genotoxických látek
• Endokrinních disruptorů