doc. Mgr. Vítězslav Bryja, Ph.D. Buněčné systémy ve vývoji Klíčové molekulární komponenty vývoje Picture1.png Klíčové molekulární komponenty vývoje Co poskytuje buňce tyto informace? a) signály z okolního prostředí b) transkripční program v jádře jednotlivé signální dráhy modulují transkripci a strukturu chromatinu transkripce určuje citlivost buňky k vnějším signálům (např. regulací exprese receptorů či komponent přenosu signálu) Klíčové molekulární komponenty vývoje ruka Transkripční faktory Klíčové molekulární komponenty vývoje ruka TGF/BMP • TGF – transforming growth factor • BMP – bone morphogenetic protein • • patří do TGFb nadrodiny 1.TGFb1-3 2.BMPs – 20 různých ligandů 3.GDF (growth differentiation factor): 9 ligandů 4.activin/inhibin/nodal TGFb nadrodina má následující podrodiny: TGF/BMP Společným znakem je signalizace přes: - konzervativní rodinu Ser/Thr kinázových receptorů – jsou dvou typů a po vazbě ligandu dimerizují - cytoplazmatická signalizace přes tzv. SMAD proteiny Signální dráha BMP BMP_signaling_pathway Inhibitory BMP faktorů •noggin •chordin (Chd) •sklerostin chordin vs chordin vs Přímá fyzická interakce mezi chordinem a BMP je podstatou inhibičního působení chordinu jsou klíčové pro fyziologické funkce BMP Role BMP inhibitorů v Spemannově organizátoru BMP_chordin in Speman organizer Klíčová role BMP inhibitorů produkovaných notochordem při indukci nervové ploténky neurulation+notochord notochord (= chorda) produkuje faktory, které specifikují ektoderm a vedou ke tvorbě nervové ploténky (neural plate). Jde zejména o následující faktory: noggin, chordin a follistatin (inhibitory BMP a aktivinu). Samotná produkce těchto BMP inhibitorů specifikuje anteriorní (přední) nervovou trubici, v kombinaci s FGF specifikuje posteriorní (zadní) nervovou trubici. Klíčové molekulární komponenty vývoje Nodal Nodal a pravo-levá symetrie gastrulace u myši AVE – anterior visceral endooderm Nodal a pravo-levá symetrie Nodal a pravo-levá symetrie Nodal a pravo-levá symetrie Analýza pomocí hybridizace in situ ukazuje rozdílnou expresi genů určujících levou stranu Vytváření levopravé asymetrie těla - role cilií • asymetrická exprese genů jako lefty1, lefty2, nodal a pitx2 • nodální cilie (9+0, dynein → pohyblivé) během gastrulace vytváří svým rotačním pohybem tzv. nodální proud Vytváření levopravé asymetrie těla - role cilií cshperspect-SYM-a000802002 • narušená funkce cilií → vzniká až situs inversus (vnitřní orgány uspořádány obráceně podle střední osy těla) nebo situs ambiguus Yokoyama, 2004 Nodal a pravo-levá symetrie LR assymetry in GDF mutant Figure 2. Analysis of situs defects in Gdf1-/- mice. a, Gdf1 +/- and Gdf1 -/- newborn mice with stomachs (arrowheads) on the left and right sides, respectively. Ventral views of tissues from newborn Gdf1 +/- (b,d,f,h) and Gdf1 -/- (c,e,g,i) mice are shown. b,c, Reversal of the orientation of the abdominal organs in Gdf1 -/- mice. Note also the streak-like appearance of the spleen and the abnormally shaped medial lobe of the liver. H, heart; Lv, liver; St, stomach; Sp, spleen; AC, KIF3A/B knockout myši, iv mutanti (nodální proud není vytvářen → lefty exprimován bilaterálně) GDF8 (myostatin) post-7-57588-MyostatinDog2 bull myostatin man whippet Belgian blue Klíčové molekulární komponenty vývoje ruka Notch •Notch=zářez – podle prvního fenotypu octomilky se zářezy na křídlech (T.H. Morgan, 1919) notch Drosophila receptory Notch1-4 Notch ligandy – jsou vázány na buněčný povrch Notch Notch dráha - overview Notch scheme Notch a vznik asymetrie Notch celegans Asymmetric divisions segregating P granules into the founder cell of the C. elegans germ line. The micrographs in the upper row show the pattern of cell divisions, with cell nuclei stained blue with a DNA-specific fluorescent dye; below are the same cells stained with an antibody against P granules. These small granules (0.5–1 μm in diameter) are distributed randomly throughout the cytoplasm in the unfertilized egg (not shown). After fertilization, at each cell division up to the 16-cell stage, both they and the intracellular machinery that localizes them asymmetrically are segregated into a single daughter cell. (Courtesy of Susan Strome.) Model: První buněčná dělení na modelu háďátka (Caenorhabditis elegans) Notch a vznik asymetrie Notch ce schema notchsigfig1 Notch ce schema Notch a vznik asymetrie Notch a vznik asymetrie •legenda k obrázku: Asymmetric localization of polarity mediators and cell fate determinants in the early embryo. P granules: black discs; cytoplasmic POS-1, MEX-1, and cytoplasmic and nuclear PIE-1: blue; nuclear PAL-1: hatched; MEX-5 and MEX-3: peach; plasma membrane localized GLP-1: black; membrane localized APX-1: green; membrane localized MES-1: red. Although shown discreetly localized for simplicity, the cytoplasmic proteins are present at low levels in the opposite domain before division, and in the sister cell after division. In addition, MEX-5, MEX-3, MEX-1, POS-1 and PIE-1 are also present on P granules. (A) MEX-5, MEX -3, MEX-1, PIE-1, POS-1 and P granules are uniformly present in the cytoplasm just after fertilization, but become asymmetrically localized during the one-cell stage. (B) The anterior and posterior determinants are differentially segregated to AB and P1 as a result of the first asymmetric division. GLP-1 protein first appears in AB at the two-cell stage, and PIE-1 protein enters the nucleus in addition to being cytoplasmic. As the cell cycle proceeds (not shown), posterior determinants become restricted to the posterior half of P1, while MEX-5 appears in the anterior half of P1. (C) In the four-cell embryo, GLP-1 is expressed on membranes of both AB cells, but only ABp is in contact with the P2 cell expressing APX-1. MES-1 is enriched at the cell contact between P2 and EMS; MES-1/SRC-1 signaling in conjunction with Wnt signaling polarizes the EMS cell, such that it will divide asymmetrically. As the cell cycle proceeds, posterior determinants within P2 become asymmetrically localized as in previous P cells. MEX-5 disappears from the AB cells, but is still present in the anterior daughters of each P division. Notch a „segmentační“ hodiny Notch a „segmentační“ hodiny Notch Notch •legenda k obrázku: Klíčové molekulární komponenty vývoje ruka Receptorové tyrosin kinázy (RTK) RTKs - simplified scheme of action Hlavní skupiny RTKs: EGF (epidermal growth factor) receptor family Insulin receptor family PDGF (platelet-derived GF) receptor family FGF (fibroblast GF) receptor family – přednáška č. 3 VEGF (vascular endothelial GF) receptor family HGF (hepatocyte GF) receptor family Trk receptor family Eph receptor family RET receptor family • Schematická struktura jednotlivých receptorů RTK families transmembrán. doména tyrosin-kinázová doména extracelulární domény vážící ligand Obecné schéma aktivace RTKs (zde na příkladu EGFR) EGFR signalling 1.ligand se specificky váže na receptor 2.receptor dimerizuje 3.tyrosin-kinázové domény se navzájem fosforylují 4.autofosforylace vede k navázání (recruitment) adaptérových proteinů (zde Grb2) 5.v závislosti na receptoru se aktivují „downstream“ signální dráhy – zde např. Ras/Raf1/MEK/MAPK kinázová dráha, 6.která vede k regulaci transkripce 7. Vybrané ligand:RTK receptorové systémy a jejich modelové funkce ve vývoji •VEGF/VEGFR •ephrin/Eph •FGF/FGFR – viz přednáška č. 3 • Vascular endothelial growth factors (VEGF) a jejich receptory (VEGFR) vegf_rec_ligands VEGF/VEGFR ve vývoji •reguluje vznik a vývoj cévní soustavy •hypoxie (=nedostatek kyslíku) indukuje HIF (hypoxia-induced factor), který reguluje produkci VEGF. •VEGF je schopen regulovat vznik de novo cév v hypoxické části embrya •- podobný mechanismus se uplatňuje i při onkogenezi, kde VEGF podporuje prokrvení nádorů a tím podporuje jejich růst Hypoxie a HIF • • • • • •Hypoxie: snížený parciální tlak O2 ve tkáni x normoxie •HIF – Hypoxia-Inducible Factor: • –Heterodimerický TF aktivující geny obsahující v promotorové sekvenci HRE (Hypoxia response element), vlastní transkripce je iniciována pomocí koaktivátorů p300 a CBP (CREB-binding protein) –Prozatím je známo kolem 60 (100) genů regulovaných HIF, řada z nich reguluje odpověď na hypoxii (angiogeneze, proliferace, metabolismus glukózy, migrace, apoptóza, erytropoeza, metabolismus Fe) –Heterodimer sestává ze tří α podjednotek (HIF1α, 2α, 3α) a jedné podjednotky β (HIFβ=ARNT) –α podjednotky jsou při normoxii silně labilní, podjednoteka β je na koncentraci O2 nazávislá – – – – HIF při normoxii a hypoxii new-2 http://www.chem.ox.ac.uk/oc/cjschofield/images/new-2.png VHL (von Hippel-Lindau) - tumor supresorový gen Modelové vývojové změny spojené s hypoxií/HIF systémem •embryonální vývoj •angiogenese •růst chrupavek •krvetvorba – aktivace EPO genu • hypoxia reaction of cell Angiogenese •Angiogenese –tvorba nových krevních cév • •HIF se váže do oblasti promotoru a iniciuje transkripci receptoru VEGFR 2 i expresi VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor) –hlavní faktor angiogenese •v normálním vývoji ale i během nádorového růstu VEGF/VEGFR ve vývoji VEGF in angiogenesis Blood vessel formation and tumor angiogenesis. During development, VEGF induces differentiation and proliferation of endothelial cells from its progenitors (the hemangioblast and angioblast) to form a poorly differentiated primitive vascular plexus (vasculogenesis). Angiopoietin-1 (Ang-1) and other morphogens (e.g. Ephrins-Eph) induce remodeling of the vascular plexus into a hierarchically structured mature vascular system through endothelial cell sprouting, trimming differentiation and pericytes recruitment (angiogenesis). During tumor angiogenesis, angiopoietin-2 (Ang-2) destabilizes the vessel wall of mature vessels. Quiescent endothelial cells become sensitive to VEGF (or other angiogenic factors), proliferate and migrate to form new vessels. Bone marrow-derived endothelial cell progenitors are found in the peripheral blood and can recruit at sites of angiogenesis. Eph/ephrin komplex ephb4 •ephrin – jsou membránově vázané ligandy (podobně jako ligandy Notch dráhy) •ephriny A – na membráně upevněny pomocí tzv. GPI kotvy •ephriny B – transmembránové ligandy, které samy jsou schopny signálovat do buňky •Eph/ephrin systém je zapojen zejména do „navigace“ buněk (např. buněk cév) či jejich částí (např. navádění axonů v nervové soustavě), a do „contact-mediated cell sorting“ ve vyvíjejícím se embryu. Jde o obecný mechanismus regulující migraci buněk. Eph/ephrin komplex Jedinečná vlasnost ephrinů: reverse signalling – tj. nesignáluje jen receptor, ale i ligand Eph/ephrin komplex •legenda k obrázku: Eph/ephrin komplex Supporting Information Movie 2. Ephrin-B2 induces extremely rapid growth cone collapse and axon retraction in VT RGCs. Movie depicts VT growth cones treated with ephrin-B2. Frames were captured at 30-second intervals for 45 minutes, replayed at 15 frames per second. 0.5 μg/ml pre-clustered ephrin-B2 was added after 15 minutes (2 second interval in movie). Supporting Information Movie 4. Inhibiting Rho kinase strongly diminishes axon retraction but does not affect growth cone collapse. Movie depicts VT growth cones pre-treated the Rho kinase inhibitor Y-27632 for 1 hour, followed by treatment with ephrin-B2. Frames were captured at 30-second intervals for 45 minutes, replayed at 15 frames per second. 0.5 μg/ml pre-clustered ephrin-B2 was added after 15 minutes (2 second interval in movie). videa z Petros et al., Dev. Neurobiol. 2010 Klíčové molekulární komponenty vývoje ruka Hedgehog dráha •hedgehog (Hh) u octomilky – název „ježek“ podle fenotypu larvy •u savců jsou tři homology: • sonic hedgehod (Shh) •indian hedgehog (Ihh) •desert hedgehog (Dhh) hedgehog in Drosophila Sonicrun_2006 Sonic the Hedgehog Schéma Shh dráhy Sonic_hedgehog_pathway •legenda k obrázku: Sonic hedgehog (SHH) is translated as a ~45kDa precursor and undergoes autocatalytic processing to produce an ~20kDa N-terminal signaling domain (referred to as SHH-N) and a ~25kDa C-terminal domain with no known signaling role (1 on figure 5). During the cleavage, a cholesterol molecule is added to the carboxyl end of the N-terminal domain, which is involved in trafficking, secretion and receptor interaction of the ligand. When SHH reaches its target cell, it binds to the Patched-1 (PTCH1) receptor(3). In the absence of ligand, PTCH1 inhibits Smoothened (SMO), a downstream protein in the pathway(4). It has been suggested that SMO is regulated by a small molecule, the cellular localisation of which is controlled by PTCH. PTCH1 has a sterol sensing domain (SSD), which has been shown to be essential for suppression of Smo activity. A current theory of how PTCH regulates SMO is by removing oxysterols from SMO. PTCH acts like a sterol pump and remove oxysterols that have been created by 7-dehydrocholesterol reductase. Upon binding of a Hh protein or a mutation in the SSD of PTCH the pump is turned off allowing oxysterols to accumulate around SMO.This accumulation of sterols allows SMO to become active or stay on the membrane for a longer period of time. The binding of SHH relieves SMO inhibition, leading to activation of the GLI transcription factors(5): the activators Gli1 and Gli2 and the repressor Gli3. The sequence of molecular events that connect SMO to GLIs is poorly understood. Activated GLI accumulates in the nucleus(6) and controls the transcription of hedgehog target genes(7). Schéma Shh dráhy Shh Shh = jeden z nejlépe popsaných klasických morfogenů (tzv. model francouzské vlajky) – v závislosti na koncentraci morfogenu se spouští odlišné transkripční programy Limb_bud Shh Např. specifikace jednotlivých prstů končetiny Shh Např. specifikace jednotlivých prstů končetiny Shh Shh limb phenotypes Limb_bud Shh Shh Např. specifikace jednotlivých neuronálních typů ve vyvíjející se nervové trubici shh in neural tube notochord – zdroj Shh floor plate – nejspodnější část nervové trubice ventralizující faktory produkované notochordem Sonic hedgehog (Shh) Inhibitory BMP (noggin, chordin) BMP Wnts Dorsalizující faktory floor plate – nejspodnější část nervové trubice Elektroporace kuřecí nervové trubice umožnila poznat jakým způsobem buňky během vývoje získávájí a udržují svou identitu chick olig2_mnr2 chick signal_model Fig. A - A model for early spinal cord development. The neural tube which will form the spinal cord is patterned into specific domains by multiple external signals which include a ventralizing Sonic Hedgehog (Shh) signal from the notochord (N) and floor plate (F), a dorsalizing BMP signal from the roof plate (R), and retinoic acid (RA) signaling from the adjacent somites (S). Cross section of the spinal cord of an embryonic day three chicken embryo stained with fluorescent antibodies. Shown here in red is the motor neuron progenitor domain (pMN), one of many precise domains established by earlier signaling events. The pMN domain is here labelled through the use of antibodies specific for Olig2, a critical regulator of motor neuron formation. Developing motor neurons emerging from the pMN are shown labelled in green. Tom Jessell chicken electroporation no Přirozené inhibitory Shh dráhy veratrum_album cyclopia cyclopamin – teratogenní alkaloid z kýchavice (Veratrum californicum), poprvé identifikován jako látku způsobující cyklopii (= 1 oko) a holoprosencephalii u ovcí Expression of Sonic hedgehog (Shh) protein and the determination of the midline structure in mouse embryo. An SEM micrograph of the frontal view of a mouse embryo (fetal age 7.75 days). Shh protein is green. The dotted line in the micrograph shows the region: Shh antibody reveals Shh. The part that will become the brain (head fold) is followed by the perchordal plate. Shh (in green) that is expressed in the prechordal plate induces midline structure formation. Model mice with Holoprosencephaly due to a Sonic Hedgehog (Shh) deficiency. An SEM micrograph of ten-day old mouse embryos (front view of face). The mouse deficient in Shh gene (right) has no midline structure and only one region (eye position shown in green). Note, too, the lack of nostril separation due to no midline structure. The normal embryo (left), by contrast, has both the eyes and nostrils separated to between the two hemispheres. Hedgehog (Hh) dráha je vázána na primární cilie •Abnormální Hh/Wnt a s nimi spojená onemocnění jsou způsobena defekty ve tvorbě primárních cilií (infertilita, polydaktylie, polycystické ledviny, degenerace retiny). •Hh je přímo vázán na primární cílie. Primary cilia vs. motile (secondary) cilia •struktura 9+2 •pohyblivé •epitely tracheje, vejcovodů, ependym… • • •struktura 9+0 •nepohyblivé •téměř všechny buňky (www.primary–cilium.co.uk) •solitérní • fig006rsc 505px-Eukaryotic_cilium_diagram_en_svg PRIMÁRNÍ SEKUNDÁRNÍ Primární cilie - funkce •délka 2-10µm, průměr 0.25µm • •chemo- a osmosenzory •fotoreceptory •mechanoreceptory • •komunikace v extracelulární matrix • •nodal cilia –pohyblivá –blastocysta –pravolevá souměrnost – •model trandukce – receptory iontové kanály, efektorové proteiny, transkripční faktory Primary cilia (blue) emerging from the cells of a mouse embryo (green). Intraflagelární transport (IFT) •Poprvé popsali Kozminski et al. 1993 pomocí DIC mikroskopie •Za transport zodpovědný kinesin-II – transport k distálnímu „+“ konci a dynein zodpovědný za transport k „-“ konci. •Kif3A, Kif3B (podjednotky kinesinu) KO buňky netvoří cilie. •IFT je zodpovědný za regulaci signálních drah vázaných na primární cilie • Primární cilie a Hh signalizace Primární cilie a Hh signalizace •Je spojen s primárními ciliemi •Ligand se naváže na patch (Ptc) protein, což způsobí zrušení inhibičního efektu Ptc na protein smoothened (Smo), který transdukuje signál přes glioma transkripční faktory (Gli) do jádra, kde řídí expresi Hh genů. (Gli1, Gli2 a Gli3A jsou aktivátory a Gli3R je represor). Hlavním represorem je SuFu. •IFT hraje klíčovou úlohu ve funkci regulace Hh signální dráhy (spojuje Smo a Gli) • •Mutace Kif3A a Kif3B mají podobné fenotypy v důsledku ztráty cilie. •3 typy Hh – Sonic Hh (Shh), Indian Hh (Ihh) a Desert Hh (Dhh) Primární cilie a Hh signalizace: důkaz cilia and hedgehog tumors Wong et al., Nat. Med. 2009 Ker14-Cre: drives expression to the epidermis SmoM2 (cond): constitutively active Smoothened (activated by Cre) Kif3a Flox: following Cre leads to Kif3a deletion and primary cilia loss Basal cell carcinoma – způsobena aktivací Smoothened Primární cilie a Hh signalizace: důkaz cilia and hedgehog tumors control Shh active, cilia present Shh active, cilia absent Wong et al., Nat. Med. 2009 Ker14-Cre: drives expression to the epidermis SmoM2 (cond): constitutively active Smoothened (activated by Cre) Kif3a Flox: following Cre leads to Kif3a deletion and primary cilia loss Klíčové molekulární komponenty vývoje ruka