uPřímé – mikroskopické uPočítáme buňky ze vzorku v preparátu, bez kultivace uJe to rychlé, získáme počet a poměr živých a mrtvých buněk u u Vitální test, Ò počítací komůrky, Ò počítání buněk v kapce Ò na podložním skle, Ò počítání buněk ve Ò fixovaném barveném Ò preparátu uNepřímé – kultivační uKultivujeme část vzorku a zjistíme počet životaschopných buněk http://www.genetickabanka.cz/media/images/pictures/burkerova-komurka-2.jpg http://imc02.hccs.edu/BiologyLabs/Micro/02BacterialIsolation/Bacterial_isolation_Quiz/pour%20plate. jpg http://imc02.hccs.edu/BiologyLabs/Micro/02BacterialIsolation/Bacterial_isolation_Quiz/pour%20plate. jpg Napr porovnáme pomer neofarbených živých buniek a ofarbených mrtvých ´vitálny test Komorky – podložné sklíčko s různe velkými ploškami, stanovujeme počet buniek v pološkách Na podložnom skle můžu byř vyryté políčka Fix farbený preparát – nanesieme známy objem a počítame napr v 10 poliach, vynásobíme počtom polí celého preparátu uZjišťování počtu buněk slouží v experimentech jako standart při porovnávání výsledků uStanovíme počty narostlých kolonií – předpokládá se že 1 buňka vytvoří 1 kolonii uJednotka = CFU/ml uColony forming units uPočet životaschopných buněk v 1 ml média = počet buněk v 1ml schopných vytvořit kolonii uUrčuje živé, kultivovatelné bakterie, není to celkový počet uStanovení počtu buněk se provádí v daném objemu a přepočítává se na 1 ml původního vzorku uZákal – méně přesné - živé i mrtvé buňky uMédium – podle typu kultury É- Základní/selektivní/selektivně diagnostické u http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/analytical-chromatography/microbiology/micro_ 7.gif Není to celkový počet, můžu tam byt aj mrtvé uSrovnávání, opakovaní experimentů u uSledování přírůstku buněk uporovnáním počtu buněk v různých intervalech získáme obraz o fyziologickém stavu kultury, jejím prospívání či odumírání u uHodnocení podílu jednotlivých skupin bakterií v směsné kultuře u Lze porovnávat makroskopické znaky jednotlivých zástupců u Lze pracovat na selektivních nebo diagnostických médiích – tedy získáme jen vybrané skupiny mikroorganismů. É Např. rozbor vody – sledujeme a počítáme koliformní bakterie u https://solemnlyrian.files.wordpress.com/2014/06/tc2.jpg Selektivne diagnostické půdy – počítame len kolónie danej farby, ostatné nás nezaujímajú, alebo sú nejak inhibované ÒV pravidelných časových intervalech (po cca 20 – 40 minutách) se z kultivovaného média s kulturou odebírají vzorky a vysévají na misky. Grafickým vynesením logaritmu počtu živých buněk v závislosti na čase vzniká růstová křivka. (1) Lag fáze (2) Fáze zrychleného růstu – fáze fyziologického mládí (3) Log fáze – logaritmická – exponenciální (4) Fáze zpomaleného růstu (5) Fáze stacionární (6) Fáze odumírání ÒCíl – vytvoření ředící řady a vysetí daných ředění na misky ÒZískáme tak nezkreslené informace o počtu životaschopných mikroorganismů https://classconnection.s3.amazonaws.com/636/flashcards/1788636/jpg/serial_dilution2-142CE6B7F8D36A B28F1.jpg uPopsat sterilní zkumavky, od 10-1 po 10-6 uDo každé napipetovat 900 μl destilované vody uDobře promíchat kulturu, odebrat 100 μl a přenést do první zkumavky (10-1) uPromíchat čistou špičkou a přenést 100 μl do druhé zkumavky (10-2) uVždy čistou špičkou promíchat suspenzi a přenést 100 μl do další zkumavky (10-3, 10-4, 10-5, 10-6) u uPopsat misky na víčko uZe zkumavky s ředěním 10-4 nanést 100 μl na dvě/tři misky a rozhokejkovat (dlouho) uZe zkumavky s ředěním 10-5 nanést 100 μl na dvě/tři misky a rozhokejkovat (dlouho) uZe zkumavky s ředěním 10-6 nanést 100 μl na dvě/tři misky a rozhokejkovat (dlouho) uZ destilované vody odebrat 100 μl a rozhokejkovat po misce – kontrola sterility u uKultivujeme 2-3 dny při 30ºC u u ÒVybrat misky nejvhodnějšího ředění (kde vyrostlo 20 – 200 kolonií) a spočítat na každé misce počet kolonií. ÒVypočítat průměr ÒVynásobit ho kladnou hodnotou ředění (ředění 10-4 = průměr x 104) ÒVynásobit hodnotou 10 (chceme hodnotu pro celý mililitr, ale pipetovali jsme jen 0,1 ml, proto x 10) ÒZískáme CFU/ml Ò ÒPrůměrný počet buněk x hodnota ředění (kladný exponent) x 10 = CFU/ml ÒVýsledek uvést jak: CFU = číslo . 10x (CFU = 7,5 . 107)