Makroskopické a mikroskopické pozorování mikroorganismů Dnešní práce uMakroskopické pozorování: uOdečítání morfologie bakteriálních kultur z minulého cvičení u u u •Mikroskopické pozorování: uGramovo barvení uPozorování preparátů u u http://www.medical-labs.net/wp-content/uploads/2015/03/Yeast-colonies-on-agar.jpg http://www.biologycorner.com/resources/microscope5.gif http://www.microbiologyinpictures.com/models%20of%20bacteria/Gram%20stain.jpg uMakroskopické pozorování u Odečítání morfologie bakteriálních kultur uPři povedeném křížovém roztěru jsou na misce viditelné jednotlivé kolonie uHodnotíme jejich : uTvar (kruhový, nepravidelný, vláknitý) uOkraje (hladké, zvlněné) uProfil (plochý, vypouklý, kráterovitý) uPovrch (lesklý, matný) uZbarvení u u u http://www.microbeworld.org/component/jlibrary/?view=article&task=download&id=8069 https://ibg102labreports.files.wordpress.com/2013/04/hand-prepare.jpg http://chsweb.lr.k12.nj.us/psidelsky/newclasstwo_files/image004.jpg http://openi.nlm.nih.gov/imgs/512/49/138795/138795_1471-2180-2-33-1.png https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/7b/Umbonate_clonies.jpg http://www.bacteriainphotos.com/photo%20gallery/colony%20morphology.jpg https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRuar6s9T_1THW8bDvrZI7XsMFz4x4LxebIqlGIcnQjZIa B3t7AjA Tekuté půdy uNelze prokázat čistotu dané kultury uHodnocení přítomnosti mikroorganismů : uBlanka uZákal uVločky uSediment uZbarvení u http://inst.bact.wisc.edu/inst/images/book_3/chapter_7/4/motility.jpg http://www.biomedcentral.com/content/figures/1471-2180-2-33-3.jpg http://faculty.lasierra.edu/~ssabet/primary_culture1.jpg •Mikroskopické pozorování u Mikroskopické pozorování MO uPodložní sklíčko uNativní preparát – nefixuje se uDiferenciační barvení buněk nebo jejich složek (většinou se fixuje) – vidíme spory, pouzdra, buněčnou stěnu, glykogen, škrob uDiagnostické barvení – pro identifikaci bakterií (Gramovo, acidorezistentní, dle Giemsy) uVitální barvení – rozliší živé a mrtvé buňky (obarví se mrtvé buňky) uNegativní barvení – nefixuje se, barví se okolí buněk, ne buňky uSklíčkové kultury – pro plísně a kvasinky, sklíčko se kultivuje v agaru pod 45 °, je porostlé kulturou u uFluorescenční mikroskopie u https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcR1W3x5hR2sbbcBziNez8pLMGh_vH8l_MfO5OVXE9sMiDy H5GoP https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/8f/Gram_stain_01.jpg http://imc02.hccs.edu/BiologyLabs/Micro/01MicrobialMorphologyStaining/01BacterialStaining/Bacterial StainingQuiz/Negative%20staining.jpg Gramovo barvení Negativní barvení Sklíčkové – pozorujeme tým plesne, kvasinky, aktinomycéty, sklíčko je zapichnuté v agare pod 45 stupnami, kultivuje sa spolu s kulturou, v mieste styku je mycelium vyrastené. Pozorujeme substrátové a vzdušné mycélium. Nat Nativní preparát, Fázový kontrast uNativní preparát = nedeformované živé buňky v nativním stavu bez barvení, možno pozorovat pohyb, růst a množení bakterií. uPrincip: Fázový kontrast využívá odlišné světlolomnosti částic, různých indexů lomu světla struktur uTransparentní, světlá část buňky = nízký index lomu = nízká denzita → tmavá část preparátu uTmavá, hustá část buňky = vyšší index lomu = vyšší denzita → světlá část preparátu, „halo“ efekt uObraz je vytvářen interferencí paprsků fázově posunutých i neposunutých http://old.vscht.cz/obsah/fakulty/fpbt/ostatni/miniatlas/images/kvasinky/mikro/yarro.jpg https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcR2D8lC7CqpV4cmTN22wxkdtDBbk20zXqn0F8P302CEGFx qkeGA4Q Nativní preparát Nativní preparát Fázový kontrast Nativní preparát uDobře očištěné podložní sklíčko vyjmeme z alkoholu a protáhneme jej plamenem uDoprostřed sklíčka naneseme kapku sterilní destilované vody uOžehnutou a vychladlou očkovací kličkou vneseme do kapky nepatrné množství kultury a pečlivě rozmícháme uKultury nesmíme nanést do kapky mnoho, aby preparát nebyl hustý uKapka se neroztírá, překrývá se krycím sklíčkem a to tak, aby v preparátu nebyly vzduchové bublinky (nepřikládáme svrchu na kapku, ale nejprve jednou hranou, nepřitlačujeme). uPřebytečnou kapalinu odsajeme filtračním papírem. uIhned mikroskopujeme (rychle vysychá) FÁZOVÝM KONTRASTEM u (objektiv 60x / 100x – celkové zvětšení tedy 600x nebo 1000x) u https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQkPGoMD2b07cSikH_PSglo-k5EPF-wNMj5VhhMkndWcYc WTlCKhw Barvené preparáty uMírně deformují buňku uBarvením zjistíme tvar buňky, typ buněčné stěny, uspořádaní shluků (barvení buněčné stěny), či je živá (vitální test), její struktury, přítomnost a uložení spor, inkluzí, pouzder (diferenciační barvení) nebo identifikujeme buňky (diagnostické barvení – Gramovo, acidorezistentní) uFixace – účelem je usmrcení buněk (ty lépe přijímají barvivo) a přilnutí buněk k podložnímu sklu uBakterie fixujeme plamenem, mikroskopické houby a kvasinky chemicky (etanol, aceton) uVyvarujeme se uvaření a spálení buněk, fixujeme až když je nátěr suchý. Sklíčko držíme nátěrem nahoru. uBarviva: krystalová violeť, methylenová modř, safranin, bazický fuchsin, malachitová zeleň u http://www.microbeworld.org/component/jlibrary/?view=article&task=download&id=7375 http://faculty.ccbcmd.edu/courses/bio141/lecguide/unit1/prostruct/images/Ctetani_spore01.jpg Sklíčko držíme za okraje, trikrát ho pretiahneme plamenom náterom nahore Buněčná stěna Soubor:Gram pozitivní.JPG Soubor:Gram negativní.JPG https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQMYTfcU5N_VRIfSHnjC3XW7egqWZuJpLEnjwKmmn9Q_r7 VLBEE Gramovo barvení uJedna z nejdůležitějších diagnostických metod při identifikaci bakterií uBarvíme buněčnou stěnu uRozlišuje G+ (modrofialové) a G – (červenorůžové) uPrincip: je to barvení fixovaného preparátu krystalovou violetí a následné moření buněk jódem v roztoku KI. Vzniká komplex barvivo-jód-buněčná stěna, který je u G+ i u G – bakterií. Rozdíl vzniká při promývání preparátu organickým rozpouštědlem (aceton/etanol). U G – se komplex vymývá a odbarvují se, u G + ne. Po přidání kontrastního barviva (safranin) se G – dobarví. uZávisí na fyziologickém stavu buňky a na složení média uGram-labilní bakterie G ± , někdy G+, někdy G – uChyby: moc silný nátěr, uvaření buněk, dlouhé odbarvování https://classconnection.s3.amazonaws.com/553/flashcards/661553/jpg/8a_gram_staining1328381688574.jp g Bakterie nebarvitelné Gramovým barvením urody bez buněčné stěny (mykoplazmata), spirálovité bakterie, dále o silně acidorezistentní rody (např. mykobakteria) u Borrelia burgdorferi Borrelia recurrentis Bartonella henselae Chlamydia trachomatis Chlamydophila pneumoniae Chlamydophila psittaci Coxiella burnetii Ehrlichia chaffeensis Anaplasma phagocytophilum Legionella sp. Leptospira sp. Mycobacterium tuberculosis (Mycobacterium avium Mycobacterium intracellulare Mycobacterium kansasii Mycobacterium leprae Mycobacterium marinum Rickettsia rickettsii Orientia tsutsugamushi Treponema pallidum Mycobacterium bovis http://phoenixrising.me/wp-content/uploads/Borrelia-spirochete-300x277.jpg http://www.scilogs.com/in_scientio_veritas/files/Mtb-CDC-small.jpg Fixace plamenem uProvádí se před barvením (kromě negativního barvení a vitálního testu) uSklíčko vytáhneme z etanolu a ožehneme nad plamenem uSklíčko popíšeme a kápneme na něj kapku sterilní vody uBuňky z Petriho misky – vyžíhanou kličku ochladíme o médium a nabereme z jednotlivé kolonie (1/4 kličky, stačí ťuknout) uBuňky z šikmého agaru – ožíháme hrdlo zkumavky, vyžíhanou a ochlazenou kličkou nabereme kulturu, ožehneme zkumavku a zavřeme uBuňky přeneseme do kapky vody, smícháme a rozetřeme po celém sklíčku uNecháme vodu uschnout a fixujeme: 3x přejdeme plamenem, nátěrem nahoru http://mmp.vfu.cz/opvk2014/foto_video/foto-prokaryota_imerze/13.jpg Gramovo barvení u(Suspenzi z kultury mikrobů rozetřeme na čisté podložní sklíčko, necháme dobře zaschnout a fixujeme plamenem) uPonoříme do roztoku krystalové violeti a necháme působit 30 sekund uBarvivo opláchneme slabým proudem vody (2s) uPreparát ponoříme do Lugolova roztoku na 30 sekund. uOpláchneme slabým proudem vody (2s) uPřekryjeme etanolem maximálně 15-20 sekund (18 s) uOpláchneme slabým proudem vody uBuňky dobarvíme safraninem 1 minutu uOsušíme mezi dvěma filtračními papíry a mikroskopujeme pod imerzním objektivem (zvětšení 1000x) u http://pad2.whstatic.com/images/thumb/c/c6/Gram-Stain-Step-9-Version-3.jpg/670px-Gram-Stain-Step-9- Version-3.jpg http://3.bp.blogspot.com/-5YIDyFo6WjU/T0KfBaOrSNI/AAAAAAAAAS8/Iw5mIfk8ecI/s1600/gram+stain.jpg http://3.bp.blogspot.com/-5YIDyFo6WjU/T0KfBaOrSNI/AAAAAAAAAS8/Iw5mIfk8ecI/s1600/gram+stain.jpg http://3.bp.blogspot.com/-5YIDyFo6WjU/T0KfBaOrSNI/AAAAAAAAAS8/Iw5mIfk8ecI/s1600/gram+stain.jpg http://3.bp.blogspot.com/-5YIDyFo6WjU/T0KfBaOrSNI/AAAAAAAAAS8/Iw5mIfk8ecI/s1600/gram+stain.jpg http://3.bp.blogspot.com/-5YIDyFo6WjU/T0KfBaOrSNI/AAAAAAAAAS8/Iw5mIfk8ecI/s1600/gram+stain.jpg http://3.bp.blogspot.com/-5YIDyFo6WjU/T0KfBaOrSNI/AAAAAAAAAS8/Iw5mIfk8ecI/s1600/gram+stain.jpg Krystalová violeť 30 s Opláchnout vodou Lugolov roztok 30 s http://3.bp.blogspot.com/-5YIDyFo6WjU/T0KfBaOrSNI/AAAAAAAAAS8/Iw5mIfk8ecI/s1600/gram+stain.jpg Opláchnout vodou Etanol 18 s http://3.bp.blogspot.com/-5YIDyFo6WjU/T0KfBaOrSNI/AAAAAAAAAS8/Iw5mIfk8ecI/s1600/gram+stain.jpg Opláchnout vodou http://3.bp.blogspot.com/-5YIDyFo6WjU/T0KfBaOrSNI/AAAAAAAAAS8/Iw5mIfk8ecI/s1600/gram+stain.jpg Safranin 1 min Opláchnout vodou http://pad2.whstatic.com/images/thumb/c/c6/Gram-Stain-Step-9-Version-3.jpg/670px-Gram-Stain-Step-9- Version-3.jpg http://pad2.whstatic.com/images/thumb/c/c6/Gram-Stain-Step-9-Version-3.jpg/670px-Gram-Stain-Step-9- Version-3.jpg http://pad2.whstatic.com/images/thumb/c/c6/Gram-Stain-Step-9-Version-3.jpg/670px-Gram-Stain-Step-9- Version-3.jpg Hodnocení uJsou bakterie G+ nebo G – ? uTvar buňky (kok, tyčka, spirálky…) uUspořádání, shluky buněk u (dvojičky, tetrády, hrozničky, řetízky …) u uG+ jsou modrofialové, G – jsou růžovo-červené u u u u u u http://session.masteringmicrobiology.com/problemAsset/1556517/1/B_pertussis_diplococci_01.jpg https://classconnection.s3.amazonaws.com/830/flashcards/2138830/png/screen_shot_2013-04-13_at_60353 _pm1365890659762.png http://www.sturgisvet.com/public_html/wp-content/uploads/2015/03/rods.jpg https://encrypted-tbn3.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQ6yP1tbODTBvMau7vJ2NIIhX5se3RQ0VtPnBDW0uxl0bh 5ksjr https://s3.amazonaws.com/classconnection/102/flashcards/7245102/jpg/mluteus03_scale-14BE5B6FBEA2E47 A664.jpg https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRbhmyu462iZbwTzRAkey1lIwqWtQuYwIHeQiBgGB_EER1 DKleigQ http://www.bacteriainphotos.com/bacteria%20under%20microscope/gram%20positive%20bacteria/staphyloco ccus%20aureus%20and%20ecoli.jpg http://biolabs.tmcc.edu/Micro%20Web/Typical%20Bacteria.jpg uNativní preparát – pohyb buněk uhttps://www.youtube.com/watch?v=4grQSLmWXQk uhttps://www.youtube.com/watch?v=kwQ-yXXL3Pw od 0:30