Izolace vybraných skupin půdních mikroorganismů



Půda a mikroorganismy
uV 1g půdy je přítomno několik bilionů buněk mikroorganismů
uBěžná půdní mikroflora: bakterie Agrobacterium, Arthrobacter, Bacillus, Clostridium, Nocardia,
Pseudomonas, Serratia, Streptomyces, plísně Aspergillus, Fusarium, Mucor, Penicillium
uPatogeny a oportunní patogeny: (Actinomyces, Clostridium, Corynebacterium, Mycobacterium,
Nocardia, Pseudomonas…)
uPatogénní bakterie mohou být:
uPrimární patogen – patogenní pro rostliny/živočichy/člověka, v půdě přežívají déle. Např.
klostridia (Cl. tetani, Cl. botulinum, Cl. perfringens, Cl. septicum)
uSekundární patogen – do půdy se dostávají sekundárně z různých rezervoárů, přežívají v závislosti
na jejich odolnosti
http://www.turfmagazine.com/content/TF/2014/11/A11411_1_full.jpg

Najprv dat trepat, potom prezentacia, potom zbytok práce

Půda a mikroorganismy
uV přírodě se vytvářejí mikrobiální společenstva, normálně bývá v prostředí značný počet druhů v
průměrném množství
uV půdách určitého druhu převažuje určitá skupina bakterií – termofilové v kompostu, plísně v
kyselé půdě, anaeroby v zamokřené půdě
uMůžeme je prokázat:
ukultivačně podle jejich charakteristických metabolických aktivit: fixace dusíku, oxidace síry,
u redukce síranů, rozklad močoviny, rozklad celulózy…
uIn situ  detekcí (fluorescence, sondy…)
u
u

Bakterie podle počtu zástupců a živin
uAutochtonní bakterie
uJsou v půdě celoročně, ve vysokém,konstantním počtu
u a nezávisle na množství živin
uMají nízkou metabolickou aktivitu
uAgrobacterium, Streptomyces, Nocardia
u
uZymogenní (alochtonní) bakterie
uV půdě jen sezonně, v nižším počtu, závisle na zvýšené koncentraci živin
uMohutná metabolická aktivita
uZajišťují koloběh prvků
uNitrifikační, celulolytické a síru oxidujíci bakterie, myxobakterie, Bacillus, Flavobacterium,
Mycobacterium, Pseudomonas
http://www.nepadbiosafety.net/abne/wp-content/uploads/2010/10/agrobacterium.jpg
https://schultzappel.files.wordpress.com/2014/09/agrobacterium-tumefasciens-gall.jpg?w=225&h=300

Funkce MO v půdě
uDekompozice (humifikace, mineralizace) – organotrofy, Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens
uOxidace jedovatých dusitanů na dusičnany – nitrifikační bakterie
uOxidace sulfidů na sulfáty – Thiobacillus
uBioremediace, rozklad těžko odbouratelných látek
uFixace dusíku symbiotickými (Rhizobium) a volně žijícími (Agrobacterium, Azotobacter) bakteriemi
uProducenti sekundárních metabolitů – antibiotika, Streptomyces
uSuprese plísňových onemocnění rostlin (Bacillus megaterium, B. subtilis, P. fluorescens )
u
uZastoupení MO v půdě závisí od typu půdy, pH půdy,
u ročního období, dostupnosti živin, vody, kyslíku, minerálů,
u hloubky
u
http://www.green-support.com/img/image024.jpg

Izolace půdních MO
uIzolace a průkaz 3 skupin mikroorganismů:
uClostridium
uAzotobacter
uCelulolytické bakterie
u
uV půdě je komplex mikroorganismů – za selektivních podmínek kultivace získáme cílovou skupinu
uVyužití selektivních médií – pro bakterie fixující dusík bezdusíkaté médium
uVyužití charakteristických znaků – štěpení celulózy

Clostridium
uC. tetani, C. botulinum, C. perfringens, C. difficile
uG+ anaerobní tyčky
uBičíky po celé buňce - peritricha
uVýskyt běžně v prostředí (půda, kal, mořské sedimenty, rostlinné zbytky), gastrointestinální
trakt, klinický materiál
uSpory, toxiny (tetanospazmin, tetanolyzin, botulotoxin…)
uPrimární i oportunní patogeny
u10 – 65 ºC, některé druhy fixují plynný dusík
uSacharolytické, proteolytické, nebo aj aj
uV cvičení – ostatní vegetativní buňky usmrtíme pasterizací,
uspory pak vyklíčí v anaerobním prostředí v bujone pod parafinem
u
http://www.cdc.gov/pulsenet/images/c-botulinum-300px.jpg
http://images.fineartamerica.com/images-medium-large/7-clostridium-difficile-bacteria-tem-biomedica
l-imaging-unit-southampton-general-hospital.jpg
http://www.humanillnesses.com/original/images/hdc_0001_0003_0_img0264.jpg
http://infectionnet.org/wp-content/uploads/2014/01/Boxcars.jpg
C. tetani
C. botulinum
C. perfringens
C. difficile

Azotobacter
uA. chroococcum, A. vinelandii
uVýskyt v prostředí (voda, půda)
uG – aerobní ovoidní tyčka až kok
uBičíky peritricha
uTvoří pigment, sliz, cysty
uVýskyt v půdě a vodě
uNesymbiotická fixace dusíku
u – enzym nitrogenáza
uAshbyho agar – bez dusíku,  hodně živin
u25 – 30 ºC
http://inst.bact.wisc.edu/inst/images/book_3/chapter_11/11-12.jpg
https://microbewiki.kenyon.edu/images/thumb/5/5e/Zdrs0309.jpg/400px-Zdrs0309.jpg
cysty

Celulolytické bakterie
uRozkládají celulózu, která se v podobě různých rostlinných zbytků, splachů a odpadových materiálů
z průmyslu dostává do prostředí
uPřítomnost celulolytických bakterií je ukazovatelem úrodnosti půdy
uCytophaga, Sporocytophaga, Cellvibrio (intenzivně obdělávané půdy ), myxobakterie (středně
obdělávané půdy) mikroskopické houby (slabě obdělávané a kyselé půdy)
uCelulóza je v přírodě nejrozšířenější, ve vodě nerozpustný polysacharid. Je spolu s
hemicelulózami, pektiny, ligninem a tuky podstatnou součástí buněčných stěn rostlinných buněk
uMůže být štěpena:
uaerobně – zisk mnoho energie, mineralizace organických látek
uanaerobně (kvašení) – kyselina máselná, octová, etanol, CO2, H2O…
uCelulózu štěpí exoenzym celuláza na celobiózu a tu endoenzym celobiáza na  dvě podjednotky glukózy

Myxobakterie
uŘád Myxococcales
uPlodnice: slizovitá stopka, sporangioly, myxospory uProstředí s rozkládajícím se organickým
materiálem, kůra stromů, tlející dřevo, kompost…
http://www.zmbh.uni-heidelberg.de/Schairer/2.JPG
http://mikroby.blox.pl/resource/348myxococcusfruit.jpg
https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSbYxFbFsllzsCIx8siUUfOtEcxRSemrVcePhc19z99PfT
fbW5low http://www.myxo.uni-saarland.de/myxomeeting2010/myxo_pictures.jpg

Postup
uClostridium - anaerobní kultivace v bujonu převrstveném parafinem – zajistí anaerobní prostředí
u10 g půdy + 100 ml destilované vody, dá se třepat na 10 minut
uDvojitá filtrace přes filtrační papír do baňky
uPřelít do zkumavky a tu vložit na 15 minut do vodní lázně (75 – 80 ˚C, přežijí jen spory)
u1 ml napipetovat do MPB
uNa to  napipetovat 1 ml parafinu
u
uAzotobacter – izolace na selektivním bezdusíkatém Ashbyho agaru, eliminuje druhy vyžadující dusík
upopsat misku na dno, na médium nadrobit půdu, mírně pokropit střičkou, 72 h, 25 – 30 ˚C
u
uCelulolytické MO – izolace na čisté Petriho misce, popsat víčko misky, do misky nadrobit půdu,
trochu poutláčet, navlhčit střičkou, na to přiložit materiál z celulózy. Kultivujeme při pokojové
teplotě

Hodnocení
uClostridium: v přítomnosti klostridií vzniká sedlina, plyn a charakteristický zápach máselného
kvašení, je možné zkontrolovat pod mikroskopem. uAzotobacter:  slizovité kolonie kolem zrníček
hlíny, v prvních dnech bělavé, stářím hnědnou. Je poznatelný charakteristický zápach. V preparátu
lze pozorovat G- kokotyčky, často ve dvojicích, buňky jsou ohraničeny pouzdrem. Fázovým kontrastem
jdou vidět cysty. uCelulolytické bakterie: ne/pozorujeme rozklad a změnu zbarvení. Nejintenzivnější
rozklad by měl být u buničiny, méně u filtračního papíru a nejméně se rozkládá novinový papír.
u
u