Téma P04: Diagnostika enterobakterií a bakteriálních původců gastrointestinálních infekcí Ke studiu: Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Campylobacter, Helicobacter (učebnice, WWW atd.) Z jarního semestru: Mikroskopie, kultivace, biochemická identifikace, antigenní analýza Tabulka pro hlavní výsledky úkolů 1 až 5 (k postupnému vyplnění): Kmen K L M N P Q R S Gramovo barvení – Úkol 1 Kulti- vace (KA a Endova půda) Úkol 2 Velikost KA Barva KA Jiné KA Velikost Endo Barva Endo Jiné Endo Hajnova půda Úkol 3a Oxidázový test Úkol 3b DÍLČÍ ZÁVĚR XLD agar Úkol 4a ENTEROtest 16 Úkol 4b Antigenní analýza Úkoly 5a a 5b KONEČNÝ ZÁVĚR Úkol 1: Mikroskopie podezřelých kmenů Na stole máte kmeny označené písmeny. Obarvěte je podle Grama a vepište výsledky do tabulky. Pozor, kmen N, jehož barvení je obtížnější, nebarvíte – je již pro vás obarven. Kmeny, které nejsou G– tyčinky, nebudou zkoumány v úkolech 3 až 5 (ale v Úkolu 2 pro srovnání s ostatními ano). Úkol 2: Kultivace na krevním agaru a Endově půdě Standardním způsobem popište kolonie všech kmenů na krevním agaru a Endově půdě. Pokud kmen na půdě neroste, políčko proškrtněte. Bakterie, které na žádné z obou půd nerostou a morfologicky se jeví jako zahnuté gramnegativní tyčinky, mohou být kampylobakter. Gramnegativní tyčinka, která na žádné půdě neroste, ale mikroskopicky není zahnutá, se bude probírat v příštím praktiku. Pro srovnání popište i kmen, který se morfologicky jevil jako grampozitivní kok. Misky z Úkolu 2 nepoužívejte pro jiné úkoly. Úkol 3: Skupinová diagnostika nejvýznamnějších na Endu rostoucích G– tyčinek a) Odečtení zkoušky na šikmém agaru podle Hajny Agar podle Hajny je kombinovaná diagnostická půda. V tomto úkolu nám však půjde zejména o odlišení biochemicky neaktivních, glukosu ani laktosu nefermentujících a sirovodík netvořících tyčinek – gramnegativních nefermentujících bakterií. Na Hajnově půdě jsou naočkovány všechny kmeny rostoucí na Endu. Prohlédněte výsledek. Tam, kde půda zůstala v celém rozsahu červená, jde o biochemicky neaktivní kmen – zřejmě tedy o gramnegativní nefermentující tyčinku. Tento kmen nebude testován v úkolech číslo 4 a 5. b) Oxidázový test Učitel demonstračně provede oxidázový test u všech G– bakterií rostoucích na Endu. Oxidázapozitivní jsou zástupci čeledi Vibrionaceae a některé gramnegativní nefermentující tyčinky; enterobakterie (s výjimkou plesiomonád) oxidázu pozitivní nemají. Po splnění úkolů 1 až 3 sepište DÍLČÍ ZÁVĚR. Které bakterie jsou enterobakterie? Další úkoly budou prováděny právě jen s enterobakteriemi. Úkol 4: Rodové a druhové určení enterobakterií kultivačními a biochemickými testy a) Kultivační průkaz enterobakterií na dalších půdách Už jste viděli výsledky kultivace na KA a Endu. Nyní si prohlédněte ještě misky s agarem XLD. Popište krátce kolonie enterobakterií na těchto půdách (vyplňte do tabulky). Na bočním stole ještě pro porovnání uvidíte výsledky na půdě MAL (půda velmi podobná půdě XLD, podobně jako některé další, například DC) a výsledky na půdě CIN (zde rostou yersinie v typických drobných růžových koloniích; pokud nic neroste, nejde o yersinie). Tyto výsledky se do tabulky nezaznamenávají. b) Biochemický průkaz enterobakterií Vyhodnoťte ENTEROtest 16, který byl inkubován od předchozího dne. Zkontrolujte, zda výsledky souhlasí i s jinými testy, které jste již provedli; např. tvorba H[2]S se projeví i na Hajnově půdě, salmonely mají bledé kolonie s černým středem na půdách XLD a MAL. U kmene, který se jeví býti salmonelou, napište jako výsledek pouze Salmonella sp. (popř. Salmonella enterica), jako procento pravděpodobnosti uveďte u tohoto kmene součet procent všech tří salmonel uvedených u příslušného kódu v knize, a index typičnosti vezměte podle prvního uvedeného taxonu v kódové knize. Název identifikované bakterie přepište také do tabulky před úkolem č. 1. Zkum. První řádek Druhý řádek ONPG 1H 1G 1F 1E 1D 1C 1B 1A 2H 2G 2F 2E 2D 2C 2B 2A Kmen: 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 Kód: Identifikace % pravd. T index ONPG 1H 1G 1F 1E 1D 1C 1B 1A 2H 2G 2F 2E 2D 2C 2B 2A Kmen: 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 Kód: Identifikace % pravd. T index ONPG 1H 1G 1F 1E 1D 1C 1B 1A 2H 2G 2F 2E 2D 2C 2B 2A Kmen: 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 Kód: Identifikace % pravd. T index ONPG 1H 1G 1F 1E 1D 1C 1B 1A 2H 2G 2F 2E 2D 2C 2B 2A Kmen: 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 Kód: Identifikace % pravd. T index Úkol 5: Antigenní analýza v diagnostice enterobakterií Antigenní analýzu budeme provádět pouze u těch bakteriálních kmenů, kde se provádí rutinně. Antigenní analýza je u enterobaktérií prováděna především ze dvou důvodů: (a) odlišení antigenních typů se zvýšenou virulencí – především u E. coli k odlišení EPEC, popř. STEC atd. (b) z epidemiologických důvodů, někdy v kombinaci s důvody sub (a) – Salmonella, Shigella, Yersinia atd. a) Vyloučení EPEC U kmene identifikovaného jako Escherichia coli, proveďte antigenní analýzu pomocí sklíčkové aglutinace se dvěma polyvalentními séry. Pokud budou obě aglutinace negativní, lze konstatovat, že kmen nepatří mezi EPEC (jako konečný závěr napište „E. coli, non-EPEC“) b) Určení serovaru salmonely U kmene určeného jako salmonela bychom provedli antigenní analýzu sklíčkovou aglutinací a zjistili, o který serovar se jedná. Studenti zubního směru tento test neprovádějí. Úkol 6: Testy citlivosti enterobaktérií na antibiotika Na stole naleznete difusní diskové testy citlivosti na antibiotika u kmenů, které jste určili jako Enterobacteriaceae. U salmonely test záměrně chybí (nejčastěji jde o střevní nález a antibiotiky se tudíž neléčí.) Sestava antibiotik je vhodná k léčbě infekcí močových cest (IMC). Interpretujte kmeny jako citlivé (C), intermediární (I) či rezistentní (R) k daným antibiotikům. Interpretace je v souladu s aktuálními doporučeními EUCAST#, u některých antibiotik tedy máte pouze možnost „citlivý“ či „rezistentní“, pro jiná i „intermediární“ (I). Kmen Antibio-tikum Citlivý pokud je Intermedi-ární pokud Rezis-tentní Æ zóny (mm) Interpre- tace Æ zóny (mm) Interpre- tace Æ zóny (mm) Interpre- tace Ampicilin AMP ≥ 14 mm < 14 mm Studenti Bi7170c z časových důvodů neprovádějí. Ze všech kmenů si vyberte jen jeden (libovolný). Nezapomeňte zapsat jeho písmeno! Cefazolin KZ ≥ 15 mm < 14 mm Ko-trimo-xazol SXT ≥ 16 mm 13–15 mm < 13 mm Nitrofuran-toin F ≥ 11 mm < 11 mm Tetracyklin* TE ≥ 15 mm 12–14 mm < 12 mm Cefuroxim CXM ≥ 18 mm < 18 mm Norfloxacin NOR ≥ 22 mm 19–21 mm < 19 mm *platí také pro doxycyklin Úkol 7: Diagnostika kampylobakterů Prohlédněte si kolonie bakterie, která nevyrostla na KA ani Endově půdě a kterou podle morfologie považujete za pravděpodobného kampylobaktera, na speciální půdě. Zapamatujte si čtyři základní podmínky kultivace kampylobakterů: (a) speciální půda s aktivním uhlím a s přípravkem antibiotik a antimykotik k odclonění jiných mikrobů, (b) mikroaerofilní atmosféra, (c) zvýšená teplota na 42 °C, což odpovídá tělesné teplotě ptáků coby přirozených hostitelů, a (d) prodloužení kultivace na 48 hodin. Popište kolonie a zapište výsledek oxidázového testu, který demonstračně provede učitel. Pro kampylobaktery je typická opožděná pozitivita, tj. proužek zmodrá, ale až po chvíli, nikoli okamžitě. Popis kolonií Výsledek oxidázového testu Další poznámky Úkol 8: Ureázový test v diagnostice helikobaktera V diagnostice helikobakterů se využívá mj. ureázový test, provedený přímo s bioptickým vzorkem žaludeční sliznice (nikoli tedy s kmenem – výjimka!). Bioptát se vloží do půdy obsahující ureu a indikátor. V pozitivním případě tekutina zčervená, v negativním případě zůstane žlutá. Ze dvou vzorků (označených X a Y) vyberte, který je pozitivní. Výsledek: Pozitivní je vzorek ____, negativní je vzorek ____. Úkol 10: Vliv různých faktorů na růst a přežití bakterií Úkol 10a) Vliv teploty na bakterie Z časových důvodů pokus neprovádíme prakticky. Smyslem úkolu je pochopit rozdíl mezi inhibicí bakteriálního růstu a usmrcením bakterií, což je významné i v klinické mikrobiologii. Zapište pouze závěr, plynoucí z tabulky. Teplota (°C) 20 30 40 50 60 První řada (kultivováno celou dobu pouze při dané teplotě) neroste roste roste neroste neroste Druhá řada (kultivováno pouze několik hodin při dané teplotě, pak přeneseno do optima) roste roste roste roste neroste Závěr. (Zapište to, co víte s jistotou. Pokud například dolní mez růstu leží mezi 20 a 30 °C, víme s jistotou, že nad 30 °C určitě roste.) Daná bakterie roste při teplotách od ____ do ____ °C. Teplota ____ °C ji usmrcuje. Úkol 10b) Vliv desinfekčního činidla na bakterie Prohlédněte si výsledek pokusu na bočním stole. Bakteriální kultury byly vystaveny různým koncentracím téhož desinfekčního činidla po stejnou dobu. Poté byly přeočkovány do kultivační půdy. Ta již samozřejmě žádný desinfekční prostředek neobsahovala. Do tabulky zapište ROSTE – NEROSTE (nebo R – N) Koncentrace 0,5 % 1 % 2 % 5 % Výsledek Závěr: Minimální baktericidní koncentrace daného desinfekčního činidla je ______________ Úkol 10c) Vliv času v kombinaci s teplotou Máme zde obdobné zkumavky jako v úkolu 1a, tentokrát však byly bujony vždy vystaveny extrémním teplotám jen na nějakou dobu a poté kultivovány při teplotě pro bakterie optimální. Lišil se však čas, po jaký byly bakterie daným teplotám vystaveny. Do tabulky zapište ROSTE – NEROSTE (nebo R – N) Teplota (°C) 160 180 Čas (min) 10 20 30 60 10 20 30 60 Výsledek Závěr: Bakterie byly usmrceny při teplotě _____ za _____ minut, při teplotě ______ za _____ minut. Je vám jasné, čím je dáno, že můžeme v úkolech 1b a 1c tvrdit, že bakterie byly usmrceny a nikoli jen inhibovány? Úkol 11 Praktický výběr vhodného desinfekčního činidla a způsobu jeho použití Ve zdravotnictví často užíváme desinfekční prostředky a sterilizační metody. Je přitom důležité znát jejich správné použití. Zatímco sterilizační metody ze své definice ničí všechny mikroby a jsou tedy vhodné zejména v případě potřeby absolutní sterility (například při operacích), metody desinfekční jsou určeny k ničení patogenních mikrobů (čímž není dotčena jejich schopnost zničit přitom i spoustu nepatogenních organismů). Na rozdíl od sterilizace se desinfekční metody liší zejména svou účinností na různé typy organismů: vegetativní formy bakterií a kvasinek / bakteriální endospory / viry / vláknité houby / Mycobacterium tuberculosis / atypická mykobakteria. (Důvodem, proč jsou mykobakteria vyňata z řad ostatních bakterií je jejich extrémní odolnost vůči některým typům desinfekce.) Kromě odolnosti vůči různým organismům ale existují i další praktická kriteria pro použití desinfekce a sterilizace. Je to zejména nutnost, aby příslušná metoda či prostředek nepoškozoval dekontaminovaný povrch či předmět (a proto se prostředek vhodný na desinfekci podlah zpravidla nehodí na desinfekcí rukou) a další. Více k tomuto tématu najdete ve studijních materiálech k dnešnímu tématu. Na bočním stole máte kartičky s příklady desinfekčních činidel a popisem jejich použití. Zkuste z nich všichni společně vytvořit dvojice . Nebude-li stačit kolektivní inteligence, pomůže vyučující. Zapište názvy metod a desinfekčních prostředků do tabulky. Na bočním stole také máte pro informaci další materiály, týkající se desinfekce a sterilizace ve zdravotnictví (důležité části příslušné vyhlášky, ukázky desinfekčních plánů pro zdravotnická zařízení apod.) sterilizace kovového předmětu, který nesnese vlhké teplo sterilizace textilu, který nesnese teploty nad 150 °C tovární sterilizace jednorázových rukavic sterilizace plastového nástroje, který nesnese teplotu nad 100 °C dekontaminace fibroskopu, který nesnese sterilizaci ve vyšší koncentraci i proti mykobakteriím fyzikální desinfekce (ne sterilizace) samotný jako desinfekce nedostatečný Úkol 12: Kontrola účinnosti desinfekce Úkol 12a) Kontrola účinnosti horkovzdušného sterilizátoru pomocí bioindikátorů V horkovzdušném sterilizátoru byly na osmi místech (v různých částech sterilizačního prostoru) umístěny bioindikátory (sporulující bakterie ve formě malých peciček). Poté byly vyňaty a kultivovány ve vhodném tekutém médiu za předepsaných podmínek. Zapište, zda bioindikátor v kultivační půdě roste nebo neroste. Pozor, také tento úkol je nachystán jen v jednom exempláři na bočním stole! Místo A B C D E F G H Růst Závěr: (Nehodící se škrtněte.) Horkovzdušný sterilizátor lze – nelze používat. Úkol 12b) Kontrola účinnosti desinfekce povrchů v nemocničním prostředí Odečtěte výsledky bujonové kultivace stěrů z prostředí. Zapište, která místa jsou sterilní a která nikoli. Místo (zapište) 1 2 3 4 5 Růst