J13
I Základy klinické mykologie |
VLLM0421C (jaro 2017)
Osnova
• obecné vlastnosti hub
• morfologie a fyziologie mikromycet
• způsob odběru a zpracování mykologických vzorku
• diagnostika mykóz
• příklady povrchových a systémových mykóz
Obecné vlastnosti hub
• e u kary ota (bakterie prokaryota)
• buněčná stěna obsahuje složité polysacharidy a
proteiny (jiné než bakteriální stěna), obvykle chitin, chitosan, mannany, glukany apod. (význam pro
• steroidní látky v plazmatické membráně (ergosterol, u člověka cholesterol), cíl antimykotik
• Gramovo barvení: „grampozitivní" (tzn. fialové)
• pomalejší buněčný cyklus -> zdlouhavější kultivace i infekce
• střídání pohlavního a nepohlavního rozmnožování
• antimykotika (antibiotika na ně obvykle nepůsobí) ,
Buněčná stěna hub
ergosterol
Atlas of fungal Infections. Richard Diamond Ed. 1999 Introduction to Medical Mycology. Merck and Co. 2001
slideplayer.com
Morfologie mikromycet
* blastokonidie
- ovální nebo kulatá buňka
- charakteristická pro kvasinky
* pseudohyfa
- protáhlý, vláknitý útvar připomínající hyfu, je však tvořen zřetězením jednotlivých buněk
* pseudomycelium = soubor pseudohyf
A O ä o u	% O Q 9 Q	C rt
	ppijion formoiion	otsu.edu
5/37
I Morfologie mikromycet (2)
• hyfa
- vlákno (může být větvené, s přepážkami apod.)
• mycelium = soubor hyf
- vegetativní (ukotvení houby do substrátu)
- generativní (vzdušné) - nese rozmnožovací struktury
		'    ř9 * JůY < JOJ —H
	SftfXot* hypHo*	S«(řlo«* hypho*
6/37
Rozmnožování mikromycet
* pohlavní a nepohlavní rozmnožování
* pohlavní rozmnožovací elementy: spory
- askospory (váček se sudým počtem pohlavních buněk)
- oospory (vznik splynutím velké samicí buňky a malé samčí buňky)
- zygospory (splynutím dvou stejně velkých pohlavních buněk opačného pohlaví
- spájení hyf (zvláštní typ, přiložení samčího a samičího vlákna -> vznik můstku -> výměna genů)
7/37
I Rozmnožování mikromycet (2)
• askospory v asku (výtrusy ve vřecku) smrže a Saccharomyces cerevisiae
Rozmnožování mikromycet (3)
I Rozmnožování mikromycet (4)
• zygospora Rhizopus sp.
Rozmnožování mikromycet (5)
9 nepohlavní rozmnožování převládá
9 nepohlavní rozmnožovací elementy: konidie
- arthrokonidie - oddělování koncových částí hyf
- blastokonidie - oválné či kulaté buňky na koncích pseudohyf
- chlamydokonidie - silnostěnné útvary kdekoli v průběhu či na konci hyf nebo pseudohyf
- mikroskonidie - oválná, kulovitá či hruškovitá tělíska rozmístěná jednotlivě nebo ve svazečcích kdekoliv v průběhu hyf
- sporangiokonidie = konidie v pouzdře
- makrokonidie = konidie v pouzdře s přepážkami
I Rozmnožování mikromycet (6)
* nepohlavní rozmnožovací elementy
Aip*rtlUvi takfflí** Ů+*M<]WFP Trichophytam
12/37
| Fyziologie mikromycet
• pomalejší buněčný cyklus -> zdlouhavější kultivace i infekce
• rostou snadno i na chudých půdách
• kultivace při nižší teplotě (zpravidla 30 °C) nebo souběžná kultivace při 22 °C a 37 °C (dimorfní houby)
• Sabouradův agar (s 2 - 4 % glukózy, přídavkem ATB pro potlačení růstu bakterií - nejčastěji chloamfenikol nebo amikacin+vankomycin)
• pestrá biochemická aktivita:
- auxanogram (asimilace různých látek)
- zymogram (štěpení cukrů)
• antigenní struktury pro přímou diagnostiku 13/37
I Odběr a zpracování materiálu
• krev, hnis, punktáty, sputum, výtěry (systémové mykózy)
• šupiny kůže, nehtů, vlasty, chlupy (povrchové mykózy)
- doporučena povrchová dezinfekce
- odběr z okraje ložiska (větší životaschopnost původce)
- vlasy a chlupy zasílat i s kořenovými váčky
- z nehtů posílat seškraby nikoliv celé nehty
- nedoporučuje se vkládat do transportních médií (vysoké nároky dermatofytů na kyslík)
- kandidy transportní půdy (FungiQuick, C.A.T.)
Diagnostika mykóz
* největší význam má mikroskopie
- rychlé výsledky, odlišení mykóz od bakteriálních infekcí
- preparáty nativní (projasnění louhem - KOH)
- preparáty barvené
• inkoust Parker (barví buněčné stěny mikromicet tmavě modře až černě
• barvení dle Grama nebo Giemsy
• barvení Ryluxem (fluorescenční barvení, buněčné stěny září žlutozeleně)
15/37
Diagnostika mykóz (2)
• kultivace:
- při nižší teplotě (zpravidla 30 °C) nebo souběžná kultivace při 22 °C a 37 °C (dimorfní houby)
- Sabouradův agar (s 2 - 4 % glukózy, přídavkem ATB pro potlačení růstu bakterií - nejčastěji chloamfenikol nebo amikacin+vankomycin)
- dlouhá doba růstu -> kultivace v uzavřených zkumavkách (kvůli vyschnutí)
- krátká doba růstu -> kultivace na misce (kandidy), možné využití chromogenních půd
• přímý průkaz antigénu (mannany)
• nepřímý průkaz protilátek (aspergily)
16/37
I Třídění mikromycet dle morfologie
• kvašinkovité mikromycety:
- blastokonidie (někdy pseudohyfy, chlamydokonidie)
- Candida sp., Cryptococcus neoformans, Malassezia furfur, Rhodotorula rubra, Saccharomyces cerevisiae, Pneumocystis ji rovec i, ...
• dimorfní mikromycety:
- za nižní teploty (do 30 °C) rostou ve vláknité formě, při 35-37 °C kvasinkovitá forma
- Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitis, ...
• vláknité mikromycety: Aspergillus sp., Penicilium sp., Rhizopus sp., Mucor sp., Epidermophyton sp., ...
17/37
Chorobné stavy vyvolávané mikromycetami
• mykózy
- pravá infekční onemocnění, nej rozšířenější
- povrchové či superficiální (kůže a její adnexa a sliznice)
• dermatofytózy, pityriasis versicolor, kožní kandidózy...
- hluboké či viscerální (orgánové či systémové)
• aspergilóza, kandidóza, kryptokokóza, ...
• mykotoxikózy (toxické metabolity)
• mykoalergózy (přecitlivělost na houby, metabolity)
• mycetismy (dráždění mechanicky -> útlakem tkání)
Povrchové mykózy
• mikromycety se množí jen v keratinových vrstvách kůže a jejích adnex
• dermatofyta nejvýznamnější (rody Trichophyton, Epidermophyton a Microsporum)
• tinea = infekce kůže dermatofyty
- názvy podle lokalizace (tinea capitis, tinea corporis, tinea pedis)
• diagnostika: seškraby -> mikroskopie, kultivace
• léčba: zpravidla lokální (krémy, roztoky);
u onychomykóz případně velkých kožních ložisek léčba po dobu několika týdnů až měsíců
19/37
Candida albicans
• nejběžnější z klinicky významných kvasinek
• saprofyté na kůži, v dutině ústní, ve vagíně či ve střevě člověka (střevo jako rezervoár opakující se infekce!)
9 postihuje především kůži a sliznice, hluboké infekce u oslabených (cystitida, pyelonefritida, meningitida, ...)
• kandidy se uplatňují jako patogeny:
- u novorozenců a nedonosených dětí
- za hormonálních změn (těhotenství, diabetes mellitus)
- déle trvající ATB léčba (porušení přirozené mikroflóry)
- oslabení odolnosti (imunosuprese, terminálni stádia)
- posušení bariér (chirurgie, kanyly, katetry) 20/37
Candida albicans (2)
• n ej častější projevy:
- soor (moučnivka) - bílý povlak na jazyku nebo sliznici tváří a patra; děti do dvou let
- vulvovaginitis candidosa- zarudlá sliznice, otok vulvy, silné svědění, bělavé povlaky a výtok; infekce z konečníku
ricardoruizdeadana.blogspot.com
Ostatní kandidy
• C. tropicalis (infekce střev, koplitidy, respirační infekce)
• C. parapsilosis (paronychia, endokarditidy, ...)
• C. glabrata (urogenitální infekce)
• C. krusei (imunokompromitovaní, hematologické malignity)
• C. dubliniensis, C. lipolytica, C. kefy r, C. lusitaniae, ...
22/37
I Ostatní kvasinkovité organismy
• Cryptococcus neoformans (ptačí výkaly;
u oslabených Pneumonie, meningitidy a sepse)
• Pneumocystis jiroveci (pneumocystová Pneumonie u nedonosených dětí a imunokompromitovaných)
• rod Saccharomyces (poševní my kozy)
23/37
Rod Aspergillus
• rychle rostoucí mikromycety
• septované hyfy zakončené konidiofory s výběžky (fialidy) nesoucí řetízky konidií
• systémové mykózy (endokarditidy, plieni aspergilóza, abscesy, ...)
9 povrchové mykózy
(onychomykózy, otomykózy, ...)
• alergie, mykotoxiny (aflatoxin)
• A. fumigatus, A. niger, A. flavus,
24/37
Zygomycety
• saprofyté, závažné systémové mykózy
• rychlý růst ve stěnách velkých
cév -> vytvoření „živého" trombu -> embólie -> smrt
• rhinocerebrální (z nosní dutiny do mozku už za několik hodin) a pulmonární zygomykózy, infekce těžkých popálenin,
sporangium
rody Mucor, Rhizopus, Absidia, ...
spores
R hizopus stoíonifer
suggest-keywords.com
25/37
Úkol 1: Mikroskopie kmenů bakterií a kvasinek
• obarvěte předložené kmeny Gramovým barvením
(krystalová violeť -> Lugolův roztok -> alkohol -> oplach vodou -> safranin)
• použijte imerzní mikroskopii (tj. objektiv lOOx)
• všimněte si rozdílů ve velikosti, tvaru a barvě
26/37
Úkol 2: Kultivace bakterií a kvasinek
• popište kolonie daných kmenů na krevním agaru
• zhodnoťte růst na Sabouraudově agaru s chloramfenikolem
• zhodnoťte růst na chromogenní půdě:
- chromogenní půdy pro kvasinky umožňují rozlišení nejdůležitějších druhů rodu Candida
- pomocí kontrolních kmenů se pokuste určit druh kandidy pomocí chromogenní půdy
- jsou-li kolonie bílé (není tedy přítomno žádné barvivo), znamená to, že kmen touto chromogenní půdou nelze určit
27/37
Úkol 2: Kultivace bakterií a kvasinek (2)
* chromogenní půda:
- bezbarvý chromogen (substrát + chromofor)
- při odštěpení substrátu z chromogenu dojde ke specifickému zbarvení podle druhu mikroorganismu
- na půdě, kterou máme k dispozici:
• C. albicans zelenavá
• C. tropicalis modrá
• C. g la brata hladká růžová
• C. krusei drsná růžová
- pokud se druh nepodaří určit (bílé zbarvení) použijeme jiné metody
• fluorogenní půdy (fluorescenční barviva) 28/37
Úkol 2: Kultivace bakterií a kvasinek (3)
Úkol 3: Identifikace zbylého kmene kvasinky
• odečtěte výsledek auxacoloru u kmene, který se nepodařilo identifikovat chromogenní půdou a porovnejte výsledek s identifikací pomocí MALDI
• kromě testů POX a ACT je žlutá pozitivní, modrá negativní
• test ACT je žlutá pozitivní, bezbarvá negativní
9 testu POX je hnědá pozitivní, bezbarvá negativní
• „V" = variabilní - může vyjít „+yy i
• nepočítá se kód, výsledek se porovnává s tabulkou
• pokud vyjde více taxonů:
- C albicans by byla v úkolu 2c zelená
- Rhodotorula by v úkolu 2b měla červený pigment 30/37
Úkol 4: Určení citlivosti na antimikrobiální látky
• určete citlivosti na antimykotika a antibiotika
• mikromycety se kultivují na MH agaru s methylenovou modří
• v prvním kroku se rutinně vyšetřuje citlivost pouze na flukonazol
• v případě rezistence se testuje citlivost na další antimykotika
31/37
I Úkol 5: Mikroskopie plísní
nativní preparát, zvětšeni objektivu 4x az 40x (bez imerze!)
zakreslete a popište předložené druhy mikromycet
Aspergillus fumigatus
R hizopUS Stofonifer s u g g e st - keywo rds.com
stopka
konidiofor
danasoigc.top
32/37
Úkol 6: Kultivace plísní
• popište vzhled výsledků kultivace vláknitých mikromycet (oproti kvasinkám značně odlišný), jak na Sabouraudově agaru, případně i na krevním agaru
• zakreslete tři kmeny (kultury na Sabouraudově agaru ve zkumavkách)
• některé z mikromycet (zejména dermatofyty), rostou velmi pomalu -> Sabouraudův agar nalévá do zkumavek (kvůli vyschnutí)
• biochemické rozlišení se u nich, na rozdíl od kvasinek, zpravidla neuplatňuje
33/37
Úkol 7: Nepřímá diagnostika aspergilózy
• zakreslete výsledek a označte pozitivní a negativní pacienty
• mikroprecipitace v agaru dle Ouchterlonyho
• do důlku uprostřed je nalita tekutina obsahující antigén
• Ag difunduje agarem, obsahuje-li sérum Ab, difundují proti němu a na jejich styku vznikne precipitační^ linie
34/37
Úkol 8: Přímá detekce mananu
v diagnostice systémové kandidózy
9 testování pomocí reakce ELISA
* umožňuje stanovit hladinu mananu v pg/mL
• pro vyhodnocení výsledku sestavujeme kalibrační křivku
- vyznačíme hodnoty absorbance kalibrátorů, spojíme je liniemi
- zaneste hodnoty pozitivní a negativní kontroly a vzorky pacientů
- odečtěte množství mananu v séru a interpretujte
35/37
Úkol 9: Odběr na mykózy
• prohlédněte si video „Odběr materiálu na povrchové mykózy" a zapište hlavní zásady odběru u kožních my koz:
- nezasílat pouze stěr, nýbrž šupiny z ložiska (stěr by mohl stačit u kandidóz)
- provést povrchovou desinfekci
- povrchovou vrstvu neposílat, nýbrž vyhodit a poslat až další vrstvu
- u plošných ložisek odebírat z okraje (zde je mikromyceta aktivní)
36/37
I Po tomto cvičení byste měli umět:
• rozeznat od sebe bakterie a mikromycety (jak kvasinkové formy, tak vláknité)
• popsat zpracování mykologických vzorků mykologickou laboratoří
• popsat jaké metody jsou využívány pro diagnostiku mikromycet
• popsat hlavní zástupce způsobující povrchové i hluboké mykózy
37/37