Mgr. Jiřina Medalová, Ph.D. Mgr. Martina Lánová RNDr. Josef Večeřa, Ph.D. qRT-PCR Kryostat http://www.gene-quantification.de/chapter-3-pfaffl.pdf ng/ul A2660 A280 A260/A280 DMSO I 375,65 0,885 0,456 1,94 TCDD I 401,2 0,984 0,523 2,01 DMSO II 487,6 1,219 0,605 2,01 TCDD II 383,1 0,941 0,541 1,88 Izolace RNA – kvantifikace Nanodropem <1 =2 A260… RNA A280… DNA Zpětný přepis mRNA do cDNA •1. Změření koncentrace vyizolované RNA (Nanodrop) + kontrola kvality RNA • - absorbance A260 nesmí být vyšší než 1 (případně ředit a měřit znova) • - poměr absorbancí A260/280 musí být kolem 2 •2. Spočítat kolik ul RNA je 1 ug RNA, který vstupuje do RT •3. Doředit do 11,5 ul sterilní RNase-free MQ H2O 4.Přidat 1ul 0,5 ug/ul primeru poly(dT)18 … ??? WS 5.Mix – Centrifugace – annealing primerů 5 min/65°C – přenos na 4°C •6. Přidat 4 ul 5xcc pufru pro traskriptázu s 0.1 M DTT (zrušení disulfidových můstků) •7. Přidat 0,5 ul RiboLock RNázového inhibitoru (inhibice potencionálně přítomných RNáz) •8. Přidat 2 ul 10 uM směsi nukleotidů (PCR grade) … ??? WS 9.Přidat 1ul reverzní transkriptázy RevertAid (200 U) 10.Celkový objem je 20 ul •11. Inkubace 60 min/42 °C •12. Denaturace transkriptázy 10 min/70 °C • •Výsledkem získáme stejné množství molekul cDNA, jako bylo původních molekul mRNA •v celkové RNA • •Do qPCR vstupuje 1,5 ul z celkové cDNA • Real time PCR * LightCycler 480 (Roche) * Do reakce se přidává Sybr Green (fluoreskuje jen po interkalaci do nově vytvořené dvouřetězcové DNA) * Po každém cyklu se změří fluorescence vzorku * Čím vyšší fluorescence, tím více produktu vzniklo * Čím více molekul cDNA ve vstupu, tím dříve se začíná množit exponenciální řadou (dřívější cyklus – výstupní parametr Cp) * Do jamky se pipetuje: 1,5 ul cDNA z přepisu + * Master mix: •3 ul Sybr Green (2xcc LighCycler 480 SYBR green I master kit – obsahuje nukleotidy, polymerázu, SYBR green, MgCl2) •0,375 uM každého z primerů (SS 20 uM Vypočítej kolik ul potřebujeme) •1,7 ul MgCl2 (SS 25 mM, Vypočítej výslednou koncentraci) •Doředit do 18,5 ul sterilní RNase-free MQ H2O (celkový objem 20 ul) * http://www.youtube.com/watch?v=3H9oabhqDAc http://www.youtube.com/watch?v=HU6GUGvDLeg real-time_curve_web qRT-PCR * * Kvantifikace hladiny mRNA využívající reverzní transkripci a PCR * * Kvantifikace je umožněna použitím fluorescenčně značených molekul inkorporujících se do nových molekul DNA při PCR při každém cyklu * * Po každém cyklu je provedena detekce přírůstku (real time) * * Odpadá nutnost kvantifikace pomocí elektroforézy * Značení nových řetězců DNA Principle of PCR * Interkalace fluorochromů vázajících se jen do dvouřetězcové DNA (SybrGreen) * Značení nukleotidů pomocí 32P * * Použití fluorescenčně značených prób (TaqMan) qpcr-technology Typy qRT-PCR * One step qRT-PCR (BFU) • - kombinace syntézy prvního cDNA řetězce (reverzní transkripce) a PCR reakce ve stejné zkumavce • + zjednodušení reakčního postupu a snížení rizika kontaminace • + rychlejší zpracování velkého množství vzorků • + díky tomu, že se amplifikují všechny mRNA (cDNA) dosáhneme • vyšší senzitivity (stačí i 0.01 pg celkové RNA) • - možné použít jen „sequence-specific“ primery • - celá reakce je použita pro jedno PCR, nemožnost opakování • * Two step qRT-PCR (OFIŽ) • - nejprve se provádí reverzní transkripce z celkové RNA pomocí oligo dT primeru za vzniku cDNA (do reakce vstupuje 1 ug celkové RNA) • - PCR probíhá v nových zkumavkách (do reakce vstupuje 1,5 ul cDNA z přepisu) • + z jednoho přepisu je možné provést cca 25 PCR reakcí (různé primery) • + možnost optimalizovat PCR s použitím různých polymeráz, primerů atp. • + srovnání exprese různých genů na stejném vzorku • - vyšší riziko kontaminace • - více pipetovacích kroků Příklad výstupu result3 Získání hodnoty Ct: 1) fit pointy manuálně 2) pomocí 2. derivace automaticky threshold Ct Ct Dalším způsobem je určení maxima druhé derivace, kdy se Ct určuje jako bod, kde dochází k strmému stoupání amplifikační křivky vzorku. Tento bod odpovídá maximu druhé derivace křivky. Výhodou této metody je plná Automatizace a přesnější stanovení Ct individuálně pro každou křivku Ověření specificity reakce „melting curve“ … hledání bodu tání produktu jeden produkt = jeden bod tání = jeden peak Více info: https://theses.cz/id/go0fw3/Bakalarska_praceEliska_Ruzickova.pdf Vyhodnocení qRT-PCR Name Ct průměr HPRT DCt 2^-DCt F16 K3 31,84 31,43 31,635 36,39 -4,755 27,0021 F16 LY3 32,17 33,18 32,675 36,985 -4,31 19,8353 F16 K6 32,25 32,13 32,19 35,225 -3,035 8,1965 F16 LY6 31,83 31,84 31,835 34,97 -3,135 8,7847 F16 K9 31,16 31,01 31,085 36,34 -5,255 38,1867 Průměr - HPRT Počítání * Koncentrace bez přepočtu jednotek –SS 40 mM a a potřebujeme 100 ul WS: 20 uM –Trojčlenka: 20 uM…..100 ul – 40 mM…. x ul – x/100=0,02/40… 0,0005.100=x –Ředěním I: 40 mM…. 100 ul – 20 mM…. 50 ul – 20 uM……50 nl = 0,05 ul –Ředěním II: 40 mM/0,02 mM = 2000 x ředěné – 100/2000 –Vzorečkem: c1.V1=c2.V2 (pozor! Nutné stejné jednotky) – 40x=0,02.100 ul – * Koncentrace s přepočtem jednotek • SS: 40 mg/ml a potřebujeme 100 ul WS: 20 uM • Nutné znát Mr látky (např 80) • 1 M … 80 mg/ml • 0,5 M … 40 mg/ml • * Ředění buněk • Spočítáme si, že máme 0,35x10*6/ml = 0,7x10*6 b v 2 ml • A) chceme mít 1x10*6/1ml • zjistíme, kolik máme buněk celkem (0,7x10*6), Centrifugace a pak to doředíme 0,7 ml pufru • B) chceme odebrat 2x10*5 buněk = 0,2x10*6 buněk • 0,2/0,35=0,57 ml vezmeme z původní suspenze Srovnání exprese ABC transportérů u střevních linií www.odont.uio.no Výhody kryořezů: •Rychlá příprava vzorků, umožňující provést detekci proteinů i během operace •Zachování enzymatické aktivity i antigenicity •Zachycení látek, které se standardní technikou rozpustí (lipidy) •Zachování buněčné morfologie (není třeba chemické ani tepelné modifikace) •Může se provést na fixovaných i nefixovaných vzorcích tkání Nevýhoda: nižší kvalita preparátů Kryostat Příprava vzorků: Zalití do OCT (polyethylen glykol + polyvinyl alkohol) Zamražení tkáně v -80°C Krájení řezů v kryostatu (mikrotom v chladné komoře) -20 až -30°C Složení mrazící směsi: 44% - pentafluoroethane, 52% - trifluoroethane, 4% - tetrafluoroethane